X-MET: un tessuto muscolare ingegnerizzato in vitro Misura delle

Misure Meccaniche & Termiche II - MBIR (A. A. 2011-2012)
Prof. Z. Del Prete
X-MET: un tessuto muscolare
ingegnerizzato in vitro
Misura delle proprietà biomeccaniche
Dispensa a cura dell’ ing. S. Carosio PhD [email protected]
Dipartimento di Scienze anatomiche, istologiche, medico-legali e dell'apparato locomotore
Via Scarpa 16 – 00161 Roma
T. 06 49766.607
Ingegneria tissutale
L’ingegneria tessutale è un campo interdisciplinare che applica i principi dell’ingegneria e delle scienze
della vita al fine di sviluppare sostituti biologici che ripristinino, mantengano o migliorino le funzioni
tessutali.
Langer, R & Vacanti JP, Tissue engineering. Science 260, 920-6; 1993
X-MET: eX-vivo Muscle Engineered Tissue
1. Dissezione
digestione enzimatica e isolamento cellule staminali
2. Arricchimento della frazione staminale
Coltura primaria
3. Piastraggio delle cellule su substrato selezionato
Realizzazione dell’X-MET
A
Monostrato cellulare
B
Delaminazione del
monostrato
D
C
Ancoraggio
X-MET
Contrazione sincrona e ritmica
Necessità di una caratterizzazione biomeccanica
Misura delle caratteristiche funzionali dell’X-MET
Caratterizzazione biomeccanica
Misura della forza di contrazione: utilizzo di
un trasduttore di forza piezoresistivo
Misure di deformazione in seguito a
contrazione: utilizzo di una tecnica non a
contatto: Digital Image Correlation (D.I.C.)
Misura della forza di contrazione
Contrazione isometrica e isotonica
Trasduttore di forza
Elettrodi di platino
X-MET
[0;500]μN
Confronto tra trasduttore di forza per muscolo murino ex-vivo e
microtrasduttore per l’X-MET
Attuatore/trasduttore ASI 300B
Muscolo ex-vivo
F (range) : 0 ÷ 0.5 N
sensibilità : 0.3 mN
Trasduttore SensorOne AE801
X-MET
F (range) : 0 ÷ 500 μN
sensibilità : 1 μN
Trasduttore di forza - schema e collegamenti elettrici:
Circuito elettrico di completamento del ponte:
Segnale dal sensore di forza
Componente integrato 1B31:
necessario per il completamento del ponte
Segnale in uscita da inviare al calcolatore
Taratura del trasduttore di forza
600
-1000
• 8 pesi compresi tra
mV
400
50.03µN (5.1mg) e
200
982.96µN (100.2mg)
-500
500
-200
-400
1000
N
• maggiore addensamento
all’interno del range 0 500µN
-600
1mV = X µN
Risposta dell’X-MET alla stimolazione elettrica
Singolo twitch
Stimolazione isometrica : riassunto
sommazione
tetano
Prove preliminari
determinazione larghezza dell’impulso singolo e sua intensità di corrente
Larghezza dell’impulso: 1 ms
Intensità di corrente: 400 mA
durata della stimolazione al variare della frequenza degli impulsi
Fase di stimolazione: 1.2 s
Fase di rilassamento: 1 s
Dalle prove preliminari alla scelta del protocollo di stimolazione completo
Ritardo
Durata
iniziale
stimolazione
stimolazione
(s)
Frequenza
segnale
(Hz)
Larghezza
Corrente
impulso
(mA)
(ms)
(s)
20
Singolo twitch
1
1
400
90
Singolo twitch
1
1
400
90
1.2
30
1
400
180
1.2
10
1
400
180
1.2
60
1
400
180
1.2
50
1
400
180
1.2
40
1
400
180
1.2
20
1
400
400
180
1.2
70
1
400
350
Costruzione della curva
forza-frequenza:
esempio reale
Forza (μN)
300
250
200
150
100
50
0
0
20
40
Freq (Hz)
60
80
Parametri di interesse
• Forza di twitch (Ftw)
• Time to peak (TTP)
• Half relaxation time (½RT)
• Forza di tetano (F)
• Forza specifica (Fspec)
Fspec 
F
Cross sectional area(CSA) del costrutto biologico:
CSA    rm2
F
CSA
Valutazione delle caratteristiche funzionali dell’X-MET
Caratterizzazione biomeccanica
Misura della forza di contrazione: utilizzo di un trasduttore
di forza piezoresistivo
Misure di deformazione in seguito a contrazione: utilizzo
della tecnica non a contatto: Digital Image Correlation (D.I.C.)
Digital Image Correlation (D.I.C)
La D.I.C. è una metodica che permette di effettuare misure di
deformazione senza contatto attraverso l’elaborazione digitale
di immagini video acquisite a velocità opportuna …
Schema di un sistema di acquisizione delle immagini per analisi
D.I.C. in 2 dimensioni
I componenti principali di un tipico sistema ottico digitale sono :
• una telecamera (preferibilmente del tipo CCD, charged coupled device);
• un frame grabber, cioè una scheda di acquisizione delle immagini;
• un’unità di elaborazione (computer).
Requisiti della superficie da analizzare: lo speckle
Affinché sia possibile effettuarne una correlazione è necessario che la superficie inquadrata sia
dotata di speckel; tramite la D.I.C. le immagini sono analizzate per misurare grandezze quali lo
spostamento e la deformazione.
Lo speckle è una distribuzione casuale, ben contrastata e distribuita, di piccole macchioline, con
toni di grigio ad elevato contrasto. Lo speckle, qualora non presente naturalmente sulla
superficie del provino, può essere realizzato con vernici spray, laser o polveri di silicio, a
seconda del tipo di applicazione.
Immagine speckle
Grazie allo speckle è possibile associare ad ogni punto della superficie uno specifico valore di
intensità luminosa (livello di toni di grigio) diverso da quello dei punti adiacenti. Tramite il
confronto tra la variazione di intensità luminosa dello stesso punto in immagini diverse si valuta
la deformazione che avviene sul costrutto biologico.
Tramite la telecamera (che deve essere posizionata lungo la perpendicolare alla superficie da
analizzare) si effettua una conversione analogico/digitale (eseguita dai sensori della telecamera)
passando così da una rappresentazione continua a punti dell’immagine originaria ad una discreta a
pixel. A questo punto è possibile effettuare il confronto tra pixel adiacenti.
La distribuzione casuale di macchioline sulla superficie permette la realizzazione di un’immagine
speckle attraverso la quale è possibile definire la funzione f(X,Y)=g
Attraverso la marcatura speckle possiamo ottenere una corrispondenza c biunivoca tra il punto
materiale p(x,y) e quello dell’immagine P(X,Y) mentre tramite la funzione f(X,Y) siamo in grado di
associare il livello di grigio g al punto dell’immagine e quindi a p(x,y):
c
f ( X ,Y )
p( x, y) 

P( X , Y ) 
 g
dove c ed f(X,Y) sono funzioni discrete dello spazio.
Frequenza di contrazione dell’X-MET → frequenza di acquisizione
delle immagini
Per il teorema di Nyquist:
fc > 2 fs
Nel nostro caso la frequenza di contrazione massima dell’X-MET è:
fX-METmax = 70 Hz
Abbiamo quindi la necessità di utilizzare una telecamera ad alta
velocità (320 fps = frame per second) per potere acquisire
correttamente le immagini della contrazione.
Digital Image Correlation (D.I.C)
Riassumendo, il metodo DIC esegue un confronto dei livelli di grigio di una regione divisa in gruppi
di pixel e soggetta a deformazione, confrontando un sottoinsieme preso come riferimento,
appartenente all’immagine indeformata Imi, con lo stesso sottoinsieme relativo all’immagine
deformata Imd.
Per studiare un fenomeno durante un intervallo di tempo stabilito, questo tipo di analisi può essere
esteso ad una serie di immagini consecutive.
Nel nostro caso per ogni stimolazione, acquisendo ad una frequenza di 320 Hz e, per esempio, per
un periodo pari a circa 1.5 s, si effettuano confronti tra circa 480 immagini; ogni immagine della
sequenza è correlata con la precedente.
Il metodo di correlazione numerica delle immagini consente quindi di eseguire misure accurate,
senza alcun contatto ed a distanza; è dotato di elevata versatilità e robustezza, permette di
eseguire la misura sull’intero campo di deformazione e su sotto-regioni selezionate (Region Of
Interest = ROI).
Analisi della deformazione dell’X-MET
Tramite l’algoritmo sviluppato in ambiente C++ è possibile:
• Selezionare la ROI d’interesse
• Analizzare lo spostamento dei nodi
Catena di misura
• elettrostimolatore
• elettrodi di platino
• telecamera alta velocità
• trasduttore di forza (1µN)
• pc
trigger
ES
impulsi
TTL
Programma di comando ed
acquisizione realizato ad hoc
in LabView 8.2 …
PC
forza
trigger
immagini
X-MET
TC
Pannello di controllo del programma in LabVIEW
Risultati sperimentali di deformazione – analisi globale
• Deformazioni medie per singolo
twitch: ε*x=1.1% e ε*y=0.41%
• Deformazioni medie 70 Hz:
ε*x=6.26% e ε*y=2.34%
Risultati sperimentali di deformazione – analisi locale
• Deformazioni medie per singolo
twitch: ε*x=3.47% e ε*y=4.51%
• Deformazioni medie 70 Hz:
ε*x=12.3% e ε*y=8.89%
Esercitazione in laboratorio:
In laboratorio verrà effettuata una stimolazione isometrica dell’XMET secondo le modalità seguenti:
single pulse
stimolazione a frequenza di sommazione
stimolazione a frequenza di tetano
Parallelamente, in modo sincrono alla misura della forza, si
acquisiranno le immagini necessarie per la misura della
deformazione (tramite D.I.C.).
1. Verranno forniti 3 set di dati pre-elaborati necessari per il
calcolo della deformazione assiale e longitudinale dell’X-MET,
i relativi andamenti della forza acquisita e il programma in
LabView necessario per l’elaborazione.
2. Inoltre andranno analizzati gli andamenti della forza generata,
da filtrare in modo opportuno, da cui calcolare la Fmax