Case report - Blood Transfusion

Case report
Hereditary elliptocytosis in a periodic blood donor
Cristina Vercellati1, Mariagabriella Mariani1, Noemi Greppi2, Alberto Zanella1
1
2
Divisione di Ematologia,
Centro Trasfusionale e di Immunologia dei Trapianti,
IRCCS Ospedale Maggiore, Milano, Italia
Key words: hereditary elliptocytosis, blood donor,
cryopreservation
Parole chiave: ellissocitosi ereditaria, donatori di
sangue, criopreservazione
Hereditary elliptocytosis (HE) is one of the most
common congenital defects of the red cell membrane.
The prevalence of this condition, calculated to be
about 3-5 cases per 10,000 people1,2, is probably
underestimated considering that the milder forms are
asymptomatic. Peripheral blood smears from patients
with this condition, usually transmitted in an autosomal
dominant manner, are characterised by numerous
elongated red blood cells (elliptocytes, ovalocytes,
rod-shaped red cells) and, in the most severe cases,
by extreme poikilocytosis with fragmentation
phenomena similar to those seen when the blood has
been exposed to heat (pyropoikilocytosis)3,4.
The primary defect is an abnormality of the
proteins responsible for horizontal cytoskeletal
interactions (in particular spectrin) or those of the
junction complex (4.1, glycophorins), which reduces
the compactness of the cytoskeleton and weakens
it5. This causes the normal protein bonds to break
as the red cell is stretched in the circulation because
of the high shear forces; new bonds are formed which
give the cell its elongated shape.
In about half the cases the molecular lesions
underlying this abnormality are mutations, predominantly
Received: 20 February 2003 - Accepted: 14 March 2003
Dott.ssa Cristina Vercellati
Divisione di Ematologia
IRCCS Ospedale Maggiore
Via Francesco Sforza 35
20122 Milano
Italy
70
L'ellissocitosi ereditaria (EE) è uno dei più
comuni difetti congeniti della membrana del globulo
rosso. La sua prevalenza, calcolata intorno a 35:10.0001,2, è verosimilmente sottostimata potendo
le forme più lievi essere asintomatiche.
La malattia, a trasmissione prevalentemente
autosomica dominante, è caratterizzata dalla
presenza nello striscio di sangue periferico di
numerosi eritrociti a forma allungata (ellissociti,
ovalociti, emazie a bastoncello) e, nei casi più gravi,
da estrema poichilocitosi con fenomeni di
frammentazione delle emazie simili a quelli
osservabili dopo esposizione al calore
(piropoichilocitosi)3,4.
Il difetto primario risiede in anormalità a carico
delle proteine responsabili delle interazioni
citoscheletriche orizzontali (in particolare la spettrina)
o di quelle del complesso giunzionale (4.1,
glicoforine), con conseguente riduzione della
compattezza del citoscheletro e suo indebolimento5.
Ciò determina la rottura, durante lo stiramento
dell'eritrocita in circolo per via dell'elevata forza di
scorrimento, delle normali interconnessioni proteiche
e la formazione di nuovi legami che ne stabilizzano
la forma allungata.
La lesione molecolare alla base di tale anormalità
consiste in circa la metà dei casi in mutazioni
prevalentemente puntiformi del gene dell' α- spettrina
che compromettono più spesso il primo dei cinque
domini della proteina (Sp α I), sede del sito di
interazione dimero-dimero, e più raramente domini
più lontani6-9. Le mutazioni a carico della β- spettrina
sono meno frequenti10.
Alla eterogeneità molecolare fa riscontro un'ampia
variabilità del quadro clinico, dall'anemia emolitica
Blood Transf 2003; 1: 70-6
Elliptocytosis in a blood donor
punctiform, of the α-spectrin gene. These mutations
most often involve the first of the five domains of
the protein (Sp α I), site of the dimer-dimer
interaction, and more rarely more distant domains6-9.
Mutations of β-spectrin are less common10.
The molecular heterogeneity is reflected by the wide
variability of the clinical manifestations, which range from
severe transfusion-dependent haemolytic anaemia to
asymptomatic forms with completely compensated or
even absent haemolysis (benign or non-haemolytic HE)11.
About 75% of subjects affected by HE are
asymptomatic and are not anaemic12,13. If these individuals
offer to donate blood they can be considered suitable
donors on the basis of the commonly used selection
parameters14. Nevertheless, there is currently no
information on the behaviour of blood units donated by
subjects with HE, whether stored in a liquid state or
cryopreserved. Furthermore, there are no data on the
safety and efficacy of transfusing such units.
We describe the case of a periodic blood donor
incidentally discovered to have asymptomatic HE.
We report the haematological, biochemical and
functional characteristics of her donated,
cryopreserved red cell concentrates.
Case report. During microscopic reading of pretransfusion compatibility tests, one of the units examined
was noted to contain numerous unusually shaped red
cells. The donor was identified as a 37-year old woman
(ML), group O negative, who originated from the north
of Italy and had already donated six times at the
Transfusion Centre in our hospital. The donor's clinical
history and clinical examination were negative (in
particular, she had not suffered from neonatal jaundice,
gallstones or splenomegaly) and the haematological
parameters normal. The woman underwent more
extensive examinations, including an analysis of the main
red cell membrane proteins and, in particular, spectrin.
At the same time a more thorough family history revealed
a history of gallstones in the donor's mother and a
cholecystectomy in the donor's sister.
Haematological assay. The full blood profile
was evaluated using an automatic analyser: the
Sysmex NE-8000 (Toa Medical Electronics Co,
Kobe, Japan). Routine blood tests were carried out
according to the method of Lewis et al.15 and the
acidified glycerol lysis test according to Zanella et
al.16. The levels of ATP and 2,3-DPG were assayed
using Beutler's method17. The partial pressure of
oxygen at which 50% of the haemoglobin is
saturated (P50) was measured using the method
described by Guarnone et al.18.
Blood Transf 2003; 1: 70-6
grave trasfusione-dipendente sino a forme
asintomatiche con emolisi completamente
compensata od assente (EE benigna o non
emolitica)11.
Circa il 75% degli individui affetti da EE sono
asintomatici e non anemici12,13.
Questi soggetti, se candidati alla donazione di
sangue, possono essere ritenuti idonei in base ai
comuni parametri di selezione14. Non si hanno tuttavia
ad oggi informazioni sul comportamento di unità di
sangue donate da soggetti con EE durante la
conservazione allo stato liquido o congelato né sugli
effetti della loro infusione in termini di sicurezza ed
efficacia.
Viene qui descritto il caso di una donatrice
periodica casualmente identificata come portatrice
di EE asintomatica e vengono riportate le
caratteristiche ematologiche, biochimiche e funzionali
delle sue emazie concentrate criopreservate.
Descrizione del caso. In occasione della lettura
microscopica dei test di compatibilità pretrasfusionale,
in una delle unità esaminate veniva segnalata la presenza
di numerosi eritrociti di forma insolita. Il
corrispondente donatore era una donna di 37 anni
(ML) di gruppo O negativo, originaria del nord Italia,
che aveva già donato sei volte presso il Centro
Trasfusionale del nostro Ospedale.
La storia clinica personale e l'esame obiettivo erano
negativi (in particolare non ittero neonatale, colelitiasi
e splenomegalia), ed i parametri ematologici normali.
La donatrice è stata sottoposta ad indagini più
estese, inclusa l'analisi delle principali proteine
della membrana eritrocitaria e più in particolare
della spettrina. In tale occasione, un
approfondimento anamnestico evidenziava
positività per colelitiasi nella madre ed in una
sorella, colecistectomizzata.
Esami ematologici. L'esame emocromocitometrico
è stato eseguito mediante analizzatore automatico
Sysmex NE-8000 (Toa Medical Electronics Co, Kobe,
Giappone). Gli esami ematologici di routine sono stati
eseguiti secondo Lewis e coll.15 ed il test di lisi in glicerolo
acidificato secondo Zanella e coll.16.
I livelli di ATP e di 2,3-DPG sono stati determinati
seguendo il metodo di Beutler17. La pressione parziale
dell'ossigeno a cui l'emoglobina è saturata al 50%
(P50) è stata misurata secondo il metodo di
Guarnone e coll.18.
Analisi delle proteine della membrana
eritrocitaria. Le membrane eritrocitarie sono state
71
C Vercellati et al.
Analysis of the red cell membrane proteins. The
red cell membranes were prepared using the technique
reported by Dodge et al.19, and the protein components
analysed using SDS polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE) according to Fairbanks et al.20 and
Laemmli21 with subsequent densitometric scanning with
UltroScan XL (LKB, Uppsala, Sweden).
Analysis of spectrin. The spectrin was extracted
both at 37 °C, to determine the association constant
(KA) of the dimer, and at 4 °C, to evaluate the dimertetramer ratio 4, and analysed by nondenaturing
polyacrylamide gel electrophoresis. Furthermore, the
spectrin extracted at 4 °C was subjected to limited
proteolytic digestion by trypsin (20 hours, 4 °C,
trypsin/spectrin ratio 1:250)22. The resulting peptides
were analysed by SDS-PAGE according to Laemmli21.
Cryopreservation of the red cell concentrates.
Two units of red cell concentrates had been frozen
using the method of Valeri et al. 23 and cyropreserved
for 12 and 9 years. The final red cell recovery after
thawing was obtained from the ratio between the
intraerythrocyte haemoglobin at the end of the
deglycerolisation and the sum of the intracellular
haemoglobin and the total haemoglobin in the
discarded solution 23 . Haematological and
biochemical characteristics of the first unit were
investigated. The second unit was transfused into a
patient with chronic anaemia in a stable condition.
Effects of HE red cells transfusion. The
transfusion indices were calculated using the method
of Modell and Berdoukas24. Information concerning
the outcome of the six previous transfusions of liquid
red cell concentrates was obtained from the
computerised records of the Transfusion Centre of
Ospedale Maggiore, Milan.
Results
The donor's main clinical and laboratory data are
shown in Table I and Figure 1. Almost all the red
cells were elliptocytes (80%), rod-like red cells and
micropoikilocytes. There were no signs of haemolysis
and no other haematological disorders.
The quantitative ratios between the main red cell
membrane proteins (spectrin/band 3, ankyrin/band 3
and protein 4.1/band 3) were normal (Table II).
Biochemical analysis of the spectrin showed a
considerable increase in the percentage of dimers
(Figure 2A) and a decrease in the association constant
of the dimer (KA) (Table II). SDS-PAGE of tryptic
peptides (Figure 2B) showed a clear increase in a 74
72
preparate secondo il metodo di Dodge e coll.19, e le
componenti proteiche analizzate mediante SDS
elettroforesi in gel di poliacrilamide (SDS-PAGE)
secondo Fairbanks et al.20 e Laemmli21 e successiva
scansione densitometrica con UltroScan XL (LKB,
Uppsala, Svezia).
Analisi della spettrina. La spettrina è stata
estratta sia a 37 °C per la determinazione della
costante di associazione (KA) del dimero, sia a 4 °C
per la determinazione del rapporto dimero/tetramero4
ed analizzata mediante elettroforesi in gel di
poliacrilamide in condizioni native.
La spettrina estratta a 4 °C è stata inoltre
sottoposta a digestione proteolitica controllata con
tripsina (20 ore, 4 °C, rapporto tripsina/spettrina
1:250)22. I peptidi risultanti sono stati analizzati
mediante SDS-PAGE secondo Laemmli21.
Criopreservazione delle emazie concentrate.
Due unità di emazie concentrate sono state
congelate secondo il metodo di Valeri e coll. 23 e
criopreservate per 12 e 9 anni rispettivamente. Il
recupero eritrocitario finale dopo scongelamento
è stato ricavato dal rapporto fra l'emoglobina
intraeritrocitaria
al
termine
della
deglicerolizzazione e la somma dell'emoglobina
intraeritrocitaria e dell'emoglobina totale della
soluzione di scarto 23.
La prima unità è stata sottoposta a
caratterizzazione ematologica e biochimica, e la
seconda trasfusa ad un paziente anemico cronico in
condizioni stabili.
Effetti della trasfusione di emazie EE. Gli
indici trasfusionali sono stati calcolati secondo
Modell e Berdoukas24.
Le informazioni relative all'esito di sei pregresse
trasfusioni di emazie concentrate allo stato liquido
sono state ottenute consultando l'archivio
computerizzato del Centro Trasfusionale
dell'Ospedale Maggiore di Milano.
Risultati
I principali dati clinici e di laboratorio della
donatrice di sangue ML sono riassunti nella Tabella I
e nella Figura 1. La quasi totalità degli eritrociti era
costituita da ellissociti (80%), emazie a bastoncello
e micropoichilociti, in assenza di segni di emolisi o
di altre anormalità ematologiche.
I rapporti quantitativi tra le principali proteine della
Blood Transf 2003; 1: 70-6
Elliptocytosis in a blood donor
Table I - Haematological data of the blood donor ML at the time of the study
Parameters
Haemoglobin (g/dL)
MCV (fL)
MCH (pg)
MCHC (g/dL)
Red cell morphology
Reticulocytes (109/L)
Unconjugated bilirubin (mmol/L)
Serum ferritin (mg/L)
Acidified glycerol lysis test (AGLT) (sec)
Standard glycerol lysis test (GLT) (sec)
Osmotic fragility (NaCl): fresh RBCs
incubated RBCs
Autohaemolysis (%): no additive
+ glucose
+ ATP
ML
reference values
13.1
96
33
35
100% abnormal cells
(elliptocytes,ovalocytes,
rod-shaped cells, poikilocytes)
46
10.9
22
> 900
39
normal
normal
1.9
0.4
0.6
11.8 - 14.7
81 - 99
27-34
31-36
normal
Figura 1 - Red cell morphology of blood donor ML
kDa peptide fragment (αI/74) to the detriment of the
αI/80 spectrin domain.
Retrospective analysis of the data concerning the units
transfused did not reveal any reports of adverse reactions.
The haematological and biochemical characteristics
of packed red cell unit cryopreserved for 12 years
are summarised in Table III. The red cell recovery
after deglycerolisation was excellent and the
haematological, biochemical and metabolic
characteristics of donor erythrocytes almost identical
to the reference values obtained from fresh blood.
The unit cryopreserved for 9 years was thawed
and transfused into a stable haematological patient:
the in vivo haemoglobin increase (transfusion efficacy)
Blood Transf 2003; 1: 70-6
16 - 84
< 12.8
19 - 87
> 900
23-45
normal
normal
2.0 - 5.0
0.2 - 2.0
0.2 - 2.0
membrana eritrocitaria (Spettrina/Banda3, Anchirina/
Banda 3 e Proteina 4.1/Banda 3) erano normali
(Tabella II).
L'analisi biochimica della spettrina ha rivelato
un notevole aumento della percentuale di dimeri
(Figura 2A) ed una riduzione della costante di
associazione del dimero (KA) (Tabella II). L'SDSPAGE dei peptidi triptici (Figura 2B) ha evidenziato
un netto aumento del frammento peptidico di peso
molecolare 74 KD (αI/74) a scapito del dominio
spettrinico αI/80.
L'analisi retrospettiva dei dati trasfusionali relativi
alle unità donate non ha evidenziato alcuna
segnalazione di reazioni avverse.
Le caratteristiche ematologiche e biochimiche
dell'unità di emazie concentrate criopreservata per
12 anni sono riassunte nella Tabella III. Il recupero
eritrocitario dopo deglicerolizzazione è stato ottimale
e le caratteristiche ematologiche, biochimiche e
metaboliche delle emazie pressoché sovrapponibili
ai valori di riferimento ottenuti su sangue fresco.
L'unità criopreservata per 9 anni è stata scongelata
e trasfusa in un paziente ematologico stabile:
l'incremento emoglobinico in vivo (efficienza
trasfusionale) determinato 30 minuti dopo il termine
della trasfusione, è risultato uguale al 37 % del valore
atteso, quest'ultimo determinato dividendo il numero
di grammi di emoglobina trasfusi per il volume
ematico stimato del ricevente. Il decremento
emoglobinico giornaliero (0,06 g/dL di emoglobina)
è stato inferiore a quello registrato per lo stesso
paziente nelle ultime cinque trasfusioni con emazie
73
C Vercellati et al.
Table II - SDS-PAGE of red cell membrane proteins and spectrin
biochemical analysis
Table III - Haematological and biochemical characteristics of
packed red cells unit cryopreserved for 12 years
Parameters
ML
Reference values
Parameters
SDS-PAGE
Spectrin / Band 3
Ankyrin / Band 3
Protein 4.1 /Band 3
1,21
0.14
0.12
0.95 - 1.21
0.13 - 0.23
0.11 - 0.20
47.6
0.052
variant αI/74
< 15.9
1.6 - 6.0
/
Biochemical analysis of spectrin
Dimers (%)
KA (105M-1)
Tryptic peptide map
RBC recovery (%)
RDW (%)
Elliptocytes (%)
Acidified glycerol lysis
test (AGLT) (sec)
Standard glycerol lysis
test (GLT) (sec)
Osmotic fragility in
NaCl on icubated RBC
Heinz bodies
RBC oxygen affinity (P50, mm Hg)
2,3-DPG (mmoli/g Hb)
ATP (mmoli/g Hb)
SDS-PAGE
Spectrin / Band 3
Ankirin / Band 3
Protein 4.1 /Band 3
Cryopreserved
unit
Reference values
(fresh blood)
92
> 85
14.3
80
>900
11.8 - 14.8
/
> 900
30
23-45
slightly
increased
neg
20.2
7.3
3.5
normal
neg
20.9 - 26.9
8.8 - 12.3
3.6 - 4.9
1.12
0.17
0.13
0.95 - 1.21
0.13 - 0.23
0.11 - 0.20
concentrate conservate allo stato liquido (0,08 - 0,1 g/dL
di emoglobina).
Discussione
Figura 2A - Electrophoretic pattern of tetrameric and dimeric
spectrin. 2B - Peptide maps of spectrin after tryptic
digestion
74
La relativa frequenza delle forme asintomatiche
di EE 11-13, irriconoscibili ai tests di idoneità alla
donazione di sangue, lascia supporre che sia
possibile
raccogliere
e
trasfondere
inconsapevolmente unità di emazie EE.
Il riconoscimento di tali donatori è del tutto
occasionale e usualmente tardivo 14 . Nel caso
descritto, la presenza di una patologia ematologica è
stata sospettata dopo alcune donazioni di sangue in
occasione della lettura microscopica dei test di
compatibilità pretrasfusionale, similmente a quanto
riportato da Kruskall e coll. 14 in due donatori
periodici.
La mappa peptidica della spettrina dopo digestione
triptica controllata ha consentito di identificare il difetto
molecolare di base nella variante Sp αI/74 che è
associata, nel 50% dei casi, a EE asintomatica13,27.
La trasfusione di unità di emazie EE è stata sino
ad oggi sconsigliata 14, poiché l'emivita di tali eritrociti,
normale nella maggior parte degli individui EE non
emolitici 11 , è ridotta quando sono reinfusi
sperimentalmente in soggetti normali25,26 ma non in
soggetti asplenici26.
Tuttavia, non si hanno informazioni sulla sicurezza
Blood Transf 2003; 1: 70-6
Elliptocytosis in a blood donor
measured 30 minutes after the end of the transfusion
was 37% of the expected value, this latter calculated by
dividing the total grams of haemoglobin transfused by
the estimated blood volume of the recipient. The daily
rate of haemoglobin fall (0.06 g/dL of haemoglobin) was
less that that recorded in the same patient in the last five
transfusions with red cell concentrates stored in a liquid
state (0.08 - 0.1 g/dL of haemoglobin).
Discussion
The relative frequency of asymptomatic forms
of HE 11-13 , unrecognisable by tests of donor
suitability, suggests that HE blood is sometimes
unknowingly collected and transfused. The
recognition of such donors is incidental and usually
late14. In the case described, the presence of a blood
disorder was only suspected after several donations
during microscopic examination of pre-transfusional
compatibility tests, as described by Kruskall et al.14
for two other periodic donors. The spectrin peptide
map after limited trypsin digestion identified the
underlying molecular defect as being the Sp αI/74
variant which is associated, in 50% of cases, with
asymptomatic HE13,27. The transfusion of units of
HE red cells has so far been advised against14, since
the half-life of these red cells, normal in most nonhaemolytic HE subjects11, was shortened when the
cells were experimentally transfused into normal
subjects 25,26 but not in asplenic patients 26 .
Nevertheless, there is no information on the safety
or real transfusional efficacy of HE blood, nor on
its characteristics after liquid or frozen storage. Given
the lack of other information, our retrospective
observation that transfusion of red cell units from
this donor with HE, stored at 4 °C, did not cause
adverse reactions could be of practical interest. The
effect of cryopreserving units of blood from patients
with congenital blood disorders has so far only been
studied in sickle cell anaemia with a view to
autotransfusion: the results were positive 28,29. The
normal in vitro red cell recovery and metabolic
parameters of the unit cryopreserved for 12 years
allow us to conclude that blood from patients with
benign HE is not damaged by being frozen, even for
long periods. The reduced transfusional efficacy
suggests rapid splenic sequestration of the HE red
cells, which is in line with results from studies of red
cell kinetics25. Nevertheless, the remaining red cells
demonstrated a normal daily haemoglobin loss.
Blood Transf 2003; 1: 70-6
e sulla reale efficacia trasfusionale di emazie EE né
sulle loro caratteristiche dopo conservazione allo
stato liquido o congelato.
L'osservazione retrospettiva che la trasfusione
delle unità di emazie della donatrice ML conservate
a 4 °C non era esitata in reazioni avverse può essere
di interesse pratico in assenza di altre informazioni.
L'effetto della criopreservazione di unità di sangue
di soggetti portatori di emopatie congenite è stato
finora studiato, con risultati positivi, solo nella anemia
falciforme a fini autotrasfusionali28,29.
La normalità del recupero eritrocitario in vitro e
dei parametri metabolici dell'unità criopreservata per
12 anni consentono di concludere che le emazie di
EE benigna non vengono danneggiate dal
congelamento anche se protratto.
La ridotta efficienza trasfusionale suggerisce un
rapido sequestro splenico degli eritrociti EE in linea
con i risultati degli studi eritrocinetici 25.
Le emazie residue dimostrano tuttavia un normale
decremento emoglobinico giornaliero.
In conclusione, la trasfusione casuale di unità di
emazie EE sia allo stato liquido che congelato non
sembra comportare reazioni avverse.
Tuttavia la scarsa efficienza trasfusionale
suggerisce che non sia da incoraggiare l'utilizzo
consapevole di tali unità ai fini trasfusionali.
75
C Vercellati et al.
In conclusion, casual transfusion of units of HE blood,
either stored in a liquid state or cryopreserved, does not
seem to produce adverse reactions. Nevertheless deliberate
transfusions of such blood is not encouraged given its poor
transfusional efficiency.
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