Sottopopolazioni leucocitarie in concentrati
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Sottopopolazioni leucocitarie in concentrati
Sottopopolazioni leucocitarie in concentrati piastrinici da aferesi e da plasma ricco di piastrine Saverio Misso(1), Bianca Feola(1), Claudio Marotta(1), Daniela Graziano(2), Pietro Concilio(2), Annagrazia Fratellanza(2), Valentina Minerva(1), Antonio Minerva(1) (1) (2) Immunoematologia e Servizio Trasfusionale Azienda Ospedaliera, Caserta (Responsabile della Ricerca: Dr. Antonio Minerva) Immunoematologia e Medicina Trasfusionale AUP Federico II, Napoli Leucocytes in platelet concentrates could be responsible of serious side effects: alloimmunization versus HLA antigens, infections and others, each one depending on a different leucocyte population. In the last years it has been proposed to infuse platelet concentrates containing less than 5 x 105 leucocytes per unit in order to prevent these reactions. Two methods are commonly used: filtration and apheresis. The Authors evaluated phenotypic differences of leucocytes in not filtrated platelet concentrates produced by apheresis and in filtrated platelet concentrates derived from platelet rich plasma. Parole chiave: concentrati piastrinici, citometria a flusso, leucodeplezione Key words: platelet concentrates, flow cytometry, leucodepletion Introduzione e scopo La trasfusione dei concentrati piastrinici (CP) è usata nella terapia trasfusionale di pazienti affetti da gravi piastrinopenie e/o piastrinopatie; è noto che tale trasfusione può determinare effetti collaterali causati dai leucociti che residuano in tali preparati: alloimmunizzazione HLA, refrattarietà alla trasfusione piastrinica, reazioni febbrili non emolitiche (FNHTR), infezioni o altre complicanze trasfusionali1,2. Per la prevenzione di tali complicanze è stato proposto, da alcuni anni, di trasfondere concentrati piastrinici aventi un numero di leucociti < 5x105 per unità3,4,18. Attualmente sono utilizzati due metodi che permettono una Ricevuto: 22 Marzo 2001 - Accettato: 27 settembre 2001 Corrispondenza: Dott. Saverio Misso Via San Francesco d'Assisi, 5 81100 Caserta 258 riduzione dei leucociti negli emocomponenti: la filtrazione e le tecniche aferetiche5. Tali tecniche ci permettono un decremento dell'incidenza dell'alloimmunizzazione HLA23, della refrattarietà alla stessa trasfusione24, una riduzione dell'infezione da Cytomegalovirus (CMV) equivalente alla trasfusione di emocomponenti CMV negativi6-8,26-28 ed una riduzione delle infezioni post-operatorie6,9. Mentre fino a pochi anni fa l'attenzione di numerosi gruppi di studi era tutta verso il numero assoluto dei leucociti residui nei CP10-15, dal 1991 tale attenzione è stata spostata verso le caratteristiche biologiche delle cellule presenti negli emocomponenti usati nella pratica trasfusionale16. La popolazione leucocitaria residua di un emocomponente leucodepleto comprende una varietà di cellule funzionalmente differenti e fenotipicamente identificabili che sono responsabili dello sviluppo dell'alloimmunizzazione e/o di altri tipi di reazioni trasfusionali, ognuna delle quali associata ad una particolare sottopopolazione leucocitaria17,19,20; infatti, la FNHTR è associata alla presenza dei granulociti e dei monociti21, l'alloimmunizzazione ai monociti-macrofagi23,24, l'infezione da HTLV-1 ai linfociti T22, l'infezione da CMV ai granulociti, ai monociti ed ai linfociti 26-29, la GvHD ai linfociti T CD4+ e T CD8+25. Scopo del nostro studio è stato quello di analizzare il numero dei leucociti residui, la distribuzione della sottopopolazione leucocitaria ed eventuali differenze fenotipiche nei concentrati piastrinici prodotti sia con tecnica aferetica non filtrati che da plasma ricco di piastrine post-filtrazione. Materiali e metodi Preparazione concentrati piastrinici Abbiamo analizzato 24 concentrati piastrinici (CP) da aferesi non filtrati prodotti con un separatore cellulare a LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 4 luglio-agosto 2001 (258-262) Sottopopolazioni leucocitarie in concentrati piastrinici flusso continuo Cobe Spectra LRS turbo versione 7 (Cobe BCT corp., Lakewood, CO,USA). Le piastrine sono state ottenute da donatori periodici di età compresa tra 28-44 anni, 14 di sesso maschile e 10 di sesso femminile aventi una conta piastrinica e leucocitaria pre-donazione rispettivamente di 220 - 310 x 103/µL e di 4.1 - 5.2x103/µL. Sono stati analizzati, inoltre, 11 pools piastrinici prodotti da plasma ricco di piastrine (PRP), ottenuti sempre da donatori periodici di sangue afferenti al nostro centro di Immunoematologia. Tutti i pool, ognuno dei quali era costituito da sei unità di piastrine, sono stati filtrati in laboratorio con filtri Biofil P10 plus (Biofil-Fresenius AG, Homburg, Germany) seguendo le istruzioni d'uso fornite dal produttore. Conteggio dei leucociti Il conteggio leucocitario pre-filtrazione è stato effettuato mediante un apparecchio automatico (Sysmex SF 3000 Europe GMBH, Bornbarch, 1 Norderstedt, Germania) in possesso del nostro Centro. Per il conteggio post-filtrazione, a causa della sensibilità minima dei contatori automatici (100 leucociti/µL contro una sensibilità di 1-5 leucociti\µL indispensabile per una corretta valutazione dei leucociti residui 12 , è stato utilizzato il metodo fluorocromatico11,14: la sospensione cellulare è stata dispensata in 20 pozzetti (2 µL in ognuno) in una piastra di Terasaki da tipizzazione tessutale, ad essa sono stati aggiunti 5 µL di fluorocromo (Fluoroquence - One Lambda, Inc., Conaga Park, CA, USA) ed incubato per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, dopo una centrifugazione di 2 minuti a 300 g, la lettura delle piastre è stata eseguita mediante un microscopio a fluorescenza invertito. La concentrazione delle cellule è stata ottenuta sommando i leucociti presenti in ogni pozzetto e dividendoli per il volume totale di sospensione cellulare dispensato (40µL). Analisi del fenotipo leucocitario Per l'analisi del fenotipo leucocitario5, 40 mL del pool dei CP sono stati trasferiti in una provetta da 50 mL e centrifugati a 800 g per 5 minuti a 22 ± 2 °C per concentrare i leucociti. La maggior parte del plasma surnatante è stata rimossa lasciando 15 mL di plasma con il quale il pellet leucocitario è stato risospeso, inoltre è stato aggiunto PBS/ albumina in modo tale da portare il volume a 30 mL. Allo stesso modo è stato preparato il concentrato leucocitario residuo nei prodotti da aferesi. Successivamente, 5 mL della sospensione leucocitaria sono stati aggiunti a 6 mL di un gradiente di densità, il tutto è stato centrifugato a 800 g per 15 minuti a 22 °C in modo da ottenere nella parte superiore della provetta piastrine, nella parte intermedia il gradiente e nella parte inferiore i leucociti adesi al fondo. Il plasma, le piastrine ed il gradiente di densità sono stati aspirati mentre i leucociti sono stati risospesi nel restante surnatante. Il volume è stato, poi, portato a 12 mL con PBS/albumina ed il tutto è stato centrifugato a 800 g x 5 minuti a 22 °C. Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato rimosso ed il pellet dei leucociti è stato lavato con 10 mL di PBS/ albumina, centrifugato ed infine risospeso fino ad un volume pari a 400 µL. Lo studio delle sottopopolazioni leucocitarie è stato effettuato in citofluorimetria a flusso15 (Ortho Diagnostic Systems-Cytoron Absolute ARS, Raritan, USA) utilizzando anticorpi monoclonali (Serotec Ltd 22 Bankside, Station Approach, Kidlington,Oxford, England) anti-leucociti (CD 45 FITC), anti-linfociti T CD4+ (CD 3 FITC\CD 4 PE), antilinfociti T CD8+ (CD 3 FITC\CD 8 PE), anti-linfociti B (CD 3 FITC\CD19 PE), anti-monociti-mielomonociti (CD 14 PE) e anti-granulociti (CD 15 FITC). 20 µL di tali anticorpi monoclonali sono stati aggiunti a 50 µL della sospensione leucocitaria nelle rispettive provette precedentemente contrassegnate e i campioni sono stati incubati per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, ad ogni provetta sono stati aggiunti 300 µL di soluzione lisante e quindi è stata effettuata la lettura al citofluorimetro. Il gate per i granulociti, i monociti ed i linfociti è stato selezionato sulla base della fluorescenza del CD45, infatti, tutte le normali cellule del sangue esprimono l'antigene CD45 sulla loro superficie a differente densità. Abbiamo utilizzato tale anticorpo monoclonale sia per identificare i leucociti sui campioni in esame che per facilitare l'identificazione delle tre maggiori sottoclassi. Inoltre, la differenzazione dei linfociti B, T CD4+ e T CD8+ è stata ottenuta dalla analisi di due fluorescenze associate al gate della popolazione linfocitaria. Un totale di circa 40000 eventi per aliquota è stato esaminato. La determinazione del numero assoluto dei leucociti e della sottopopolazione leucocitaria è stata effettuata due giorni dopo la produzione dei concentrati piastrinici. Per l'analisi statistica abbiamo utilizzato il t-Student test,considerando significativa la p inferiore a 0,05. Risultati I risultati, espressi come media e deviazione standard, sono i seguenti: i leucociti residui per unità di CP prodotti da aferesi sono stati 3,9 + 2 x 105 mentre quelli residui nei CP da PRP post-filtrazione sono stati 4,1 + 3 x 105. Lo studio delle sottopopolazioni leucocitarie è riportato nella tabella I e nella figura 1. 259 S. Misso et al. Figura 1- Confronto fra i subsets leucocitari nei CP da Aferesi e da PRP. La p è stata considerata significativa se inferiore a 0,05 Tabella I: valori medie e derivate standard dei subsets leucocitari studiati CP-Aferesi CP-PRP CD19 CD4 CD8 CD14 CD15 10,3 ± 3 11,5 ± 4 46,4 ± 6.6 56,2 ± 7.6 33,9 ± 4.2 27,5 ± 4.7 7,8 ± 3.1 2,2 ± 0.7 1,3 ± 0.7 1,3 ± 0.6 Discussione e conclusioni Reazioni febbrili ed allergiche sono complicanze frequenti delle trasfusioni di piastrine sia da singolo donatore (aferesi) che da donatori multipli (random). Tali reazioni sono in rapporto con la sensibilizzazione verso antigeni HLA e non HLA presenti sui linfociti, granulociti o piastrine che vengono trasfusi e verso proteine plasmatiche; numerosissime sono le reazioni avverse associate all'infusione di tali elementi cellulari tra cui vanno ricordate la refrattarietà alla trasfusione delle piastrine, reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche, GvHD, infezioni virali ecc. La responsabilità dei leucociti nelle principali reazioni trasfusionali è ormai universalmente 260 riconosciuta e la pratica della leucodeplezione è sempre più impiegata di routine nella terapia trasfusionale onde evitare reazioni indesiderate, così come l'utilizzo di separatori cellulari in grado di produrre dei concentrati piastrinici con un numero di leucociti talmente limitato da non richiedere l'uso dei filtri per la leucodeplezione. Tuttavia, il numero dei leucociti non dà informazioni circa le varie sottopopolazioni leucocitarie presenti nei concentrati piastrinici, mentre le varie sottopopolazioni e la loro funzione hanno un ruolo fondamentale in relazione ai rischi ed ai benefici della trasfusione di un emocomponente in generale e dei concentrati piastrinici in particolare, specialmente se si considera che tali emocomponenti vengono trasfusi per la maggior parte a Sottopopolazioni leucocitarie in concentrati piastrinici pazienti con un sistema immunitario già abbastanza compromesso. Dai nostri risultati, conformi a quelli di altri autori17, si deduce che vi è una differenza nell'ambito delle sottopopolazioni leucocitarie presenti nei CP random filtrati ed in quelli da aferesi. I CP da aferesi contengono un numero più elevato (statisticamente significativo) di cellule CD14+ rispetto ai CP random filtrati (p < 0,05), viceversa hanno un minor numero di linfociti T CD4+ (p < 0,05) ed un aumento dei T CD8+ (p < 0,05). Nessuna differenza statisticamente significativa, invece, è stata riscontrata tra le cellule CD15+ e CD19+ dei due emocomponenti considerati (p > 0,05). Tali dati, a nostro avviso, possono avere una importanza clinica notevole, poiché mettono in evidenza che il CP è un emocomponente che presenta delle diverse caratteristiche a secondo della tecnica con la quale è prodotto. Considerando che la linea monocitico-macrofagica gioca un ruolo importante nella alloimmunizzazione e nella refrattarietà, è questa la linea cellulare, a nostro avviso, che deve essere ridotta nei concentrati piastrinici. Valutando solo questo aspetto del problema, dovremmo concludere che i concentrati piastrinici prodotti da PRP comportano un minor rischio di alloimmunizzazione rispetto a quelli prodotti da aferesi. Se però valutiamo il problema nella sua interezza (trasmissione di CMV, ipotetica trasmissione di prioni, difficoltà tecnica a produrre un concentrato piastrinico da PRP sempre con caratteristiche riproducibili, GvHD) il preparato aferetico è l'emocomponente che presenta tali vantaggi. Inoltre, considerando il basso numero degli elementi leucocitari e le basse percentuali delle sottopopolazioni presenti in ambedue concentrati, è difficile valutare il loro reale ruolo nel meccanismo fisiopatologico dell'evento alloimmunizzante. Alla luce di queste valutazioni, quindi, sono auspicabili studi clinici che ci permettono di valutare la reale efficacia terapeutica ed i rischi di tali emocomponenti nel paziente politrasfuso. Riassunto I leucociti nei concentrati piastrinici possono essere responsabili di seri effetti collaterali: alloimmunizzazione nei confronti di antigeni del sistema HLA, infezioni ed altro, ciascuno dei quali dipendente da differenti sottopopolazioni leucocitarie. Negli ultimi anni è stato proposto di trasfondere concentrati piastrinici contenenti meno di 5 x 105 leucociti per unità, allo scopo di prevenire queste reazioni. Due sono i metodi comunemente usati, filtrazione e aferesi. Sono state valutate le differenze fenotipiche dei leucociti presenti in concentrati piastrinici prodotti mediante aferesi e non filtrati e in concentrati piastrinici derivati da plasma ricco di piastrine e sottoposti a filtrazione. Bibliografia 1) Bordin J, Heddle NM, Blajchman MA: Biologic effects of leukocytes present in transfused cellular blood products. Blood, 84, 1703, 1994. 2) Jacobs Lb, Shirey RS, Ness PM: Hemolysis due to the simultaneous occurrence of passenger lymphocyte syndrome and a delayed hemolytic transfusion reaction in a liver transplant patient. Arch Pathol Lab Med, 120, 684, 1996. 3) Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Council of Europe, Strasbourg,1992. 4) Beckman N, Keller-Stanislawwski B: Leukodepletion and regulatory aspects in Germany. Trasfus Sci, 22, 69, 2000. 5) Sowemimo-Coker SO, Kim A, Tribble E et al.: White cells subsets in apheresis and filtered platelet concentrates. Transfusion, 38, 650, 1998. 6) Heaton A: Quality of leukodepleted blood products. Transfus Sci, 16, 189, 1995. 7) Brand A : Leukocyte contamination of platelet products. Transfus Sci, 15, 357, 1994. 8) Heddle NM: The efficacy of leukodepletion to improve leukodepletion response: appraisal of clinical studies. Trasf Med Rev, 8, 15, 1994. 9) Ledent E, Semple JW, Berlin G: White blood cell subsets in buffy coat-derived platelet concentrates: the effect of preand post-storage filtration. Vox Sang, 79, 235, 2000. 10) Dzik S: Principles of counting low number of leukocytes in leukoreduced blood components. Transf Med Rev, 11, 44, 1997. 11) Borzini P, Dumont LJ: Microdroplet flourochromatic assay for the enumeration of white cells (WBCs) in WBC-reduced blood components: validation and application for evaluating newly developed WBC-reduction filters. Transfusion, 37, 601, 1997. 12) Sheckler VL, Loken MR: Routine quantitation of white cells as low as 0.001 per ml in platelet components. Transfusion, 33, 256, 1993. 13) Wenz B, Burns ER, Miller WK: A rare-event analysis model for quantifying white cells in white cell-deplet blood. Transfusion, 31, 156, 1991. 14) Prati D, Capelli C, Bosoni P, Rebulla P: An improved method for white cell counting in white cell-reduced red cells. Transfusion, 34, 453, 1994. 15) Dumont LJ, Dumont DF: Enhanced flow cytometric method for counting very low numbers of white cells in platelet components. Cytometry, 26, 311, 1996 16) Freedman J, Blanchette V, Horstein A et al.: White cell depletion of red cell and pooled random-donor platelet concentrates by filtration and residual lymphocyte subset analysis . Transfusion, 31, 433, 1991. 261 S. Misso et al. 17) Triulzi DJ, Meyer EM, Donnenberg AD: WBC subset analysis of WBC-reduced platelet components: Transfusion, 40, 771, 2000. 18) Dzik S, Aubuchon J et al.: Leukocyte reduction of blood components : public policy and new technology . Transf Med Rev, 14, 34, 2000. 19) De Wildt-Eggen J, Schrijver JG, Kuiper-Kramer PA et al.: Differences in residual white blood cells subset counts in buffy coat-depleted red cell concentrates prepared with bottom and top or quadruple-bag system. Vox Sang, 77, 97, 1999. 20) Rider JR, Want EJ, Winter MA et al.: Differential leucocyte subpopulation analysis of leucodepleted red cell products: Transfus Med, 10, 49, 2000. 21) Muylle L, Joos M, Wouters E et al.: Increased tumor necrosis factor alpha (TNFα), interleukin 1,(IL-1) and interleukin 6 (IL-6) levels in the plasma of stored platelet concentrates: relationship between TNF α and IL-6 levels and febrile transfusion reaction: Transfusion, 33, 195, 1993. 22) Fiebig E, Hirschkorn DF, Maino VC et al.: Assessment of donor T-cell function in cellular blood components by the CD69 induction assay: effects of storage, γ radiation, and photochemical treatment: Transfusion, 40, 761, 2000. 23) Meryman HT: Transfusion-induced alloimmunization and immunosuppression and the effects of leukocyte depletion. Transfusion Med Rev, 3, 180, 1989. 262 24) The Trial to Reduce Alloimmunization to Platelets Study Group: Leukocyte reduction and ultraviolet B irradiation of platelets to prevent alloimmunization and refractoriness to platelet transfusions. N Engl J Med, 337, 1861, 1997. 25) Hayashi H, Nishiuchi T, Tamara H, Takeda K: Transfusionassociated graft-versus-host disease caused by leukocyte filtered stored blood. Anesthesiology, 79, 1419, 1993. 26) Bowden RA, Slichter SJ, Sayers M et al: A comparison of filtered leucocyte-reduced and cytomegalovirus (CMV) seronegative blood products for the prevention of transfusion-associated CMV infection after bone marrow transplant. Blood, 86, 3598, 1995. 27) Sayers MH, Anderson KC, Goodnough LT et al.: Reducing the risk for transfusion-transmitted cytomegalovirus infection. Ann Intern Med, 116, 55, 1992. 28) Hillyer CD, Emmens RK, Zago-Novaretti M, Berkman EM: Methods for the reduction of transfusion-transmitted cytomegalovirus infection: filtration versus use of seronegative donor units. Transfusion, 34, 929, 1994. 29) Preikasaitis JK: The Cytomegalovirus "safe" blood product: is leukoreduction equivalent to antibody screening? Trasf Med Rev, 14, 112, 2000. 30) Barbara J: Prions and blood transfusion . Trasfus Sci, 22, 49, 2000.
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