Review - Blood Transfusion

Review
Universal red blood cells
Federico Morelli
Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale, Azienda Ospedaliera Ospedale San Martino di Genova
e Cliniche Universitarie Convenzionate
(Responsabile: Dott. Mauro Valbonesi)
Introduction
Introduzione
The aim of Transfusion Medicine is to make the
transfusion of blood between individuals of the same
species both possible and safe.
Incompatibility reactions caused by different antigens
on the red blood cells were a clinically unexplainable and
irresolvable problem until Landsteiner discovered the blood
group antigens of the ABO system: the classification of
donors and recipients finally allowed transfusion therapy
to used with reasonable success1.
In our times, just over a century later, ABO typing
remains the cornerstone to blood transfusion: the whole
system, in its various stages of collection, distribution and
transfusion, is based on this typing. Nevertheless,
transfusion of ABO incompatible units is still the main cause
of transfusion accidents with a fatal outcome2,3.
Eliminating the need to type for the ABO group would
be a scientific revolution of the same grandeur as that
triggered by Landsteiner's discoveries. Italian transfusion
legislation does already accept the use of universal red
blood cells (RBC) in situations in which transfusion is
needed so urgently that ABO and RhD that typing cannot
be carried out: these RBC are group O RhD negative4,5.
Unfortunately, O RhD negative blood is rare. Moreover,
there are some clinical situations in which this approach is
not adequate. In patients transfused occasionally but who
have a rare phenotype and/or are immunised against public
antigens, in autoimmune haemolytic anaemias, in patients
receiving multiple transfusions, and in the chronic
anaemias even the non-ABO/RhD minor blood group
Scopo della Medicina Trasfusionale è rendere possibile
e sicura la trasfusione di sangue tra individui della stessa
specie.
Le reazioni da incompatibilità dovute alle differenze
antigeniche sui globuli rossi (RBC) hanno costituito un
problema clinico inspiegabile e insolubile fino a quando
Landsteiner scoprì i caratteri gruppoematici del sistema
ABO: la classificazione di donatori e pazienti permise
finalmente di effettuare con buon successo la terapia
trasfusionale1.
Ai nostri giorni, un secolo dopo, la tipizzazione ABO
rimane ancora il cardine della trasfusione del sangue: l'intero
sistema, nelle sue fasi di raccolta, distribuzione e
trasfusione, non può farne a meno. Tuttavia l'infusione di
unità ABO incompatibili è ancora la principale causa di
incidenti trasfusionali ad esito fatale2,3.
Eliminarne la necessità innescherebbe una rivoluzione
scientifica pari a quella innescata da Landsteiner. La
normativa trasfusionale italiana già prevede l'utilizzo di
emazie universali nei casi che necessitano di trasfusione
talmente urgente da non consentire di effettuare la
tipizzazione ABO e RhD: esse sono di gruppo O RhD
negativo4,5.
Le emazie O RhD negativo però sono rare; inoltre, ci
sono alcune situazioni cliniche in cui questo approccio
non è sufficiente. Nei pazienti trasfusi occasionalmente ma
di fenotipo raro e/o immunizzati verso antigeni ad alta
diffusione, nelle anemie emolitiche autoimmuni, nei
politrasfusi e nelle anemie croniche anche i sistemi
gruppoematici minori non ABO/RhD acquistano rilievo:
circa il 30% di falcemici e thalassemici sviluppano
alloanticorpi immuni clinicamente significativi6,7. Questi
soggetti, che oggi vengono ipertrasfusi e vivono molto
Correspondence:
Dott. Federico Morelli
Via dei Vassalli 2/1
16167 Genova
224
Blood Transf 2003; 3: 224-43
Universal RBCs
antigen systems become relevant: about 30% of patients
with sickle cell anaemia or thalassaemia develop clinically
significant alloantibodies6,7. Such patients, who are
nowadays transfused with many units of blood and live
for much longer, often belong to particular ethnic groups
and marked antigenic differences between the donor and
recipient stimulate the production of antibodies against
ubiquitous or high frequency antigens: in this way these
patients can become practically untransfusable8,9. It is then
necessary to turn to an international registry of donors
with rare phenotypes (e.g. the International Donor Panel
of the World Health Organisation, WHO IDP), whose
development requires considerable organisational and
financial resources10,11.
An alternative could be to use red blood cell substitutes
with the following features: a total block of antigenic sites,
normal survival in the circulation, and negative
compatibility tests. Such a therapeutic alternative does not
yet exist. The perfluorocarbonates and haemoglobin
solutions, although acellular and without problems of
compatibility, have a very short half-life (in the order of
hours) and are appropriate only for urgent or emergency
oxygen delivery12,13.
Two different strategies have been conceived and
developed to obtain the so-called "universal" red blood
cells: one involves enzymatic removal of the antigenic
determinants on the membrane of the red blood cell, the
other is based on chemically masking these antigenic sites
with polymers. The development of efficient methods to
obtain universal RBC would prevent ABO-incompatibility
transfusion errors, prevent large scale immunisation of
patients and allow trouble-free transfusion of those already
immunised.
Group O red blood cells obtained by enzymatic
removal of A and B antigens
It has been known since the 1930s that some bacterial
lysates can destroy A, B and H reactivity14: in detail, bacterial
enzymes of Clostridium tertium, Bacillus cereus and
Trichomonas foetus destroy, respectively, the A, B and H
antigens15-17. When the A and B specificities disappear, H
reactivity increases and two sugars, N-acetylgalactosamine
(NacGal) and galactose (Gal), respectively, are produced.
When reactivity to the H antigen is also lost, the only
reactivity to remain is that against anti-pneumococcus type
XIV antiserum and fucose (Fuc) is obtained.
On the basis of this knowledge a biochemical and
genetic scheme was first hypothesised18 (in the 1940s and
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più a lungo, spesso appartengono a gruppi etnici particolari,
e la spiccata differenza antigenica tra donatore e ricevente
stimola la produzione di anticorpi verso antigeni ubiquitari
o ad alta incidenza: così essi possono diventare
praticamente intrasfondibili8,9. Diventa allora obbligatorio
il ricorso ai registri internazionali di donatori con fenotipi
rari (International Donor Panel dell'Organizzazione
Mondiale della Sanità, WHO IDP), il cui sviluppo richiede
sforzi organizzativi ed economici non indifferenti10,11.
Una possibile alternativa potrebbe essere il ricorso a
sostituti eritrocitari che presentino i seguenti requisiti: un
blocco totale dei siti antigenici, una normale sopravvivenza
in circolo ed esami di compatibilità negativi. Un simile
presidio terapeutico ancora non esiste. I perfluorocarbonati
e le soluzioni di emoglobina, pur essendo acellulari e non
presentando problemi di compatibilità, hanno emivita in
circolo assai breve (nell'ordine di ore) e sono adatti soltanto
al supporto ossiforetico nell'urgenza-emergenza12,13.
Per ottenere emazie cosiddette "universali" sono state
concepite e sviluppate due differenti strategie: la rimozione
per via enzimatica dei determinanti antigenici di membrana
o il mascheramento chimico con polimeri dei siti antigenici.
Lo sviluppo di metodiche efficaci consentirebbe di evitare
l'errore trasfusionale ABO, di prevenire su larga scala
l'immunizzazione dei pazienti e di trasfondere senza problemi
clinici quelli già immunizzati.
Emazie di gruppo O ottenute mediante
rimozione enzimatica degli antigeni A e B
Fin dagli anni '30 è noto che alcuni lisati batterici hanno
la capacità di distruggere le reattività A, B e H14: in
particolare, gli enzimi batterici di Clostridium tertium,
Bacillus cereus e Trichomonas foetus distruggono
rispettivamente gli antigeni A, B e H15-17. Quando le
specificità A e B scompaiono, aumenta la reattività H e si
ottengono come prodotti due zuccheri, rispettivamente Nacetilgalattosamina (NacGal) e galattosio (Gal); quando
anche questa reattività viene perduta rimane solamente
quella con l'antisiero anti-pneumococco tipo XIV e si ottiene
fucosio (Fuc).
Su queste basi è stato prima ipotizzato18 (negli anni '40
e '50) e poi elaborato (negli anni '70) uno schema
biochimico e genetico idoneo a spiegare la formazione
degli antigeni ABO e Lewis sulle emazie e nelle
secrezioni19,20. Gli antigeni ABO sono il risultato
dell'interazione dei geni ABO, Hh, Lewis (Lele) e secretore
(Sese): i prodotti dei geni A, B, H e Lele sono
glicosiltrasferasi che trasferiscono gli zuccheri
225
F Morelli
Figura 1 - Schematic representation of A, B and H oligosaccharide structures on erythocyte membrane. Group A1 specificity present
a repetitive structure. Black arrows indicate sites of glucoside activity for the enzymatic conversion (A→O e B→O)
R = glycoprotein or glycolipid radical, Nacgal = N-acetyl-D-galactosamine, Nacglu = N-acetyl-glucosamine, gal = Dgalactose, fuc = L-fucose
1950s) and then refined (in the 1970s). This scheme was
intended to explain the formation of the ABO and Lewis
antigens on red blood cells and in secretions19,20. The ABO
antigens are the result of interactions between the ABO,
Hh, Lewis (Lele) and secretor (Sese) genes: the products
of the A, B, H and Lele genes are glycosyltransferases
which transfer the immunodominant sugars for A (NacGal),
B (Gal), H (Fuc) and Lewis (Fuc) onto the terminal
β1galactose-Nβ1acetylglucosamine (Galβ1-Nβ1acGlc)
disaccharide unit of the glycoprotein or glycolipid structures
of the membrane.
Originally two types of oligosaccharide precursors were
described: type 1 chains, in which the Galβ1-Nβ1acGlc bond
is of a 1→3 type, are found in secretions but can be absorbed
onto blood cells, while the type 2 chains have a 1→4 Galβ1Nβ1acGlc bond and belong to the red blood cells21.
Subsequently, a new type of oligosaccharide precursor was
identified, expressed exclusively on glycolipids and red
blood cells carrying the A antigen: this so-called type 3
chain is formed of β1galactose-Nα1acetylgalactosamine
(Galβ1-Nα1acGal) with a 1→3 bond and is a repetitive
structure in the A1 phenotype22 (Figure 1). Finally, again in
A subjects, a fourth precursor with a globular structure
226
immunodominanti per A (NacGal), B (Gal), H (Fuc) e Lewis
(Fuc) sull'unità terminale disaccaridica β1galattosoNβ1acetilglucosamina (Galβ1-Nβ1acGlc) di strutture
glicoproteiche o glicolipidiche della membrana.
Sono stati descritti originariamente due tipi di precursori
oligosaccaridici: le catene di tipo 1, in cui il legame Galβ1Nβ1acGlc è di tipo 1→3, si trovano nelle secrezioni ma
possono venire adsorbite sulle emazie, mentre le catene di
tipo 2, in cui il legame Galβ1-Nβ1acGlc è di tipo 1→4, sono
proprie dei globuli rossi21. Successivamente, è stato
evidenziato un nuovo tipo di precursore oligosaccaridico,
espresso esclusivamente su glicolipidi e su eritrociti recanti
l'antigene A, denominato catena di tipo 3, formato da
β1galattoso-Nα1acetilgalattosamina (Galβ1-Nα1acGal) con
legame di tipo 1→3 e di struttura ripetitiva nel fenotipo A122
(Figura 1). Infine, sempre in soggetti A, è stato identificato
un quarto precursore, di struttura globosidica, chiamato
globo-A o catena di tipo 4, presente in minima quantità
sulle emazie22.
L'esposizione sequenziale di nuove strutture
antigeniche, causata dalla rimozione di zuccheri mediante
trattamento enzimatico con eso-glicosidasi, non ha
suggerito soltanto il percorso biosintetico dei determinanti
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Universal RBCs
was identified: this A globoside or type 4 chain is present
in very small quantities on blood cells22.
The sequential exposure of new antigenic structures,
caused by the removal of sugars by enzymatic treatment
with exoglycosidases, not only suggested the biosynthetic
pathway of the ABO determinants, but also revealed how
antigenic structures can appear and disappear during
normal cell differentiation and how epitopes, which are
normally deeply hidden, re-appear on the surface when,
during neoplasia, there is a defect of gene expression and/
or enzyme activity22.
This gave rise to the attempt to convert A and B red
cells into O erythrocytes (Erythrocyte Conversion in O,
ECO) by removing the respective immunodominant sugars
(NacGal and Gal) using appropriate exoglycosidases of nonbacterial origin: αN-acetylgalactosaminidase for group A
and α-galactosidase for group B (Figure 1). This latter
enzyme, extracted from coffee beans23, was used clinically
for the first time over 20 years ago at the New York Blood
Center when it successfully produced small quantities of
B→O converted blood cells24 which, following labelling
with 51Cr, were transfused without consequences25: the
physical and functional characteristics of these cells
remained unchanged and their survival was normal even
after repeated administrations26. The studies continued with
transfusion of whole units of converted B→O units into
normal A and O volunteers27,28 without any clinical or
laboratory signs of reaction developing, except for an
occasional increase in anti-B titre, which did not
compromise erythrocyte survival or expected increases in
haemoglobin even after transfusion of further converted
units29.
Finally, in 2000, a randomised, phase II, clinical study
was carried out in non-immunised, transfusion-dependent,
adult, group A or O patients who were transfused randomly
with B→O converted units or control units of group O red
blood cells30. Forty-one units of B red cells were manipulated
with a recombinant version of the α-galactosidase enzyme
derived from coffee beans; the antigenic conversion was
checked by diagnostic monoclonal antisera of murine origin.
The mean haemoglobin concentration of the B→O blood,
identical prior to treatment to that of the group O control
units, dropped by 11% during the enzymatic conversion
procedure, probably as a result of washing. The mean
increase in Hb in the patients per unit of converted B→O
red cells transfused was 5% lower than that produced by
the O control units. The in vivo safety and efficacy of the
transfusion of the B→O converted blood was confirmed,
but some in vitro serological abnormalities similar to those
observed in the phase I clinical studies were found25-29.
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ABO, ma ha anche rivelato come le strutture antigeniche
possano apparire e scomparire durante la normale
differenziazione cellulare e come epitopi, che sono di norma
profondamente indovati, riappaiano in superficie qualora,
in corso di neoplasie, vi sia un difetto di espressione genica
e/o di attività enzimatica22.
Da ciò deriva il tentativo di convertire emazie A e B in
emazie O (Erythrocyte Conversion in O, ECO) rimuovendo
i rispettivi zuccheri immunodominanti (NacGal e Gal)
mediante appropriate esoglicosidasi di origine non batterica:
αN-acetilgalattosaminidasi per il gruppo A e α-galattosidasi
per il gruppo B (Figura 1). Quest'ultimo enzima, ricavato da
semi verdi di caffè23, venne utilizzato a scopo clinico per la
prima volta oltre vent'anni fa al New York Blood Center per
ottenere con successo piccole quantità di emazie B→O
convertite24 che poi, previa marcatura con 51Cr, furono
trasfuse senza conseguenze25: esse mantenevano intatte
le loro caratteristiche fisiche e funzionali e la loro
sopravvivenza rimaneva normale anche dopo ripetute
somministrazioni26. Gli studi proseguirono con la
trasfusione di intere unità di emazie B→O convertite in
volontari normali A e O27,28 senza che si verificasse alcun
segno clinico o laboratoristico di reazione, fatta eccezione
per occasionali aumenti del titolo anti-B, che, comunque,
non compromettevano la sopravvivenza eritrocitaria e gli
incrementi emoglobinici attesi anche in caso di trasfusione
di ulteriori unità convertite29.
Nel 2000 è stato finalmente realizzato uno studio clinico
random di fase II su pazienti adulti trasfusione-dipendenti
non immunizzati di gruppo A o O, cui sono state
somministrate casualmente unità di emazie B→O convertite
e unità di controllo di gruppo O30. Quarantuno unità di
emazie B sono state trattate con una versione ricombinante,
ricavata da semi di caffè, dell'enzima α-galattosidasi;
l'avvenuta conversione è stata controllata con antisieri
diagnostici monoclonali di origine murina. La
concentrazione emoglobinica media delle emazie B→O,
sovrapponibile prima del trattamento a quella delle unità di
controllo di gruppo O, si è abbassata dell'11% dopo il
processo di conversione enzimatica, probabilmente a causa
del lavaggio. L'incremento medio di Hb nei pazienti per
unità B→O trasfusa è risultato del 5% inferiore rispetto alle
unità di controllo O. La sicurezza e l'efficacia in vivo della
trasfusione di emazie B→O convertite sono state
confermate, ma sono state parimenti riscontrate in vitro
alcune anormalità sierologiche simili a quelle osservate negli
studi clinici di I fase25-29. Cinque dei diciannove pazienti
che hanno ricevuto emazie B→O convertite hanno
sviluppato un significativo incremento del titolo anti-B, e
due di essi hanno dimostrato crossmatch incompatibili
227
F Morelli
Five of the nineteen patients who received B→O converted
red cells developed a significant increase in anti-B titre,
and two of these showed incompatible antiglobulin
crossmatching with the same B→O blood cells.
The first finding probably reflects an immune response
to a modest residue of B epitopes (0.8 x 106 present on the
red cell membrane before enzyme treatment), whose weak
antigenic expression does not, however, cause appreciable
haemolysis. More complicated, and potentially more
worrying, are the causes of the second problem: residual B
epitopes or neoantigens? Although the enzyme removes
the terminal galactose of the P1 and Pk globular antigens,
no cryptic antigen as ever been revealed so far25. On the
other hand, if the exogalactosidase cannot remove the
galactose from the less accessible oligosaccharide chains,
the same conformation which protects from enzymatic
attack could provide antigenic configurations less readily
recognisable by the immune system. Alternatively,
antibodies that recognise characteristics in common
between A and B antigens ("A, B" epitopes) could play a
role31.
It is clear that B→O red cell conversion alone would
not constitute a significant advantage in either financial
terms of increasing blood resources or in terms of improving
transfusion safety. Although a small percentage of B units
reaching expiry could be recuperated by enzymatic B→O
conversion, thus increasing available resources, the minimal
saving obtained would not cover the cost of the enzyme
treatment. Furthermore, the production of B→O and AB→A
converted blood would not prevent the sometimes fatal
complications of ABO transfusion errors. The beneficial
effect of enzyme treatment will only be fully appreciated if
large scale total conversion of red cell collections to group
O can be achieved, and for this to happen group A units
must also be amenable to enzyme treatment.
Unfortunately, the biochemical complexity of the A
antigen has created unexpected problems. The first attempts
to transplant ABO-incompatible solid organs go back to
the 1960s. These attempts were unsuccessful. However,
since the waiting list of group O patients was very long,
both because of the general lack of organs and because of
the use of group O organs for non-O recipients, at the
beginning of the 1970s the first clinical attempts to
overcome the ABO barrier were made, using organs with
low expression of incompatible antigens: A2→O, A2B→B.
It was precisely then that it was demonstrated that the
expression of A antigens on the red cells of A2 individuals
was much weaker than that of A1 individuals32.
Furthermore, experiments on skin transplants showed
that O recipients immediately rejected skin transplants from
228
all'antiglobulina con le stesse emazie B→O.
Il primo dato probabilmente riflette una risposta immune
a un modesto residuo di epitopi B (presenti in numero di
0,8 x 106 sulla superficie eritrocitaria prima del trattamento
enzimatico), la cui debole espressione antigenica non
sembra comunque determinare emolisi apprezzabile. Più
oscure, e potenzialmente preoccupanti, le cause del
secondo problema: residui B o neoantigeni? Sebbene
l'enzima utilizzato rimuova anche il galattosio terminale degli
antigeni globosidici P1 e Pk, non è mai stato rivelato finora
alcun antigene criptico 25 . D'altra parte, se la
esogalattosidasi non riesce a rimuovere il galattosio dalle
catene oligosaccaridiche meno accessibili, la stessa
conformazione che protegge dall'attacco enzimatico
potrebbe fornire configurazioni antigeniche meno
direttamente riconoscibili dall'apparato immunitario. Oppure
potrebbero avere un ruolo anticorpi che riconoscono
caratteristiche comuni ad A e B (epitopi "A, B")31.
È evidente che la conversione eritrocitaria B→O da sola
non costituirebbe un significativo vantaggio né in termini
economici di aumento della risorsa sangue né in termini di
miglioramento della sicurezza trasfusionale. Sebbene una
piccola percentuale di unità B che giungono a scadenza
potrebbe, mediante la conversione enzimatica B→O, essere
recuperata, incrementando così le risorse disponibili,
l'esiguo risparmio ottenuto non coprirebbe il costo del
trattamento enzimatico. Inoltre, la produzione di emazie
convertite B→O e AB→A non consentirebbe di prevenire
le talvolta fatali complicanze dell'errore trasfusionale ABO.
L'effetto benefico del trattamento enzimatico si
apprezzerebbe pienamente soltanto con la totale
conversione su larga scala della raccolta eritrocitaria al
gruppo O, e per ottenere ciò è necessario avviare anche le
unità A al trattamento enzimatico.
Malauguratamente, la complessità biochimica
dell'antigene A ha creato imprevedibili problemi. Fin dagli
anni '60 erano stati tentati i primi trapianti ABO-incompatibili
di organi solidi con esito negativo. Tuttavia, poiché la lista
di attesa per i pazienti di gruppo O era molto lunga a causa
sia della carenza generale di organi sia dell'uso di organi di
gruppo O per riceventi non-O, all'inizio degli anni '70
vennero effettuati i primi tentativi clinici di superare la
barriera ABO, usando organi con antigeni incompatibili di
bassa espressività: A2→O, A2B→B. Proprio allora era stato
dimostrato che l'espressività degli antigeni A sulle emazie
di individui A2 era molto più debole rispetto agli A132.
Inoltre, gli esperimenti di trapianto cutaneo avevano
dimostrato che riceventi O rigettavano immediatamente la
pelle trapiantata da individui A1 e B, mentre il rigetto
iperacuto non si verificava se il lembo cutaneo proveniva
Blood Transf 2003; 3: 224-43
Universal RBCs
A1 and B donors, while hyperacute rejection did not occur
with skin flaps from A2 subjects. Ceppellini et al. predicted,
as would be later confirmed, that it would be possible to
carry out solid organ transplants successfully from A2
subjects to O recipients33.
We now know that A1 subjects not only express
quantitatively more A epitopes in tissues than do the A2
subjects, but there are also qualitative differences between
the two subgroups. The gylcosyltransferase of A1
individuals uses all four types of chains as precursors when
adding the immunodominant sugar to the H substance,
whereas the A2 gylcosyltransferase can only use type 1
and 2 chains34.
It can be seen from the biosynthetic pathway of the A
and B antigens that expression of A antigens will be
strongest in A1 secretors, while expression in A2 nonsecretors is minimal because it is based mainly on type 2
chains. Since the action of the B glycosyltransferase is
probably limited to type 1 and 2 chains, it is probable that
B subjects, like A2 ones, also express less antigen35.
The α-N-acetylgalactosaminidase enzyme is not as
readily available as the α-galactosidase. The New York
Blood Center purified it from chicken liver and was then
able to convert A2 blood cells into O cells, while the A1
specificity was only partially weakened36. Subsequent
studies led to the hypothesis that the A epitopes on red
cells differed not only by their sensitivity to enzyme
treatment, but also by the nature of the immune response
they cause. When A erythrocytes were incubated for two
hours with enzyme at a concentration of 0.1 UI/mL,
complement-mediated immune haemolysis and reactivity
with the lectin of Dolichos biflorus were abolished, while,
in parallel, agglutination with the anti-H lection of Ulex
europaeus increased; however, the agglutinating capacity
of monoclonal and polyclonal anti-A antisera was only
partially attenuated, despite incubation with enzyme
concentrations up to 10 UI/mL37! Since this antigenantibody bond triggers the complex series of cell and
biochemical events which characterise the ABO
incompatibility tranfusion reactions38, it was necessary not
only to determine the optimal conditions (concentration,
incubation, etc.) of the enzyme treatment, but also to examine
its efficacy on the single stages of the immune response
with appropriate tests. To this end, a purified exo-α-Nacetylgalactosaminidase, obtained from the IX-70 strain of
the commensal intestinal bacterium Ruminococcus torques,
was used39; group A red blood cells treated with different
concentrations of the enzyme and untreated control A red
cells were first put into contact with monoclonal anti-A
antibodies and then examined to evaluate their capacity to
Blood Transf 2003; 3: 224-43
da soggetti A2. Ceppellini et al.predissero, come in effetti
si sarebbe constatato, che sarebbe stato possibile eseguire
con successo trapianti di organi solidi da soggetti A2 a
riceventi O33.
Oggi sappiamo che gli individui A1 non solo esprimono
un maggior numero di epitopi A nei tessuti rispetto ai
soggetti A2, ma che tra i due sottogruppi vi è anche una
differenza qualitativa. La glicosiltrasferasi degli individui
A1, nell'aggiungere lo zucchero immunodominante alla
sostanza H, usa tutti e quattro i tipi di catene come
precursore, mentre la glicosiltrasferasi A2 può utilizzare
solamente i tipi 1 e 234.
Lo schema biosintetico degli antigeni A e B consente
di stabilire che la più forte espressività degli antigeni A si
estrinsecherà negli individui A1 secretori , mentre in quelli
A2 non secretori essa sarà minima, perché basata
principalmente sulle catene di tipo 2. Poiché anche l'azione
della glicosiltrasferasi B è probabilmente limitata alle catene
di tipo 1 e 2, è verosimile che anche i soggetti B, come gli
A2, esprimano una minor quantità di antigene35.
Lo stesso enzima α-N-acetilgalattosaminidasi non è così
facilmente disponibile come l'α-galattosidasi. Il New York
Blood Center lo ha purificato dal fegato di pollo e con esso
è stato possibile trasformare emazie A2 in emazie O, mentre
la specificità A1 veniva solo parzialmente indebolita36. Da
studi successivi è stato ipotizzato che gli epitopi A sui
globuli rossi differissero tra loro non solo nella sensibilità
al trattamento enzimatico, ma anche nella natura della
risposta immune da essi evocata. Incubando emazie A per
due ore con una concentrazione enzimatica di 0,1 UI/mL
era possibile abolire l'emolisi immune complemento-mediata
e la reattività con la lectina di Dolichos biflorus, mentre,
parallelamente, si incrementava l'agglutinazione con lectina
anti-H di Ulex europaeus; tuttavia, la capacità agglutinante
di antisieri monoclonali e policlonali anti-A veniva solo
parzialmente attenuata, nonostante l'incubazione con
concentrazioni enzimatiche fino a 10 UI/mL37! Poiché questo
legame antigene-anticorpo innesca la complessa serie di
eventi cellulari e umorali che caratterizzano le reazioni
trasfusionali da incompatibilità ABO38, era dunque
necessario non soltanto determinare le modalità ottimali
(concentrazione, incubazione ecc.) del trattamento
enzimatico, ma anche esaminarne l'efficacia sulle singole
fasi della risposta immunitaria con test appropriati. A tale
scopo, è stata utilizzata un'eso-α-N-acetilgalattosaminidasi
purificata, ottenuta dal ceppo IX-70 del batterio enterico
commensale Ruminococcus torques39, ed emazie A trattate
con diverse concentrazioni di enzima, contestualmente ad
emazie di controllo A non trattate, sono state, prima, messe
a contatto con anticorpi anti-A monoclonali e, poi,
229
F Morelli
stimulate immunoadherence (rosetting) and
erythrophagocytosis, in monocytic and
polymorphonuclear cell cultures. The same two populations
of blood cells were also incubated with serum and whole
group B and group A blood (to evaluate, respectively,
complement-mediated haemolysis and the capacity to
stimulate the production of TNFα) and with polyclonal
diagnostic antisera of human origin (to check the A typing
and titre the agglutination)40. The results confirmed that
enzymes concentrations similar to those reported
previously37, and appropriate for abolishing complementmediated immune haemolysis and reactivity with Dolichos
biflorus lectin, could eliminate even the A determinants of
the membrane responsible for the interaction with
monocytes and macrophages, as shown by the loss of
rosetting and immune activation of these latter cells. The
loss of immune activation was demonstrated by the lack of
TNFα release and the disappearance of
erythrophagocytosis. In contrast, the antigenic A
determinants involved in the reaction with polyclonal
antibodies were more resistant to the enzyme treatment40.
This information can be interpreted by considering the
topography of the ABH antigens on the surface of the red
blood cell. The antigens are situated at the end of
oligosaccharide chains of different lengths, and extend for
various distances outside the membrane, from the 18 Å of
the double layer glycolipids, to the 100-150 Å of the polyN-acetyl-lactosamine of the most extended glycoproteins;
the epitopes on the O-glycans and N-glycans of the
glycophorins and band 3 and 4.5 glycoproteins are at
intermediate distances. The result is that the ABH antigens
are organised in rows or layers, most of which are thought
to be arranged on the most external branched part of the
glycocalyx. Furthermore, the epitopes extending furthest
outwards are uniformly distributed on the red cell membrane
at an average distance of about 80 Å from each other, while
the more internal epitopes are closer to each other (30 Å)41.
The more external layer, formed of the A epitopes on the
peak of the long polylactosamine chains, is very probably
the one more involved in antibody binding with anti-A IgG
and IgM: the antigen-antibody complexes, in their turn,
trigger rosetting and immune activation of the monocytes,
activation of the complement cascade and
haemagglutination. The destruction, even only partial, of
this layer can make the binding with anti-A IgG more
difficult (the Fc part of the IgG binds to monocyte receptors)
and the bond with anti-A IgM more unstable (this is the
complex that activates complement); nevertheless, a
sufficient number of sites may remain to enable these latter
230
esaminate per verificare la loro capacità di stimolare
immunoaderenza (rosetting) ed eritrofagocitosi, in colture
cellulari di monociti e polimorfonucleati. Le stesse due
popolazioni di emazie sono state, inoltre, incubate con siero
e con sangue in toto di gruppo B e O (per valutarne
rispettivamente l'emolisi complemento-mediata e la capacità
stimolante la produzione di TNFα) e con antisieri diagnostici
policlonali di origine umana (per controllarne la tipizzazione
A e titolarne l'agglutinazione)40. I risultati confermano che
concentrazioni di enzima simili a quelle riferite in
precedenza37, e idonee ad abolire l'emolisi immune
complemento-mediata e la reattività con la lectina di
Dolichos biflorus, sono in grado di eliminare pure i
determinanti A di membrana responsabili dell'interazione
con le cellule monocito- macrofagiche, come si evince dalla
perdita di immunoaderenza e di attivazione immune da parte
di queste ultime, rivelata dal mancato rilascio di TNFα e
dalla scomparsa dell'eritrofagocitosi. Al contrario, i
determinanti antigenici A coinvolti nella reazione con gli
anticorpi policlonali si rivelano alquanto più resistenti al
trattamento enzimatico40.
Questi dati possono essere interpretati facendo
riferimento alla topografia degli antigeni ABH sulla
superficie del globulo rosso. Essi si trovano al termine di
catene oligosaccaridiche di differente lunghezza, e si
estendono a diverse distanze all'esterno della membrana,
dai 18 Å dei glicolipidi del doppio strato fino ai 100-150 Å
delle poli-N-acetil-lattosamine delle glicoproteine più
estese; a distanze intermedie stanno gli epitopi sugli Oglicani e sugli N-glicani delle glicoforine e delle
glicoproteine di banda 3 e 4.5. Ne risulta una distribuzione
a file o a strati degli antigeni ABH, la cui maggior parte si
ritiene sia dislocata sulla parte più esterna e ramificata del
glicocalice. Inoltre, gli epitopi che si spingono più all'esterno
sono uniformemente distribuiti sulla membrana eritrocitaria
a una distanza media gli uni dagli altri di circa 80 Å, mentre
gli epitopi più interni sono più ravvicinati tra loro (30 Å)41.
Lo strato più esterno, costituito dagli epitopi A collocati
sulla cima delle lunghe catene polilattosaminiche, è molto
probabilmente quello più coinvolto nel legame anticorpale
con IgG e IgM anti-A: i complessi antigene-anticorpo, a
loro volta, innescano l'immunoaderenza e
l'immunoattivazione dei monociti, l'attivazione della cascata
complementare e l'emoagglutinazione. La sua distruzione,
anche parziale, può rendere difficile il legame con le IgG
anti-A, la cui porzione Fc si lega ai recettori monocitari, e
instabile quello con le IgM anti-A, che attivano il
complemento, ma può residuare un numero di siti sufficiente
a far sì che quest'ultime grandi molecole pentavalenti si
Blood Transf 2003; 3: 224-43
Universal RBCs
large pentavalent molecules to bind to adjacent red blood
cells thus allowing agglutination40. Furthermore, the A
epitopes on the type 3 chains anchored to glycolipids are
arranged "repetitively"22,42: although the one in a more
external position may be removed by the exo-α-Nacetylgalactosaminidase, the more internal determinant
probably remains intact, despite the use of a co-adjuvant
endoglycosidase27 (Figure 1). However, studies on the
conformation of the A antigen indicate that the external
determinant might itself not be completely accessible to
enzymatic action because it can be found tucked under the
head group - in its turn folded towards the membrane - of
the type 3 A chain43.
The research on enzymatic removal of A determinants
is still underway: it is not possible to hypothesise a future
for the production of universal O blood by enzymatic
conversion until a biochemical solution is found to this
problem.
leghino a emazie adiacenti consentendo così
l'agglutinazione40. Inoltre, sulle catene di tipo 3 ancorate ai
glicolipidi, gli epitopi A sono posizionati in maniera
"ripetitiva"22,42: se quello in posizione più esterna può essere
rimosso dall'eso-α-N-acetilgalattosaminidasi, il
determinante più interno rimane verosimilmente intatto,
nonostante l'utilizzo di un'endoglicosidasi coadiuvante27
(Figura 1). Comunque, studi sulla conformazione antigenica
A indicano che anche lo stesso determinante esterno
potrebbe essere non del tutto accessibile all'azione
enzimatica, in quanto si troverebbe infilato sotto il gruppo
di testa - a sua volta ripiegato verso la membrana - delle
catene A di tipo 343.
Le ricerche sulla rimozione enzimatica dei determinanti
A proseguono: non è possibile ipotizzare un futuro per la
produzione di emazie universali O mediante conversione
enzimatica, finché non si riuscirà a trovare una soluzione
biochimica al problema.
Camouflaged or "stealth" red blood cells
Emazie mascherate o invisibili
The enzymatic removal of antigenic epitopes or
potential binding sites on the surfaces of red blood cells is
desirable in order to prevent alloimmunisation and to make
red cells resistant to microbial or parasitic attack44,45.
Nevertheless, this type of approach is severely limited
by the availability of the enzymes with the required
specificities. So far it has only been possible to remove B
antigen specifically and efficiently. Although there are other
proteases and glycosidases able to remove other antigens,
their action compromises the structural and functional
integrity of the red blood cells: for example, although
neuraminidase-mediated destruction of the sialic acid
terminals of glycoproteins interferes with malarial infection,
blood treated in this way would be immediately eliminated
from the circulation46,47.
The studies to achieve group O blood by enzymatic
removal of A and B antigens have spanned over about
twenty-five years, but in the second half of the 1990s
various groups of researchers struck out in a different
direction. They tried to make red blood cells invisible to
the immune system by masking the antigenic membrane
sites with a neutral polymer, polyethylene glycol (PEG).
The aims were to prevent transfusion reactions in already
immunised subjects and any new alloimmunisation
events48-52. The advantage of camouflaging antigens with
PEG rather than removing them would be that a single
treatment could mask most or even all of the surface
La rimozione enzimatica di epitopi antigenici o di
potenziali siti di legame sulla superficie dei globuli rossi
può essere auspicabile per prevenire l'alloimmunizzazione
o per rendere le emazie resistenti ad attacchi microbici o
parassitari44,45.
Tuttavia, questo tipo di approccio viene ad essere
fortemente limitato dalla disponibilità di enzimi per le
specificità richieste. Abbiamo visto come finora sia stato
possibile rimuovere specificamente ed efficacemente il solo
antigene B. Sebbene esistano altre proteasi e glicosidasi in
grado di rimuovere altri antigeni, la loro azione compromette
l'integrità strutturale e funzionale degli eritrociti: ad esempio,
la distruzione dei terminali di acido sialico delle glicoproteine
mediante neuraminidasi interferisce con l'infezione malarica,
ma le emazie così trattate sarebbero immediatamente
eliminate dal circolo46,47.
Se gli studi per ottenere emazie di gruppo O mediante
rimozione enzimatica degli antigeni A e B sono in corso da
circa venticinque anni, nella seconda metà degli anni '90
diversi gruppi di ricercatori hanno tentato di ottenere dei
globuli rossi invisibili per il sistema immunitario,
mascherando i loro siti antigenici di membrana con un
polimero neutro, il polietilenglicole (PEG), nell'intento di
prevenire sia reazioni trasfusionali in soggetti già
immunizzati sia eventuali nuove alloimmunizzazioni48-52. Il
vantaggio del camuffamento con PEG rispetto alla rimozione
enzimatica risiederebbe nel fatto che con un singolo
Blood Transf 2003; 3: 224-43
231
F Morelli
molecules with a role in the blood group systems and in
attachment sites.
Previous studies had clearly demonstrated the lack of
toxicity of long PEG polymers, exceeding 400 Dalton (D)
(unlike the short chain molecules, used in refrigerator
circuitry, which are extremely toxic!) and since the 1940s it
has been known that PEG (1 and 6 kD) administered
intravenously is rapidly eliminated in the urine without
producing any demonstrable harmful effects53-55.
In 1977 it was shown that bovine albumin could be
made non-immunogenic if PEG were bound covalently to
its surface56; furthermore, the protein treated in this way
retained a normal in vivo survival and was not toxic57,58.
Since then many other purified proteins have been
conjugated with PEG to reduce their immunogenicity and
have been studied clinically: PEG-superoxide dismutase
and PEG-catalase to reduce reperfusion lesions in areas of
ischaemia59, PEG-asparaginase for the treatment of acute
leukaemias60, PEG-adenosine deaminase in the cure of
SCID61, PEG-bilirubin oxidase for jaundice62, and PEGhaemoglobin as a replacement for red blood cells63,64.
Furthermore, PEG has been bound to many other types of
molecules and surfaces, such as arterial grafts65, tissue
transplants matrices including Langerhans cells 66,
liposomes67 and drugs68.
PEG is a non-ionic polyether, whose fundamental
chemical structure is HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH. It can
be defined chemically as a polyoxide of ethylene69. It exists
in an extraordinary variety of molecular weights (from 100
to 8 million g/mole) and spatial configurations (linear,
branched, stellate). The linear forms can terminate at one
extremity with a methyl group (monomethoxypolyethylene
glycol: mPEG); the branched ones (bPEG) have 3 to 10
branches attached to a central linear axis; the stellate PEG
(sPEG) have a divinylbenzene ring carrying up to 100 arms.
PEG is a neutral compound. It is soluble in most organic
solvents and, above all, in water, with which it forms
hydrogen bonds in the ratio of three molecules of water for
each unit of ethylene oxide, while the hydroxyl group, which
does not become methylated, is available for covalent
reactions with proteins, through the action of binding
reagents. Thus in aqueous solution every molecule of PEG
becomes surrounded by a large hydration sphere70.
It should not, however, appear contradictory that PEG
was used in the past in Transfusion Medicine for an
apparently opposite aim, that is as an additive potentiating
antigen-antibody reactions in pre-transfusion compatibility
tests71,72. Added in appropriate concentrations to serum
and diluted red blood cells, its characteristic action of
232
trattamento verrebbero mascherate la maggior parte, o
addirittura tutte, le molecole di superficie che hanno un
ruolo nei sistemi gruppoematici e nei siti di attacco.
Studi precedenti avevano chiaramente dimostrato
l'assenza di tossicità del PEG di lunghezza polimerica
superiore ai 400 Dalton (D) (al contrario le molecole a catena
corta, usate nei circuiti refrigeranti, sono molto tossiche!) e
fin dagli anni '40 era noto che PEG (1 e 6 kD) somministrato
in vena veniva rapidamente eliminato per via urinaria, senza
manifestare alcun effetto dannoso53-55.
Dal 1977 era stato evidenziato che l'albumina bovina
poteva essere resa non immunogena, se alla sua superficie
veniva legato PEG in maniera covalente56; inoltre, la proteina
così trattata conservava una normale sopravvivenza in vivo
e si dimostrava non essere tossica57,58. Da allora, molte
altre proteine purificate sono state coniugate con PEG
per ridurne l'immunogenicità e sono state studiate
clinicamente: PEG-superossidodismutasi e PEG-catalasi
per ridurre le lesioni da riperfusione in aree ischemiche59,
PEG-asparaginasi nel trattamento delle leucemie acute60,
PEG-adenosindeaminasi nella cura della SCID61, PEGbilirubinaossidasi per gli itteri62, PEG-emoglobina come
sostituto eritrocitario63,64. Inoltre, il PEG è stato legato a
molti altri tipi di molecole e superfici, quali innesti arteriosi65,
matrici per trapianti di tessuti come le cellule di Langerhans66,
liposomi67 e farmaci68.
Il PEG è un polietere non ionico, la cui struttura chimica
di base è la seguente: HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH; esso
può essere definito, in termini chimici, un poliossido di
etilene69. Esiste in una straordinaria varietà di pesi molecolari
(pm) (da 100 a 8 milioni g/mole) e di configurazioni spaziali
(lineari, ramificate, stellari). Le forme lineari possono
terminare a un'estremità con un gruppo metilico
(monometossipolietilenglicole: mPEG); quelle ramificate
(branched) hanno da 3 a 10 braccia innestate su un asse
centrale lineare (bPEG); le stellari consistono di un anello
divinilbenzenico dal quale si dipartono fino a 100 braccia
(sPEG). Il PEG ha carica neutra ed è solubile in gran parte
dei solventi organici e, soprattutto, in acqua, con cui forma
legami idrogeno nella misura di tre molecole d'acqua per
unità di ossido di etilene, mentre il gruppo idrossilico, che
non viene metilato, è disponibile per le reazioni covalenti di
coniugazione con le proteine, mediante l'azione di reagenti
leganti. Pertanto, in soluzione acquosa ogni molecola di
PEG si circonda di una larga sfera di idratazione70.
Non deve, tuttavia, apparire contraddittorio che il PEG
sia già stato utilizzato in passato in Medicina Trasfusionale
per uno scopo apparentemente opposto, ossia come
additivo potenziante le reazioni antigene-anticorpo
Blood Transf 2003; 3: 224-43
Universal RBCs
Figura 2 - The PEG density gradient (horizontal grey lines) acts as a sort a sieve: the smaller molecules (O 2, CO2, glucose,
ions, polypeptides pass the membrane, while the large protein molecules are blocked. The antigen camouflage and
the antigen-antibody interaction blocking depend on the polymer dimension, on the antigen topography and on the
class of immunoglobulin. On the left, are represented the protective "shell" acted by PEG of various molecular
weight (2, 5, 20 kD) on some antigen determinants (ABH, Rh, Kidd, Ss). Rh antigens are located near the membrane
surface and are, therefore, easily covered by 5 kD-PEG. Only 20 kD-PEG can effectively camouflage external
antigens, as ABH, Kidd e Ss
removing water, due to its strong hydrophilicity, manages
to create space around the red blood cells and thus
efficiently concentrates the antibody molecules, helping
them to approach the cells and attach to them, and, in many
cases, increasing the strength of the reaction 73,74.
Excessively high concentrations of PEG can even cause
precipitation of plasma proteins giving rise to false positive
results75.
However, bond covalently - by two types of binding
reagents, cyanide chloride (CN) (also known as
dichlorotriazine) and the N-hydroxysuccinimidylester of
methoxypolyethylene glycol propionic acid (SPA) (also
known as bispropionyl-N-hydroxysuccinimide) - to
proteins (for example, those of the red cell membrane), it
covers them with a protective "shell" of PEG+water
molecules70.
This steric barrier has a density gradient and acts as a
sort of molecular sieve, excluding large protein molecules,
such as antibodies, but allowing the passage of smaller
molecules such as glucose, amino acids and oxygen,
essential for cell metabolism76 (Figure 2). This notably
reduces both the reactions between antibodies and red
cells and those between cells (red cells-red cells and red
cells-phagocytes)51,77.
Blood Transf 2003; 3: 224-43
nell'esecuzione delle prove di compatibilità pretrasfusionale71,72.
Aggiunto in opportuna concentrazione al siero e alle
emazie diluite, a causa della sua caratteristica azione di
rimuovere acqua perché fortemente idrofilo, riesce a creare
più spazio intorno al globulo rosso e, quindi, a concentrare
efficacemente le molecole anticorpali, facilitandone
l'avvicinamento e l'attacco alle cellule, aumentando anche,
in molti casi, la forza della reazione73,74.
Concentrazioni troppo alte di PEG possono addirittura
determinare una precipitazione delle proteine plasmatiche
con conseguenti risultati falsamente positivi75. Unito invece
in maniera covalente - mediante due tipi di reagenti leganti,
il cloruro di cianuro (CN) (noto anche come diclorotriazina)
e l'N-idrossisuccinimidilestere dell'acido
metossipolietilenglicolpropionico (SPA) (noto anche come
bispropionil-N-idrossisuccinimide) - alle proteine (per
esempio a quelle della membrana eritrocitaria), le copre sotto
un "guscio" protettivo formato da PEG+molecole d'acqua70.
Questa barriera sterica ha un gradiente di densità e
agisce come una sorta di setaccio molecolare, che esclude
grandi molecole proteiche, come gli anticorpi, e lascia
passare molecole più piccole, come glucosio, aminoacidi e
ossigeno, essenziali al metabolismo cellulare76 (Figura 2).
233
F Morelli
The efficacy of this immunological camouflage depends
on various factors: these include, on the one hand, the
density and topography of the antigenic determinants on
the cell membrane as well as the availability of sites for
covalent bonds and, on the other hand, the size and shape
of the PEG molecules used. Furthermore, any benefit of
this technology is subject not only to its efficacy but also,
and more importantly, to its in vivo safety and
biocompatibility.
Between the spring of 1996 and the first few months of
1997 no fewer than 4 groups of researchers, one in Korea
and three in the United States, published scientific articles
on PEG-RBC48-52. The Korean group have not continued
research in this field, while the three American groups (from
the University of Alabama, Albany Medical College of New
York and the University of South California of Los Angeles
in collaboration with the local Red Cross) provided new
contributions and details on their attempts78-82. The results
were concordant and fairly encouraging. The covalent bond
with the PEG, mediated by CN or SPA, did not have any
harmful effects on cell structure or biological functions of
the red blood cells at concentrations of PEG able to block
the antigenic sites efficiently. The RBC morphology and
deformability were not affected, the oxidation status of Hb
and its P50 were not modified, and cation and anion
homeostasis (Na+, K+ and SO4- flows) were maintained at
concentrations of PEG 5kD from 0.6 mM (0.3%) to 2.4 mM
(1.2%). Unfortunately, using these concentrations, the PEGRBC were rapidly eliminated from the circulation, while
good in vivo survival of the camouflaged murine red cells
only occurred when concentrations of PEG 5kD no
exceeding 0.4 mM (0.2%) were used. Unfortunately, using
CN-PEG 5kD, concentrations of at least 1-5 mM (0.5-2.5%)
were necessary to obtain an effective block of the antigens
(including the ABO ones) on human red cells, which could
be demonstrated in vitro.
However, the Albany group demonstrated that sheep
PEG-RBC injected into mice produced a greatly attenuated
immune response: about 90% less antibody was produced
in these mice than in control mice injected with untreated
sheep RBC79. It had to be accepted that the immediate aim
of research on PEG-RBC cannot yet be to produce
"universal red blood cells", but only antigenically and
immunologically attenuated erythrocytes with an almost
normal half-life that could be exploited in chronically
transfused patients and/or those with rare phenotypes in
order to prevent reactions against non-ABO antigens80.
The Los Angeles group demonstrated that
camouflaging cells with PEG drastically reduced
234
Vengono così notevolmente ridotte sia le interazioni tra
anticorpi ed emazie sia le interazioni tra cellule (emaziaemazia ed emazia-fagocita)51,77.
L'efficacia di questo mascheramento immunologico
dipende da alcuni fattori: essi comprendono, da un lato, la
densità e la topografia dei determinanti antigenici sulla
membrana nonché la disponibilità di siti per il legame
covalente e, dall'altro, la taglia e la forma delle molecole di
PEG utilizzate. Ogni benefico effetto di questa tecnologia è
condizionato, inoltre, non solamente dalla sua efficacia, ma
anche (anzi, in primo luogo) dalla sua sicurezza e
biocompatibilità in vivo.
Tra la primavera del 1996 e i primi mesi del 1997 ben 4
gruppi di ricercatori, uno in Corea e tre negli Stati Uniti,
hanno pubblicato i primi lavori scientifici sui PEG-RBC48-52.
Il gruppo coreano non ha continuato i suoi studi in
quest'area, mentre i tre gruppi americani, rispettivamente
dell'Università dell'Alabama, dell'Albany Medical College
di New York e dell'Università della South California di Los
Angeles in collaborazione con la locale Croce Rossa, hanno
fornito ulteriori nuovi contributi e dettagli sui loro
tentativi78-82. I risultati sono stati concordi e abbastanza
confortanti. Il legame covalente mediato da CN o da SPA
con il PEG non aveva alcun effetto dannoso sulla struttura
cellulare e sulle funzioni biologiche dei globuli rossi a
concentrazioni di PEG in grado di assicurare un efficace
blocco dei siti antigenici. La morfologia e la deformabilità
eritrocitarie non venivano influenzate, lo stato di
ossidazione dell'Hb e la sua P50 non venivano modificati,
l'omeostasi di cationi e anioni (flussi di Na+, K+ e SO4-) era
conservata a concentrazioni di PEG 5kD da 0,6 (0,3%) a 2,4
mM (1,2%). Purtroppo, usando queste concentrazioni, i
PEG-RBC venivano rapidamente eliminati dal circolo, mentre
si otteneva una buona sopravvivenza in vivo delle emazie
murine camuffate solamente quando venivano usate
concentrazioni di PEG 5kD non superiori a 0,4 mM (0,2%).
Sfortunatamente, usando CN-PEG 5kD, erano necessarie
concentrazioni di almeno 1-5 mM (0,5-2,5%) per ottenere
un effettivo blocco degli antigeni sulle emazie umane
(compresi quelli ABO), dimostrabile in vitro. Tuttavia, il
gruppo di Albany ha dimostrato che PEG-RBC di pecora
iniettati in topi provocano una risposta immunitaria
fortemente attenuata: viene prodotto circa il 90% di
anticorpi in meno rispetto ai topi di controllo che ricevevano
emazie di pecora non trattate79 Si è dovuto, dunque,
prendere atto che l'obiettivo immediato della ricerca sui
PEG-RBC non poteva ancora essere quello di produrre delle
"emazie universali", ma soltanto degli eritrociti
antigenicamente e immunologicamente attenuati e di emivita
Blood Transf 2003; 3: 224-43
Universal RBCs
aggregation and, consequently, the viscosity of red cells
resuspended in plasma, and extended the potential
indications for PEG-RBC to pathological conditions
characterised by vaso-occlusive events or flow disorders,
such as myocardial infarction or sickle cell crises51.
The laboratory of the Southern California Region branch
of the American Red Cross was the first to use classical
routine methods now employed in blood banks (including
the indirect antiglobulin test and flow cytometry) and has
studied PEG of various molecular weights (5, 15 and 18.5
kD), reaching the conclusion that best antigen masking is
obtained with mixtures of PEG of different molecular weights
(18.5 + 3.35 kD at a concentration of 1.3 mM)52,81. However,
various problems arose with all the first generation PEG
when the RBC were subject to normal pre-transfusion tests:
after incubation for 30'-60' with compatible plasma, PEGRBC non-specifically adsorbed proteins (IgG and IgM),
which were detected by the indirect Coombs' test and flow
cytometry82 and would have shortened the cells' survival
in vivo83. Furthermore, some normal sera contained antiPEG antibodies which agglutinated with the treated cells84
and, in ABO incompatibility tests, complement-lysing
capacity was not reduced, but indeed increased85.
Many of the above-mentioned problems have been
overcome by using second generation PEG. The Alabama
group first used a bifunctional compound of PEG (SPAPEG-SPA), incubated and crosslinked with albumin, called
X-PEG78 and then a branched PEG (4-branched PEG-SPA)
combined with albumin86. The Los Angeles group, using a
mixture of branched PEG (4-branched PEG 20 kD at a
concentration of 1mM + 4-branched PEG-amine 10 kD at
2mM), obtained PEG-RBC that maintained a discoid shape
and which did not agglutinate with anti-A, anti-B and antiD antisera even in the anti-globulin test87,88. It was, therefore,
clear that antigenic determinants close to the cell surface
(for example, Rh antigens), even when present in large
amounts, can be effectively masked by short chain
polymers, while more external antigens (for example,
MNSsU on glycophorins) require longer chains (Figure 2).
Furthermore, very branched polymers may be more efficient
because they create a denser exclusion zone, thus better
preventing existing antibodies from approaching and
binding to the cell. It is, therefore, understandable that a
combination of the above molecules could act
synergistically to provide better overall protection89.
From the point of view of safety, the lack of toxicity of
PEG-RBC was further confirmed by murine
hypertransfusion in which the PEG-RBC formed up to 80%
of the red cell mass of the mice, which thus received a dose
Blood Transf 2003; 3: 224-43
quasi normale che avrebbero potuto essere
vantaggiosamente utilizzati in pazienti cronicamente trasfusi
e/o di fenotipo raro per prevenire reazioni verso antigeni
non-ABO80. Gli studi del gruppo di Los Angeles hanno
dimostrato che il mascheramento con PEG riduce
drammaticamente l'aggregazione e, di conseguenza, la
viscosità delle emazie risospese in plasma, e hanno esteso
le potenziali indicazioni dei PEG-RBC a condizioni
patologiche caratterizzate da eventi vaso-occlusivi o da
difficoltà di flusso, quali l'infarto miocardico e le crisi
falcemiche51.
Il laboratorio della Croce Rossa Americana della
Southern California Region per primo ha utilizzato i metodi
classici di routine in uso nelle banche del sangue (tra cui il
test indiretto all'antiglobulina e la citometria a flusso) e ha
studiato PEG a diverso peso molecolare (5, 15 e 18,5 kD),
arrivando a stabilire che si ottenevano i migliori risultati di
mascheramento antigenico con miscele di PEG di differente
pm (18,5 + 3,35 kD a concentrazione 1,3 mM)52,81. Applicando
i normali test pre-trasfusionali emergevano, però, svariati
problemi con tutti i PEG di prima generazione: emazie trattate
con PEG, dopo incubazione per 30'-60' con plasma
compatibile, adsorbivano aspecificamente proteine (IgG e
IgM), che venivano rivelate col test di Coombs indiretto e
in citofluorimetria82 e che avrebbero potuto ridurne la
sopravvivenza in vivo83. Alcuni sieri normali contenevano,
poi, anticorpi anti-PEG che agglutinavano le emazie trattate84
e, nell'incompatibilità ABO, la capacità lisante del
complemento non veniva ridotta, ma anzi risultava
aumentata85.
Molti dei suddetti problemi sono stati superati usando
PEG di seconda generazione. Il gruppo dell'Alabama ha
dapprima usato un composto bifunzionale di PEG (SPAPEG-SPA), incubato e crosslinked con albumina, chiamato
X-PEG78 e poi un PEG ramificato (4-branched PEG-SPA)
combinato con albumina86. Il gruppo di Los Angeles,
usando una miscela di PEG ramificati (4-branched PEG 20
kD a concentrazione 1mM + 4-branched PEG-amine 10 kD
a 2mM), è riuscito a ottenere dei PEG-RBC con morfologia
discocitica mantenuta, non agglutinabili da antisieri antiA, anti-B e anti-D, anche in test all'anti-globulina87,88. Risulta,
pertanto, evidente da tutte queste esperienze che
determinanti antigenici vicini alla superficie cellulare (ad
esempio, antigeni Rh), anche se presenti in gran numero,
possono essere efficacemente mascherati da polimeri a corta
catena, mentre altri antigeni più esterni (per esempio
MNSsU sulle glicoforine) richiedono catene più lunghe
(Figura 2). Inoltre, polimeri altamente ramificati possono
risultare più efficaci perché forniscono una zona di
235
F Morelli
of CN-mPEG of 6.7g/kg of body weight, without developing
behavioural disturbances or post-mortem changes79,89.
Since a hypothetical unit of PEG-RBC should contain from
about 13 to 25 g of PEG, the dose infused into a patient
would correspond to that administered without any
problems to healthy volunteers during clinical trials with
PEG-Hb89,90.
Recently, the Albany Medical College group, in an
attempt to characterise, quantify and control the biophysical
and immunological effects of this new technology in the
light of its subsequent clinical application in Transfusion
Medicine, reported having improved its PEG-RBC, using a
mPEG with a higher molecular weight (20 kD) and using
benzotriazobylcarbonate (BTC), rather than CN, as the
binding molecule91.
All the chemical bonds used to allow mPEG to fix
covalently to the cells interact with the ε-amine groups of
lysine radicals of the membrane proteins. Although sharing
the same site of action, CN-PEG, SPA-PEG and BTC-PEG
have different reaction times: however, if the incubation
period of the RBC is extended from 30 minutes to one hour,
they are all equally efficient91. This was proven by testing
the three preparations of PEG with two different techniques,
already used in the past to study the properties of the red
cell surface92 and treating proteins and liposomes with
PEG93: particellar electrophoresis and polymer separation
in an aqueous two-phase (PEG/dextran) system. Using the
same methods it was possible to demonstrate that the
efficacy of the camouflage depends on both the polymer
density (mM) and its molecular mass (kD). The first method
revealed that PEG treatment notably weakened electrical
charges on the red cell surface, thus slowing electrophoretic
mobility; the second method demonstrated the PEG-RBC's
particular affinity for the upper part (PEG phase) of the
system, while the untreated or not completely linked cells
remained at the interface (the two polymers do not mix) or
precipitated into the dextran layer. Using longer PEG chains
(20 kD), electrophoretic immobility was achieved and the
gradient of separation was higher (due to the greater affinity
for the upper phase) at molar concentrations (2 mM) which,
surprisingly, corresponded to excellent in vivo survival of
the treated cells and better masking capacity91. So, at
Albany, it really can be said that "size does matter"91!
Furthermore, the data from these relatively simple
investigations suggest that the production and purification
of PEG-RBC is biotechnology that could be applied
efficiently and cost-effectively in all transfusion centres.
In fact, one critical aspect of the potential use of PEG-RBC
is how to separate the correctly modified cells (i.e. not
236
esclusione più densa che meglio impedisce l'avvicinamento
e il legame di anticorpi pre-esistenti. Di conseguenza, è
comprensibile che una combinazione delle suddette
molecole possa agire sinergicamente così da fornire una
migliore protezione globale89.
Sul versante della sicurezza, l'ipertrasfusione murina ha
ulteriormente ribadito l'assenza di tossicità dei PEG-RBC,
che sono arrivati a costituire fino all'80% della massa
eritrocitaria dei topi, i quali sono giunti dunque a ricevere
una dose di CN-mPEG pari a 6,7g/kg di peso senza disturbi
comportamentali né alterazioni autoptiche79,89. Poiché
un'ipotetica unità di PEG-RBC dovrebbe contenere da 13 a
25 g circa di PEG, la dose così infusa a un paziente sarebbe
corrispondente a quella somministrata senza alcun
inconveniente a volontari sani nel corso di trials clinici
con PEG-Hb89, 90.
Recentemente, il gruppo dell'Albany Medical College,
nell'intento di caratterizzare, quantificare e controllare
l'effetto biofisico e immunologico di questa nuova
tecnologia in vista di una sua successiva applicazione
clinica in Medicina Trasfusionale, ha riferito di aver
migliorato i suoi PEG-RBC, usando un mPEG a più alto
peso molecolare (20 kD) e impiegando, come molecola
legante, benzotriazobilcarbonato (BTC) invece di CN91.
Tutti i leganti chimici utilizzati per consentire al mPEG
di fissarsi covalentemente alle cellule interagiscono con i
gruppi ε-aminici dei radicali lisinici delle proteine di
membrana. Pur condividendo il medesimo sito d'azione, CNPEG, SPA-PEG e BTC-PEG manifestano differenti tempi di
reazione: tuttavia, portando il tempo di incubazione con gli
eritrociti da 30 minuti a un'ora, si dimostrano ugualmente
efficienti91. Ciò è stato provato testando le tre preparazioni
di PEG con due diverse tecniche, già utilizzate in passato
per studiare le proprietà della superficie eritrocitaria92 e il
trattamento con PEG di proteine e liposomi93: l'elettroforesi
parcellare e un sistema di separazione polimerico (PEG/
destrano) in doppia fase acquosa. Con le medesime
metodiche è stato anche possibile dimostrare che l'efficacia
del mascheramento dipende sia dalla densità del polimero
(mM) sia dalla sua massa molecolare (kD). Con il primo
metodo, il trattamento con PEG rivela un notevole effetto
attenuante sulle cariche elettriche di superficie dei globuli
rossi, rallentandone, di conseguenza, la mobilità
elettroforetica; con la seconda tecnica, i PEG-RBC
evidenziano una particolare affinità per la parte superiore
(fase PEG) del sistema, mentre le emazie non trattate, o non
completamente linked, rimangono all'interfaccia (i due
polimeri non si mescolano) o precipitano nello strato di
destrano. Usando PEG di lunghezza maggiore (20 kD), si
Blood Transf 2003; 3: 224-43
Universal RBCs
immunogenic) from those not completely modified (and,
thus, still immunogenic). The abovementioned study shows
how it would be possible to exploit the biophysical changes
induced in PEG-treated red cells to recover, easily, rapidly
and selectively, only those cells truly masked: the
completely PEG-linked cells would be first separated in the
two phase system, because they partition into the upper
layer, and would then be recovered by saline dilution (to
decrease the viscosity) and brief centrifugation91. This
simple method could easily be developed and automated
for large scale production, as has already been done for
the purification of enzymes produced by microorganisms94.
The reduced immunogenicity of the PEG-RBC, found
in vivo by the Albany group, does not seem to be
exclusively due to the antigen-masking, but could derive
in part from the low concentrations of m-PEG preventing
monocytes from phagocytosing the foreign cells, thus
altering the process of antigen presentation79. In fact, PEG
treatment of white blood cells with PEG (PEG-WBC), and in
particular antigen-presenting cells (APC) and T
lymphocytes, surprisingly prevented the recognition of
HLA class II foreign molecules and lymphocyte
proliferation in response to foreign HLA antigens. This
was demonstrated in mixed lymphocyte cultures:
mononuclear cells (obtained from the peripheral blood of
subjects with incompatible class II HLA antigens) treated
with mPEG inhibited T-lymphocyte proliferation (measured
by tritiated-thymidine incorporation) in a dose-dependent
manner77. The phenomenon was not due to a possible toxic
effect of the PEG, since cells stimulated with
phytohaemagglutinin proliferated normally, while the
addition of interleukin-2 did not have any effect, suggesting
that the PEG-lymphocytes were not antigen-primed. On
the other hand, the PEG-RBC also showed some cell
interaction abnormalities: rouleaux formation, and
consequently the erythrocyte sedimentation rate,
decreased considerably91. In conclusion, masking
adhesion, recognition and co-stimulatory molecules of
allogeneic cells (APC and T lymphocytes) with PEG
weakens the stimulation of alloreactive T lymphocytes,
leading them to apoptosis, and would contribute, through
a mechanism of clonal deletion, to establishing a state of
immunological tolerance95. Experimental studies on rat
pancreatic island cells treated with mPEG and then
transplanted, showed that engraftment and cell and/or
tissue function were not altered95.
The potential impact of these studies on transfusion
and transplant practices is clear. Besides the scenario
Blood Transf 2003; 3: 224-43
raggiungono uno stato di immobilità elettroforetica e un
incremento del gradiente di separazione (dovuto all'aumento
dell'affinità per la fase superiore) a concentrazioni molari (2
mM) cui, sorprendentemente, corrisponde un'ottimale
sopravvivenza cellulare in vivo e una migliore capacità
mascherante91. Ad Albany, dunque, possono ben dire che
"la taglia conta davvero" (size does matter)91!
Inoltre, i dati ottenuti mediante queste relativamente
semplici metodiche suggeriscono come la produzione e la
purificazione dei PEG-RBC sia una biotecnologia che
potrebbe essere applicata in maniera efficiente e
remunerativa in ogni struttura trasfusionale. Infatti, un
punto critico della potenziale utilizzazione clinica dei PEGRBC è la separazione delle cellule correttamente modificate
(e, quindi, non immunogene) da quelle non completamente
modificate (e, perciò, ancora immunogene). Nel suddetto
studio si dimostrerebbe come sia possibile sfruttare i
cambiamenti biofisici indotti sulle emazie dal trattamento
con PEG per recuperare in maniera semplice, rapida e
selettiva solo emazie realmente mascherate: le cellule
completamente PEG-linked verrebbero prima separate, nel
sistema in doppia fase, perché si raccolgono nello strato
superiore, e, poi, recuperate mediante diluizione in salina
(per diminuire la viscosità) e centrifugazione a basso numero
di giri91. Questa semplice metodica potrebbe facilmente
essere sviluppata e automatizzata a livello produttivo su
larga scala, come è stato fatto in precedenza per la
purificazione di enzimi prodotti da microrganismi94.
La ridotta immunogenicità dei PEG-RBC, riscontrata in
vivo dal gruppo di Albany, non sembra essere dovuta
esclusivamente al camuffamento degli antigeni, ma
deriverebbe in parte dall'incapacità, indotta da basse
concentrazioni di m-PEG, di fagocitare le cellule estranee
da parte dei monociti, alterando così il processo di
presentazione dell'antigene79. Infatti, il trattamento con PEG
dei globuli bianchi (PEG-WBC), in particolare delle cellule
presentanti l'antigene (APC) e dei linfociti T,
sorprendentemente previene il riconoscimento di molecole
estranee HLA di classe II e la proliferazione linfocitaria in
risposta ad antigeni HLA estranei. Ciò è stato dimostrato
in coltura linfocitaria mista: cellule mononucleate (ottenute
da sangue periferico di soggetti incompatibili per antigeni
HLA di classe II) trattate con mPEG inibivano la
proliferazione T-linfocitaria (misurata mediante
incorporazione di timidina-tritiata) in maniera dosedipendente77. Il fenomeno non era dovuto ad eventuale
effetto tossico da parte del PEG, in quanto le cellule,
stimolate con fitoemagglutinina, proliferavano
normalmente, mentre l'aggiunta di interleuchina-2 non
237
F Morelli
outlined in the introduction, it would perhaps become
possible to prevent tissue or organ rejection without being
reliant life-long on immunosuppressive drugs which,
although effective, have considerable side effects. PEG
treatment of the donor's "passenger" lymphocytes,
contaminating blood components and bone marrow, would
prevent GvHD and immune recognition, while "pegylation"
of the vascular endothelium of a donated organ or tissue
would at least attenuate, if not completely abolish, acute
and chronic rejection79. The recipient's immune system
would remain fully competent, thus avoiding the risk of
developing infections and second tumours95, and it would
not be necessary to inactivate (irradiate) or remove (filtrate)
the leucocytes from blood components77. Finally, unlike
other methods, such as blocking antibodies or soluble
ligands, camouflaging the RBC with PEG would provide
simultaneous and global inhibition of sites and cell
metabolic pathways, thus being more efficient and costeffective. As already mentioned, PEG treatment of the red
cell membrane could represent a new method for treating
and/or preventing malaria: blood removal and then
transfusion with PEG-RBC in patients with cerebral malaria
would not only dramatically reduce blood viscosity in the
microcirculation51, but would also prevent further red cell
invasion by the plasmodium, rapidly diminishing the
dangerous parasitaemia and, above all, maintaining it at a
low level because glycophorin A, carrying the Duffy
antigens and the receptors for the plasmodium, would be
covered by the PEG shell96.
Conclusions
The field of research is exciting, the dedication of the
researchers considerable, the progress continuous and the
prospects thrilling.
The research on PEG-RBC started more recently and is,
therefore, less advanced than that on ECO: there are not
yet controlled experimental in vivo data from animal and
human studies to confirm the initial exciting results. On the
other hand, the problem of A→O conversion must be
resolved in order to obtain ECO. If all this achieved, "stealth"
blood cells and "converted" ones will become rivals, at
least as far as concerns the large scale prevention of ABO
incompatibility errors. The PEG-RBC would perhaps be a
better product because of their complete immunological
"inertia", and would be of great benefit in particular
situations in which no other compatible blood components
were available. However, at present, it seems far-sighted to
238
sortiva alcun effetto, suggerendo che i PEG-linfociti non
fossero antigen-primed. D'altra parte, anche i PEG-RBC
rivelano anomalie nelle interazioni tra cellule: la capacità di
formare rouleaux e, di conseguenza, la velocità di
eritrosedimentazione (VES) diminuiscono
considerevolmente91.
In conclusione, il mascheramento con PEG delle
molecole di adesione, riconoscimento e co-stimolazione
delle cellule allogeniche (APC e linfociti T) indebolirebbe
la stimolazione di linfociti T alloreattivi, inducendoli così
all'apoptosi, e contribuirebbe, mediante un meccanismo di
delezione clonale, ad instaurare uno stato di tolleranza
immunologica95. Studi sperimentali su cellule insulari
pancreatiche di ratto trattate con mPEG e trapiantate
dimostrerebbero, peraltro, che l'attecchimento e la funzione
di masse cellulari e/o tessutali non vengono alterati95.
È evidente il potenziale impatto di questi studi sulla
pratica trasfusionale e trapiantologica.
Oltre a quanto prospettato nell'introduzione,
diventerebbe forse possibile prevenire il rigetto di tessuti
od organi trapiantati senza dover utilizzare per tutta la vita
farmaci immunosoppressori, efficaci ma gravati da
importanti effetti collaterali. Il trattamento con PEG dei
linfociti "passeggeri" del donatore, contaminanti
emocomponenti e midollo osseo, consentirebbe di prevenire
la GvHD e il riconoscimento immune, mentre la
"pegilazione" dell'endotelio vascolare dell'organo o del
tessuto donato potrebbe, quanto meno, attenuare, se non
abolire, il rigetto acuto e cronico79.
Il sistema immunitario del ricevente rimarrebbe pienamente
competente, evitandogli il rischio di sviluppare infezioni e tumori
secondari95, e non sarebbe più necessario inattivare
(irradiazione) o rimuovere (filtrazione) i leucociti dagli
emocomponenti77.Infine,ilcamuffamentoconPEG,adifferenza
di altri metodi (anticorpi bloccanti o ligandi solubili), conferirebbe
una inibizione simultanea e globale di siti e percorsi metabolici
cellulari, risultando più efficace e cost-effective.
Come è stato accennato in precedenza, la modificazione
con PEG della membrana eritrocitaria potrebbe
rappresentare un nuovo metodo per il trattamento e/o la
prevenzione della malaria: l'exanguino-trasfusione con PEGRBC nella malaria cerebrale consentirebbe non solo di
ridurre drammaticamente la viscosità ematica nel
microcircolo51, ma anche di prevenire ulteriori invasioni
eritrocitarie da parte dei plasmodi, diminuendo acutamente
parassitemie pericolose e, soprattutto, mantenendole a
bassi livelli, in quanto la glicoforina A, vettore degli antigeni
Duffy e dei recettori per i plasmodi, verrebbe ricoperta dal
guscio di PEG96.
Blood Transf 2003; 3: 224-43
Universal RBCs
talk of synergy rather than competition. The combined
application of both methods would produce truly universal
red blood cells, which would be minimally or not at all
immunogenic and reactive with ABO antigens ABO
(enzymatic conversion) and non-ABO ones (PEG), and
which would have excellent flow properties (PEG). It would
then become possible to foresee that our transfusion
activities would include a production line for supplying
high quality red blood cell components, in which, besides
stages of leucoreduction and viral inactivation, there would
also be stages of enzymatic conversion and PEG treatment.
Leucoreduction by pre-storage filtration is already a
widespread practice, although its global use remains
controversial97; inactivation of pathogens is undergoing
clinical trials98; enzymatic conversion and "pegylation"
could produce O-converted and "stealth" blood
appropriate for the transfusion of universal, safe, high
quality red cells. There would no longer be the problems of
optimising collection procedures, storage, red cell typing
and incompatibility testing. The main work of our
transfusion units would cease to be retesting ABO
phenotypes on units of blood, but would become the
development and maintenance of strict controls of quality
and rigorous good manufacturing practices to avoid
episodes of acute haemolysis, no longer due to exchanges
of test-tubes or clerical errors, but to incomplete enzymatic
removal of the ABO antigens or imperfect masking of other
polymorphisms99.
Blood Transf 2003; 3: 224-43
Conclusioni
Il campo di ricerca è appassionante e l'impegno degli
studiosi notevole, i progressi sono continui e le prospettive
entusiasmanti.
Gli studi sui PEG-RBC sono più recenti e, quindi, meno
avanzati di quelli sulle ECO: mancano ancora dati
sperimentali controllati in vivo su animali e nell'uomo che
permettano di confermare le promesse iniziali. D'altra parte,
per ottenere ECO è necessario risolvere il problema della
conversione A→O. Se tutto ciò si realizzerà, emazie
"invisibili" ed emazie "convertite" diventeranno rivali,
almeno per quanto riguarda la prevenzione su larga scala
degli incidenti da incompatibilità ABO. I PEG-RBC
costituirebbero forse un prodotto migliore per la loro totale
"inerzia" immunologica, e sarebbero di grande beneficio in
situazioni particolari, in cui nessun altro emocomponente
compatibile fosse disponibile. Tuttavia, allo stato attuale
delle conoscenze, appare lungimirante parlare di sinergia
piuttosto che di competizione. L'applicazione combinata di
entrambe le metodiche potrebbe consentire di ottenere
emazie veramente universali, scarsamente o per niente
immunogene, non reattive con anticorpi diretti verso
antigeni ABO (conversione enzimatica) e non-ABO (PEG),
e oltretutto dotate di proprietà di flusso ottimali (PEG).
Diventerebbe, allora, possibile prevedere, nel prossimo
futuro dell'attività delle nostre strutture trasfusionali, una
linea di produzione di emocomponenti eritrocitari di qualità,
nella quale, oltre alle fasi di leucoriduzione e di inattivazione
virale, subentrino le fasi di conversione enzimatica e di
trattamento con PEG. La leucoriduzione mediante filtrazione
pre-storage è ormai diffusa, anche se la sua estensione
totale è controversa97; l'inattivazione dei patogeni sta
affrontando la fase dei clinical trials98; la conversione
enzimatica e la "pegilazione" potrebbero produrre emazie
O-convertite e invisibili adatte ad una trasfusione
eritrocitaria universale, sicura e di qualità. Non vi sarebbero
più problemi di ottimizzazione della raccolta e di
conservazione delle scorte, di tipizzazione eritrocitaria e di
incompatibilità. Il lavoro principale delle nostre strutture
trasfusionali non sarebbe più quello di ricontrollare il
fenotipo ABO sulle unità di sangue, ma diventerebbe lo
sviluppo e il mantenimento di severi controlli di qualità e di
rigorose good manifacturing practices, per evitare episodi
emolitici acuti dovuti non più a scambi di provette o a
clerical errors, ma a incompleta rimozione enzimatica degli
antigeni ABO o a imperfetto mascheramento degli altri
polimorfismi99.
239
F Morelli
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