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Parassiti intestinali Protozoi intestinali Elm inti - E
Parassiti intestinali Protozoi La diagnostica parassitologica (parassitiintestinali) Elm inti A m oebe Trem atodi Flagellati Cestodi Ciliati Laboratorio M icrobiologia e Virologia A zienda ospedaliera U niversitaria CareggiFirenze M icrosporidi Blastocystis Elm inti Protozoi intestinali A m oeba N em atodi Coccidi A .O rsi Flagellati Ciliati Coccidi M icrosporidi E.histolytica G.intestinalis B.coli C.parvum E.bieneusi E.dispar D .fragilis I.belli E.intestinalis E.m oshkovskiiT.hom inis Sarcocystis sp E.coli C.m esnilii E.hartm anni Cyclospora E.nana E.polecki I.butschlii Platelm inti Trem atodi Cestodi N em atodi Schistosom a T.solium T.saginata D .latum H .nana A .lum bricoides E.verm icularis T.trichiura S.stercoralis A .duodenale N .am ericanus Filarie Larva m igrans T.spiralis Fasciolopsis O pistorchis Fasciola E.granulosus Paragonim us Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio m etoditradizionali ricerche dirette Protozoi(trofozoitie cisti) Elm inti (uova,larve,verm e) ricerche indirette A b specifici N em atelm inti ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI m etodinon tradizionali ricerche dirette antigeni acidinucleici preparazione delpaziente raccolta deicam pioni num ero deicam pioni trasporto allaboratorio diagnosicorretta tecniche adottate com petenze delpersonale 1 ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Preparazione delpaziente Solfato dibario ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Raccolta dei cam pioni Bism uto Caolino alm eno tre cam pionidifeci raccolti a giorni alterni O lim inerali A ntiparassitari antibiotici A ntidiarroicinon assorbibili non contam inare icam pionicon acqua e urina eseguire l’esam e dopo 1-2 settim ane ESA M E PA RA SSITO LO GICO D ELLE FECI Positività in pazientisintom aticiin relazione al num ero dicam pioniesam inati un cam pione ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Raccolta dei cam pioni 40-50% + 22,7% E.histolytica tre cam pioni +11,3% Giardia intestinalis tre cam pioni entro 10 giorni seicam pioni entro 14 giorni + 31,1% D .fragilis seicam pioni 90% E.histolytica ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Raccolta dei cam pioni (controllidopo terapia) Protozoi 3-4 settim ane Elm inti 1-2 settim ane Taenia 5-6 settim ane ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Conservazione e trasporto I cam pionidifecidevono: essere analizzatientro 30-60 m in oppure essere postiin soluzionifissative in rapporto 1 :3 entro 30-60 m in 2 ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Soluzioni fissative Form alina 10% M IF* cisti-uova-larve “ “ “ SA F° “ PVA ^ “ M etoditradizionali:ricerche dirette Esam e m acroscopico “ cisti-trofozoiti Schaudinn “ Fissativiecologici Esam e m icroscopico “ cisti-uova-larve-trofozoiti *m ertiolato-iodio-form alina °sodio acetato-ac.acetico-form alina ^ alcoolpolivinilico ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Esam e m acroscopico ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI M etoditradizionali:ricerche dirette Liquide: trofozoiti,oocisti,spore,uova consistenza a fresco diretto Sem iform ate :trofozoiti,cisti,oocisti,spore,uova Form ate : cisti,oocisti,spore,uova Esam e m icroscopico dopo concentrazione dopo colorazione sangue ,m uco verm iadultio loro fram m enti ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Esam e m icroscopico a fresco diretto trofozoitie cistidiprotozoi oocistidicoccidi uova e larve diElm inti ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Esam e m icroscopico a fresco vantaggi: m obilita’deiprotozoi em azie PM N L (processiinfiam m atori) eosinofili(risposta im m une) lim iti: non consente diagnosidispecie poco sensibile cristallidiCharcot-Leyden cellule vegetali,pollini, spore fungine fibre o pelianim ali 3 ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Es.m icroscopico dopo concentrazione Es.m icroscopico dopo concentrazione sedim entazione flottazione form alina\ etilacetato reagentiecologici solfato Zn N aCl saturo Vantaggi: m aggiore sensibilità Lim iti:specificità non m olto elevata doppia filtrazione ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI Es.m icroscopico dopo colorazione ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI colorazione tricrom ica ed em atossilina ferrica trofozoitie cistidiProtozoi tricrom ica em atossilina ferrica trofozoitie cistidiProtozoi Cryptosporidium sspp I.belliCyclospora sspp Kynioun Vantaggi: m aggiore specificità Lim iti:-uova e larve dielm intinon evidenziabili -oocistidiI.bellinon ben visibili -oocistidiCryptosporidium e Cyclospora W eber Van Gool m icrosporidi ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI non riconoscibili ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI colorazione per Coccidi:Kinyoun colorazione di Van Gool oocistidiCryptosporidium ,Cyclospora e I.belli spore diM icrosporidiintestinali Lim iti: -scarsa sensibilità (non rileva le infezionilievi) -difficile dd tra Cryptosporidium e Cyclospora -non rileva m icrosporidi fluorocrom o (U vitex B2) Vantaggi:facilità nelriconoscim ento delle spore Lim iti:-fecifissate in alcool70° -m icroscopio a fluorescenza filtri 355-450 -osservazione dipiù cam pioni 4 ESA M E PA RA SS ITO LO GICO D ELLE FECI colorazione di W eber Spore diM icrosporidiintestinali Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Tecniche particolari coltura H arada-M orisu carta da filtro tecnica diBaerm ann crom otrope 2R Vantaggi:feciin form alina o altrifissativi -rilievo dilarve diN em atodise presentiin scarso num ero Lim iti:-non dd tra E.bieneusie -dd tra S.stercoralis,A .duodenale,N .am ericanus E.intestinalis -preparatisottili(ilcolore non penetra ) -difficile riconoscim ento delle spore fecifresche non congelate Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Tecniche particolari Ricerca dello scolice diCestodi raccogliere le fecidelle 24 ore in form alina 10% filtrare attraverso garza osservare con lente ilsedim ento usando un fondo scuro per ilrilievo dello scolice coltura con tecnica diH arada-M ori Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Tecniche particolari Test diGraham o delnastro adesivo identificare m icroscopicam ente lo scolice Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio M etoditradizionali:indaginisierologiche -tecniche diverse (EIA ,IFA ,IH A ,IB) -poco utili: uova diEnterobius verm icularis scarsa sensibilità lim itata risposta im m unitaria dell’ospite alm attino appena svegli scarsa specificità antigeninon purificati applicare ilnastro adesivo all’area perianale per 30 secondi difficile interpretazione pazientiprovenientida aree endem iche distendere su vetrino portaoggetti 5 Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio M etoditradizionali:ricerche indirette D iagnosisierologica indaginisierologiche Schistosom a sspp* A m ebiasi extraintestinale Strongyloides stercoralis * Elisa :sensibile resta positivo per m oltianni Entam oeba histolytica** IH A :resta positivo a lungo m a titoli> 1:256 sono in genere significativi *difficile interpretazione :cross-reattività con altriElm inti; IFA :sensibile alto VPP titolielevatianche dopo trattam ento efficace necessaria una com pleta anam nesidelpaziente **poco utiliper la diagnosidiam ebiasiintestinale;validi per i casiextraintestinali Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Ricerca diantigeni M etodi alternativi - ricerca diantigeni - ricerca diacidinucleici M etodiim m unoenzim atici (E.histolytica,G.lam blia,Cryptosporidium ) se allestiticon A b m onoclonalii sono specificie sensibili consentono un gran num ero di determ inazioni M etodiim m unocrom atografici rapidi,specifici,sensibili (E.histolytica,G.lam blia,Cryptosporidium ) Im m unofluorescenza (G.lam blia ,Cryptosporidium ) A gglutinazione allatice (E.histolytica) antigenisuperficiali, riconscim ento più facile in corso distudio Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Ricerca di antigeni Ricera di antigeni Vantaggi: E histolytica (adesina:lectina) feci,fluido da ascesso E.histolytica /E.dispar gr siero (in corso distudio) Giardia lam blia feci,aspirato duodenale,siero Cryptosporidium feci Schistosom a sspp siero,urine m aggiore sensibilità e specificità rispetto alle ricerche m icroscopiche indica in genere infezione in atto o recente Lim iti: necessità dicam pioni raccoltiin m aniera diversa a seconda deim etodi 6 Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Ricerca di acidinucleici estrazione D N A PCR tradizionale M NP 1 am plificazione rivelazione Vantaggi: Lim iti: m aggiore sensibilità e specificità difficoltà diestrarre ilD N A da cam pionifecali facilità dicontam inazione Entam oeba hystolitica :D N A elettroforesi su geldiagarosio dopo PCR M m arker N negativo P positivo 1 cam pione feci tem pidiesecuzione lunghi costo elevato Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Ricerca diacidinucleici estrazione D N A PCR Real-tim e am plificazione e rivelazione (con sonde fluorescenti,contem poranee e autom atizzate) Vantaggi: riduce ilrischio dicontam inazione Parassitiintestinali:diagnosidilaboratorio Ricerca diacidinucleici E.histolytica E.histolytica,G.lam blia,C.parvum (m ultiplex) dim inuisce iltem po diesecuzione deltest se usata con tests m ultiplex consente ilrilievo contem poraneo ditarget differenticon un solo saggio dim inuisce icostideireagenticon test m ultiplex fornisce risultatiquantitativi Parassiti intestinali : diagnosi di laboratorio Il futuro automazione nell’estrazione del DNA dai campioni fecali implementazione dei test multiplex per altri parassiti diminuzione dei costi uso routinario dei tests molecolari in real-time 7
