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Studio di progettazione e ottimizzazione di nuove entità peptidiche con attività antimicrobica
Gli antibiotici rappresentano la classe di farmaci ad oggi più utilizzata, anche se nell’ultimo
decennio è in costante aumento il fenomeno della farmaco resistenza dei comuni batteri agli
antibiotici, causata forse da un uso sconsiderato o errato da parte dei medici. Alcuni microrganismi
appartenenti alla classe dei Gram-positivi, come lo Staphylococcus aureus, e batteri Gram-negativi,
Klebsiella e Escherichia coli, hanno sviluppato nel tempo meccanismi di multi-resistenza sempre
più potenti nei confronti dei comuni antibiotici utilizzati. Tutto ciò ha condotto all’esigenza e
all’interesse per lo sviluppo di nuovi farmaci che possano agire su batteri che sviluppano una o più
resistenze.
Il mio lavoro si inquadra dunque in un progetto volto alla ricerca di molecole peptidiche prodotte da
specie o di natura animale o vegetale che hanno mostrato possedere una spiccata attività
antimicrobica. Lo studio dei peptidi ad attività antimicrobica (AMPs) ha messo in evidenza che
questa classe di molecole non tende a sviluppare resistenza e risulta attiva anche contro ceppi
resistenti ai classici antibiotici, grazie ad un meccanismo d’azione completamente differente.
I peptidi antimicrobici (AntiMicrobial Peptides, AMPs) sono delle piccole molecole proteiche
costituite da 12-50 aminoacidi largamente diffuse in natura. Allo stato attuale si conoscono circa
2500 sostanze classificate come peptidi antimicrobici, che mostrano una spiccata attività
antimicrobica nei confronti di batteri sia Gram-positivi che Gram-negativi, lieviti del genere
Candida e sono inoltre in grado di inibire la replicazione di alcuni virus.
Il meccanismo d'azione degli AMPs è riconducibile all'alterazione delle membrane cellulari delle
cellule bersaglio a seguito dell’interazione tra il peptide, carico positivamente, e le strutture di
membrana dotate di carica netta negativa. Gli effetti che possono conseguire a tale interazione sono
di 2 tipi:
a) disorganizzazione della struttura della membrana, alterazione della permeabilità, fuoriuscita dei
componenti del citoplasma e lisi (distruzione) della cellula;
b) disposizione del peptide perpendicolarmente nella membrana, formazione di canali o "pori" e,
anche in questo caso, morte della cellula.
Pur variando considerevolmente nella dimensione e struttura secondaria, i peptidi antimicrobici
presentano caratteristiche comuni; la maggior parte presenta una carica netta positiva a pH neutro e
la tendenza a formare strutture anfipatiche in ambiente idrofobico, caratteristiche che consentono ai
peptidi di interagire con la membrana cellulare e distruggerne le normali funzioni formando canali
ionici o pori, dissolvendo la membrana come se fossero dei detergenti, o determinando la comparsa
di danni nella membrana stessa (Rinaldi A.C. et al., 2002).
La specificità degli AMPs verso le cellule procariotiche rispetto alle cellule eucariotiche è una
caratteristica molto importante. Il peptide è in grado di agire selettivamente in quanto ci sono delle
differenze di carica e di composizione tra le membrane citoplasmatiche degli eucarioti superiori e
quelle dei procarioti (batteri) e dei funghi. Le membrane cellulari batteriche risultano infatti formate
principalmente da una notevole quantità di fosfolipidi, quali fosfatidilserina, fosfatidilglicerolo e
bisfosfatidilglicerolo che sono carichi negativamente (Gidalevitz et al., 2003), mentre le membrane
delle cellule eucariotiche sono composte da fosfatidilcolina, sfingomielina e colesterolo, tutte
molecole che a pH fisiologico presentano carica pressoché neutra.
Diverse caratteristiche dei peptidi antimicrobici li rendono particolarmente interessanti come
potenziali strumenti terapeutici: ampio spettro di attività (sono attivi contro virus, batteri, funghi e
protozoi); rapida attività battericida (uccisione del 99,9% dei batteri a seguito di esposizione per 20
minuti); sono in grado di interagire sinergicamente con gli antibiotici convenzionali; sono efficaci
nei confronti di batteri che hanno sviluppato antibiotico-resistenza, in quanto possiedono
meccanismi d'azione differenti rispetto ad alcuni antimicrobici.
L’obiettivo del mio lavoro è stato la progettazione e l’ottimizzazione di nuove entità peptidiche con
attività antimicrobica. Il lavoro inizialmente è stato incentrato sullo studio delle diverse classi di
peptidi antimicrobici (vedi tabella sotto), esaminando le differenti tipologie strutturali (α-helical, βstranded, β-hairpin e conformazione estesa), per determinare quali fossero quelle che mostrassero le
migliori caratteristiche strutturali ed una migliore attività antimicrobica.
Peptide
MagaininII
Mellitin
MastoparanII
Indolicidin
CP11
hLFI-11
Pexiganan
Sequences
GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
IDWKKLLDAAKQIL
ILPWKWPWWPWRR
ILKKWPWWPWRRK
GRRRRSVQWCA
GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK
N-Terminal
C-Terminal
NH2 - COOH
NH2-CONH2
NH2-CONH2
NH2-CONH2
NH2-CONH2
NH2-CONH2
NH2-CONH2
Omiganan
ILRWPWWPWRRK
NH2-CONH2
Nella seconda fase del lavoro ci si è focalizzati su una determinata classe di peptidi antimicrobici,
partendo dalla quale sono stati progettati e sintetizzati 140 analoghi peptidici allo scopo di
ottimizzarne le proprietà e le attività contro i ceppi batterici di interesse.
Tutte le sequenze peptidiche sintetizzate sono state sottoposte a saggi biologici volti a testarne
l’azione antibatterica e la tossicità. Questo ha permesso di identificare le porzioni di sequenze
peptidiche capaci di generare strutture secondarie che efficacemente e selettivamente interagissero
con la membrana del batterio, causandone sia l’inibizione della crescita in coltura (minima
concentrazione inibitoria, MIC) che la morte effettiva (minima concentrazione battericida, MBC).
Le sequenze sono state sottoposte inoltre a studi di tossicità, attraverso saggio di proliferazione
cellulare eseguito su culture di cellule HeLa.
Parte sperimentale
Sintesi su fase solida dei peptidi
La sintesi dei peptidi è stata effettuata nei laboratori dell’IRBM Science Park usando la tecnologia
su fase solida FMOC/tBu chemistry, attraverso l’uso di sintetizzatore automatico Symphony su
scala variabile a seconda delle necessità del materiale da sintetizzare. I peptidi amido-terminali sono
stati sintetizzati a partire da 0.3g (100umol, loading 0.34mmol\g) di resina Fmoc-linker AMChampion, una resina PEG (polietilenglicol)-polistirene, 1% cross-linked derivatizzata con il linker
Rink p - [(R,S) - α - [9H-Fluoren-9-yl-methoxyformamido]- 2,4-dimethoxybenzyl] - phenoxyacetic
acid. Tutti gli aminoacidi sono stati disciolti ad una concentrazione di 0.3M in dimetilformammide.
Ciascuna reazione di acilazione è stata condotta per 60 min utilizzando 5 eccessi di aminoacido
attivato rispetto ai gruppi aminici liberi su resina. I 20 L-aminoacidi naturali necessari per queste
sequenze sono stati attivati con quantità equimolari di HBTU (2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3tetrametiluronio esafluorofosfato) e il doppio degli equivalenti di DIPEA (N,Ndiisopropiletilamina).
Per le acilazioni con maggiore difficoltà sintetica e per le quali è stato individuato un maggiore
potenziale di aggregazione, sono state utilizzate condizioni di sintesi più drastiche o attraverso
l’introduzione di doppi cicli di coupling o attraverso l’utilizzo di differenti reagenti di attivazione
della funzione carbossilica dell’aminoacido quali ad es. HATU (2-(7-Aza-1H-benzotriazole-1-yl)1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate).
Sblocco dei peptidi dalla resina
Il cleavage dei peptidi dalla resina e la deprotezione degli amminoacidi dai gruppi protettori in
catena laterale è stata effettuata aggiungendo alla resina, Fmoc-Off e seccata, 15mL di Miscela B
(5% H2O, 5% Phenol, 2% TIPS, 88% TFA) e lasciando in agitazione per 1.5h. I peptidi sono stati
quindi recuperati dopo precipitazione a freddo in Metil Butil Etere, seccati, sciolti in H2O allo 0.1%
di TFA e liofilizzati.
Purificazione dei crudi
Tutti i peptidi sono stati purificati attraverso cromatografia in fase inversa usando HPLC preparativi
su colonna XBridge C18 5um, 50x150mm, usando H2O, 0.1% TFA (A) e acetonitrile, 0.1% TFA
(B) come solventi, con diversi gradienti lineari (flusso 80 ml/min, λ: 214nm). Le frazioni con
purezza >90%-95% sono state poi raccolte e liofilizzate per ottenerne polveri facilmente
maneggiabili per testarne l’attività con saggi in vitro.
Per la caratterizzazione dei crudi e l’analisi dei prodotti liofili finali è stato utilizzato il sistema
analitico UPLC-MS della Waters. I campioni sono stati caratterizzati su colonna Acquity UPLC
BEH130 C18 2.1x100mm 1.7um o su colonna BEH300 C4 2.1x100 mm 1.7um usando H2O, 0.1%
TFA (A) e acetonitrile, 0.1% TFA (B) come solventi, con diversi gradienti lineari (flusso 0.4
ml/min, λ: 214nm, Temp 45°C).
Risultati conseguiti
I peptidi purificati sono stati sottoposti a due saggi di attività antimicrobica per misurare la minima
concentrazione inibente (MIC), che dà la misura della capacità del peptide di bloccare la crescita
batterica, e la minima concentrazione battericida (MBC) che definisce la minima concentrazione del
peptide capace di uccidere il batterio in coltura. Questi due saggi sono stati svolti nel Dipartimento
di Infectious, Parasitic and Immune-mediated Diseases dell’Istituto Superiore di Sanità.
hLF-11
Omiganan
Pexiganan
S.aureus
+
CP11
K.pneum
oniae -
Indolicidin
S.aureus
MRSA +
MastoparanII
P.aerugin
osa -
Mellitin
E.coli -
MagaininII
MIC
(μM)
MBC
E.faecalis
+
Peptide
S.aureus
MSSA +
Di seguito sono mostrati i valori di attività misurata in MIC e MBC per i capostipiti delle classi
antimicrobiche presi in esame all’inizio del nostro studio.
MIC
MBC
MIC
MBC
>52
*
3
3
>52
*
3
3
>52
*
4
4
>52
*
11
22
>52
*
3
3
>52
*
8
8
*
*
1
2
MIC
77
39
58
>77
77
>77
10
MBC
MIC
MBC
MIC
MBC
MIC
MBC
MIC
MBC
MIC
MBC
77
17
17
51
68
>93
>93
13
13
19
19
77
34
34
68
>68
>93
>93
36
>72
13
26
58
17
17
>68
*
>93
*
9
27
3
3
*
>67
*
51
>68
47
47
36
36
3
3
77
17
17
25
25
47
47
9
9
13
13
*
>67
*
>68
*
>93
*
>72
*
13
13
10
4
4
6
6
23
35
7
7
3
5
Prol.Assay
heLA (μM)
>10
1.1
31
19
65
>100
20
5.7
Accanto a questi due saggi primari, l’altro saggio che è stato effettuato è stato il saggio di
proliferazione cellulare eseguito su colture di cellule HeLa, cellule tumorali immortalizzate
altamente stabilizzate, molto utilizzato come test rapido di citotossicità nella routine della ricerca
scientifica (Prol.Assay heLA).
Progettazione, sintesi e caratterizzazione funzionale degli analoghi peptidici dell’Indolicidina
Sulla base dei risultati ottenuti esaminando le varie classi antimicrobiche, l’attenzione è stata poi
focalizzata sulla sequenza peptidica dell’Indolicidina, partendo dalla quale sono stati progettati e
sintetizzati (secondo il protocollo di sintesi, purificazione e caratterizzazione sovra descritto) 140
analoghi peptidici allo scopo di aumentarne l’attività contro i ceppi batterici di interesse e
diminuirne la citotossicità.
Pep155447
Indolicidin
S.aureus
MSSA +
E.faecalis
+
Peptide
MIC
(μM)
MBC
E.coli P.aerugun
osa S.aureus
MRSA +
K.pneumo
niae S.aureus
+
Molti di questi analoghi peptidici sintetizzati hanno mostrato aumentata attività antibatterica
rispetto all’Indolicidina, alcuni di questi una citotossicità paragonabile, altri una minore tossicità.
Tra tutti, quello che ha presentato una maggiore attività con diminuita citotossicità (vedi tabella
sotto) è il peptide Pep155447, sul quale verranno a breve condotti ulteriori studi di stabilità e
formulazione.
MIC
MBC
MIC
MBC
4
8
17
17
8
16
34
34
16
16
17
17
>64
NE
>67
*
4
32
17
17
48
>64
>67
*
2
4
4
4
Prol.Assay
heLA
(μM)
>50
19
Descrizione della struttura ospitante
IRMB Science Park Spa sita in Via Pontina km 30,600 00040 Pomezia (RM), Italy.
Il gruppo di proprietà privata IRBM, un gruppo industriale diversificato operante nel settore
biotecnologico e farmaceutico, è composto da IRBM, PROMIDIS, Advent e il Consorzio CNCCS.
IRBM è la società madre dedicata alla drug discovery e allo sviluppo preclinico in aree ad alto
fabbisogno terapeutico, comprese malattie neurodegenerative e malattie rare e trascurate. Il gruppo
opera all'interno di una struttura di 70.000 m2 di ricerca situato nei pressi di Roma, che ha aperto
nel 2009 come spin-off dell'Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa, poi
laboratori di ricerca Merck italiani. Aree di particolare competenza includono la drug discovery di
piccole molecole e peptidi, vaccini a base peptidica, ottimizzazione ADMET e lo sviluppo di
biomarker.
Riferimenti del tutor scientifico
Vincenzo Summa, Ph.D
Senior Executive Director Chemistry
IRBM Science Park Spa
Via Pontina km 30,600 - 00040 Pomezia (RM)
Ph. +39 0691093680 - Fax +39 0691093654
E-mail: [email protected]