Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

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Ricerche Microbiologiche: Procedure
Standard del Regno Unito
Identificazione di specie Moraxella e di Microrganismi
Morfologicamente Simili
Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Microbiologia - Identificazione I ID 11 I Emissione no: 3 I Data emissione: 03.02.15 I Pagina 1 di 28
© Crown copyright 2015
Identificazione di specie Moraxella e di Microrganismi Morfologicamente Simili
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità
Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito
web https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistencyin-clinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro
che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
https://www.gov.uk/government/groups/standards-for-microbiology-investigations-steeringcommittee).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori
di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si
ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website:https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-andconsistency-in-clinical-laboratories
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
I loghi sono aggiornati al momento della pubblicazione
Batteriologia – Identificazione I ID 11 I Emissione no: 3 | Data emissione:03.02.15 | Pagina: 2 di 28
UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England
Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL REGNO UNITO: SCOPO E
OBIETTIVO ........................................................................................................................6
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................9
INTRODUZIONE .........................................................................................................................9
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................17
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .......................................................................18
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO .....................................................................................18
3
IDENTIFICAZIONE ..........................................................................................................18
4
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE MORAXELLA E MICRORGANISMI
MORFOLOICAMENTE SIMILI .......................................................................................22
5
REFERTAZIONE ...........................................................................................................23
6
INVIO .............................................................................................................................23
7
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE .......................................................................23
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................25
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected].
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il
sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
7/03.03.15
Emissione eliminata. No.
2.4
Emissione inserita no.
3
Sezione(i) coinvolta
Modifica
Intero documento.
Collegamenti ipertestuali aggiornati al gov.uk.
Pagina 2.
Loghi aggiunti aggiornati.
Documento presentato in nuovo formato.
Riorganizzazione del testo.
Intero documento.
Edito per chiarezza.
Procedure di prova aggiornate.
Aggiornate le iformazioni per contattare il laboratorio di
Riferimento.
Scopo del documento.
Aggiornato lo scopo per includere collegamenti web per i
documenti ID 6, ID 12 e ID 17.
Aggiornata la tassonomia della specie Moraxella e di altri
microrganismi simili.
Introduzione.
Aggiunte altre informazioni alla sezione Caratteristiche. Le
specie clinicamente importanti sono state raggruppate e
descritte le loro caratteristiche.
Utilizzare la bibliografia aggiornata.
Sezione sui Principi d’identificazione è stata modificata per
chiarezza.
Informazione Tecnica/Limitazioni.
Considerazioni sulla sicurezza
Microrganismi bersaglio
Aggiunta d’informazioni relative a test dell’ossidasi e sono
stati descritti e referenziati i sistemi d’identificazione
commerciali.
Aggiunta bibliografia.
Testo riorganizzato.
La sezione sui microrganismi bersaglio è stata aggiornata e
presentata in modo chiaro. Bibliografia aggiornata.
Identificazione
Modifiche e aggiornamenti sono stati apportati a 3.1, 3.2, 3.3
e 3.4 che sono state aggiornate per riflettere gli standard
nella pratica.
Sottosezione 3.5 è stata aggiornata per includere i metodi
molecolari rapidi.
Diagramma di identificazione
Modificato il diagramma di flusso per l'identificazione di
specie per facilitare la consultazione
Refertazione
Le Sottosezioni 5.1 e 5.5 sono state aggiornate per adeguare
la procedura di refertazione.
Invio
Aggiornata l’informazione per contatto con il laboratorio di
riferimento
bibliografia
Bibliografia in parte aggiornata
Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito#:
Scopo e Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
• Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai
professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive.
• Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio
riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni
forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati.
• Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della
sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la
salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione.
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del
processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di
laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).
Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi
differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono
metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione
della prova.
La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo.
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS,
Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.
L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito https://www.gov.uk/ukstandards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories.
L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del
processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno
parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei
rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle
organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti
rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse
sono ricercate con un processo di consultazione.
Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione
#
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General
Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai
Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte
dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.
Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono
attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno
Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e
neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito.
Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche
addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti
dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere
verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo.
Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e
delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo
commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I
laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative
procedure del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento
dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari,
ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a
soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla
consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni
possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di
garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity.I
Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace
con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche
a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel
corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo
da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente
accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2015). Identification of Moraxella species and Morphologically Similar
Organisms. UK Standards for Microbiology Investigations. ID 11 Emissione 3.
https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-inclinical-laboratories
Scopo del Documento
Questa SMI descrive la procedura d’identificazione della specie Moraxella e di specie
morfologicamente simili.
Per differenziare le specie Moraxella dalle Neisseria consultare ID 6 – identification of Neisseria
species.
Le specie Acinetobacter possono erroneamente essere identificate come specie Moraxella e la
loro identificazione è descritta in ID 17 - Identification of Pseudomonas species and
morphologically similar organisms.
La specie Kingella è descritta in ID 12 - Identification of Haemophilus species and the HACEK
Group of Organisms.
Questa SMI dovrebbe essere usata congiuntamente alle altre SMI.
Introduzione
Tassonomia
I generi Moraxella (inclusa la precedente Branhamella), Acinetobacter, Psychrobacter,
Alkanindiges, Enhydrobacter, Paraperlucidibaca e Perlucidibaca appartengono ora alla famiglia
Moraxellaceae.
Il genere Moraxella è ora costituito da 22 specie diverse, che include M. catarrhalis, M. bovis, M.
lacunata, M. osloensis, M. nonliquefaciens, M. atlantae, M. lincolnii, M. ovis, M. caviae, M. canis,
M. equi, M. cuniculi, M. caprae, M. anatipestifer, M. bovoculi, M. oblonga, M. phenylpyruvica, M.
pluranimalium, M. porci, M. saccharolytica, M. urethralis e M. boevrei, che colonizzano gli esseri
umani e animali1. Il genere è in continua revisione, in seguito alla recente ristrutturazione, ponendo
le specie batteriche in generi diversi, ad esempio Moraxella phenylpyruvica così prima conosciuta,
è stata spostata nel genere Psychrobacter e classificata come Psychrobacter phenylpyruvica e
Moraxella urethralis nel genere Oligella ora nota come Oligella urethralis. M. anatipestifer è stato
riclassificata nel genere Riemerella come Riemerella anatipestifer.
Caratteristiche
Genere Moraxella2,3
Specie Moraxella sono bastoncini o cocchi Gram negativi, ma spesso manifestano tendenza a
resistere alla decolorazione. I bastoncini sono spesso molto brevi e coccoidi, assomigliando alla
forma di cocco 1,0-1,5 x 1.5 - 2.5 μm. Le cellule di solito si presentano in coppie o corte catenelle
con un solo piano di divisione. Il pleiomorfismo aumenta in mancanza di ossigeno e da
incubazione a temperature superiori a quelle ottimali. Le specie clinicamente importanti (a forma di
bastoncino) sono M. atlantae, M. lacunata, M. nonliquefaciens e M. osloensis.
Il cocchi sono generalmente più piccoli (0,6 - 1.0 μm di diametro) e si presentamo isolati o in
coppia con lati adiacenti appiattiti, e talvolta formano tetradi. Una specie assume importanza
clinica, M. catarrhalis.
Le cellule possono essere dotate di capsula. Non sono mobili e non aerobie, ma alcuni ceppi
possono crescere con difficoltà in condizioni anaerobiche. La maggior parte delle specie, tranne
Moraxella osloensis, presenta caratteristiche nutrizionali esigenti e la crescita sui terreni standard
può essere ridotta o assente; alcune sono stimolate in modo significativo dagli acidi grassi (sali
biliari, Tween 80). La temperatura ottimale di crescita è di 33-35° C. Le specie Moraxella sono di
solito catalasi e ossidasi positive e non producono acido dai carboidrati. Il nitrato può essere ridotto
o no.
Caratteristiche frequenti del genere Moraxella includono la mancanza di pigmentazione delle
colonie; colorazione Gram negativa dei coccobacilli morfologia bacillare (tranne M. catarrhalis, che
presenta morfologia coccoide).
Le specie Moraxella sono state isolate dalla congiuntiva, tratto respiratorio superiore, sangue,
secrezioni infiammatorie dell'orecchio medio, seno mascellare, aspirato bronchiale, cavità nasali,
milza, fluido cerebrospinale, tratto genito-uretale, articolazioni e cavità degli esseri umani.
Specie Moraxella clinicamente importanti:
M. atlantae4
Sono di dimensioni variabili, spesso coccoidi, diplococcobacillari distinguibili dalle cellule a forma di
bastoncino (media 1,0 x 2.0 μm), con scarsa tendenza a crescere in lunghe catene e a resistere
alla decolorazione. Spesso sono dotate di fimbrie e non sono capsulate. Inoltre non sono
pigmentate e mobili. La temperatura ottimale di crescita è di 33-37° C e sono strettamente aerobie.
Le colonie sono solitamente di piccole dimensioni, non-emolitiche, lievemente opache, con
diametro 0,5 millimetri, mostrano sciamatura e scavano l’agar. Si sviluppano due principali varianti
di colonie, una emisferica dotata di margine, l'altra più piatta o con margini irregolari e con
tendenza a formare una zona di sciamatura. La penetrazione nell’agar è più pronunciata in
quest'ultima variante di colonia.
Sono positive per i test ossidasi e catalasi, negative per la produzione di acido dai carboidrati,
riduzione dei nitrati e nitriti, ureasi, produzione d’indolo e di H2S.
M. atlantae sono state isolate da sangue umano, liquido cerebrospinale e milza.
M. lacunata5
Le cellule sono da spessore medio a coccobacillari, 0.8 - 1.2 μm di diametro, si osservano in
coppie diploidi e catene. Hanno tendenza a perdere le loro caratteristiche di colorazione Gram
negativa quando sono lasciate all’esterno per giorni e conservano queste ultime caratteristiche nei
successivi trasferimenti in agar sangue. Sono spesso pleomorfe e possono formare sottili capsule.
Le colonie sono piccole (0,1 - 0,3 millimetri di diametro), da traslucide a semi-opache, formano
aloni scuri su agar cioccolato e l’escavazione nell’agar è frequente. Su agar sangue, non si
osserva emolisi. Alcuni ceppi di M. lacunata sono emolitici.
Sono positive ai test ossidasi e catalasi e negative per la produzione di indolo.
M. lacunata è stata isolata dall'occhio umano e da infezioni del ginocchio (liquido sinoviale)6.
M. nonliquefaciens7
Le cellule sono coccobacillari con estremità ottusa, talvolta quasi tozza, spesso molto brevi,
talvolta formano corte catene. Sono frequenti forme simili a diplococchi. Possono essere dotate di
capsula e non producono endospore. Sono aerobie strette con crescita ottimale a 33-37° C. Le
colonie di M. nonliquefaciens sono piccole (diametro di 0,5 - 1 mm), lievemente convesse o quasi
piatte, lisce, da translucide a semi-opache su agar sangue dopo 24 ore e talvolta diffondono e
scavano l'agar. Non sono pigmentate, non emolitiche e hanno una consistenza morbida e friabile.
Alcuni ceppi sono intensamente mucosi con colonie di grandi dimensioni, a cupola, lucide e
viscose.
Sono positive per catalasi e ossidasi, riduzione dei nitrati; e negative per produzione di acido dai
carboidrati, liquefazione della gelatina, produzione d’indolo e H2S. Alcuni ceppi idrolizzano l’urea
subito dopo l'isolamento, ma questa proprietà si perde in sottocultura.
Nell’uomo sono state isolate dal tratto respiratorio, ma più frequentemente dal naso.
M. lincolnii8
Le cellule sono coccoidi o coccobacillari di larghezza 1 - 1.5 μm e 1.5 - 2.5 μm di lunghezza. Le
cellule si osservano spesso in coppia e possono formare corte catene. Dopo 2 giorni di
incubazione, le colonie sono biancastre, lisce, convesse, e circolari e hanno un diametro di 1 a 3
mm. Le colonie di alcuni ceppi possono avere un bordo appiattito. Non si evidenzia emolisi e
nessuna produzione di pigmento o odore. Crescono in condizione aerobica, capnofila, o
microaerobica ma non in anaerobiosi. Crescono su agar sangue o agar nutriente. La crescita
ottimale si realizza da 28 a 33° C. La crescita avviene anche a 36-37° C, ma non a 42° C. La
crescita è possibile in assenza di NaCl e i microrganismi sono positivi per ossidasi e catalasi. La
maggior parte dei ceppi riduce i nitriti. Non fermentano ne ossidano il D-glucosio.
Sono negative per produzione di acido da D-glucosio, maltosio, D-fruttosio o saccarosio; ureasi,
DNasi, o β-galattosidasi, riduzione dei nitrati, liquefazione di gelatina, proteolisi su agar a becco di
clarino di Loeffler, idrolisi di Tween 80, o produzione di indolo. Tutti i ceppi sono sensibili alla
penicillina (dischi 10 mcg).
M. lincolnii è stata isolata principalmente dal tratto respiratorio dell’uomo.
M. osloensis7
Le cellule assomigliano a M. nonliquefaciens sebbene alcuni ceppi mostrino una forma più
fusiforme o lanceolata, altri formano in prevalenza cellule diplococciche. Non sono mobili, nonproducono spore, non possiedono capsula. Sono strettamente aerobie con crescita ottimale a 3337° C. Le colonie di M. osloensis e M. lincolnii sono in apparenza simili, ma raramente scavano
l’agar e hanno consistenza morbida o coesa e non sono pigmentate. Possono o no ridurre i nitrati
a nitriti. Sono ureasi negative, ad eccezione delle reazioni irregolari che possono essere osservate
negli isolati recenti.
I microrganismi sono stati isolati dal tratto genito-urinario, sangue, liquido cerebrospinale, liquido
pleurico e nasale, ma sembrano essere rari nel tratto respiratorio.
M. catarrhalis (già nota come Branhamella catarrhalis)9
M. catarrhalis si presenta in forma di diplococchi reniformi extracellulari di 0.5 - 1.5 μm di diametro
nei campioni clinici colorati con Gram. Crescono bene su agar sangue e anche su agar cioccolato
ma non su agar MacConkey. Su agar sangue, le colonie non sono emolitiche, dopo 24 ore di
incubazione su agar cioccolato sono di colore da grigio a bianco, opache, lisce, asciutte, e con
diametro di 1 - 3 mm, quelle marrone rosato, sono simili a Neisseria gonorrhoeae. Rimangono
immodificate quando pressate sulla superficie dell’agar e non sono pigmentate.
Moraxella catarrhalis è la specie più frequentemente isolata e può essere differenziata dalle specie
Neisseria con il test della tributirrina: M. catarrhalis è positiva e le specie Neisseria negative10-12.
Tuttavia, poiché il test della tributirrina è positivo per specie Moraxella diverse da M. catarrhalis,
questa non può essere l’unica prova usata per differenziare le specie Moraxella10-12.
Sono positive per ossidasi, produzione di DNasi, e riduzione dei nitrati a nitriti e negative per
produzione di acido da glucosio, maltosio, saccarosio, lattosio, e fruttosio.
La maggior parte dei ceppi di M. catarrhalis è β-lattamasi positiva9.
E 'stata isolata da rinofaringe, gola, effusioni dell'orecchio e aspirati sinusali13.
Altri organismi morfologicamente simili sono:
Oligella species2
Sono bastoncini piccoli, per lo più di lunghezza non superiore a 1 μm e spesso sono presenti in
coppie. Le cellule non assumono l’aspetto coccoide delle moraxelle. Non hanno capsula, non
formano spore e per lo più non sono mobili ma alcuni ceppi di O. ureolytica sono dotati di flagelli
peritrichi. Sono aerobie e crescono su agar nutriente arricchito con lievito, autolisati, siero o
sangue. Su agar sangue le colonie si sviluppano piuttosto lentamente e sono nettamente più
bianche di tutte le specie conosciute di Moraxella. Non producono pigmenti o odori. Inoltre non
sono emolitiche.
Le Specie Oligella sono ossidasi positive e di solito catalasi positive e non fermentano o ossidano i
carboidrati.
Sono essenzialmente isolate dal tratto urogenitale dell’uomo.
Sono ora note solo 2 specie di questo genere; O. ureolytica (già conosciuta come gruppo CDC
IVe) e O. urethralis14.
O. ureolytica
Già nota come gruppo CDC IVe. Non cresce a 42° C ed il 31-79% dei ceppi sono mobili per lunghi
flagelli peritrichi. Oligella ureolytica cresce lentamente su agar sangue producendo colonie
puntiformi dopo 24 ore e grandi colonie solo dopo tre giorni d’incubazione. Le colonie sono
bianche, opache, con margine continuo e non-emolitiche. Sono ossidasi positive e mobili. Oligella
urethralis è simile alle specie Moraxella e Acinetobacter che sono isolate in forma cocco bacillare,
ossidasi negative e non mobili. Oligella urethralis può crescere in presenza di 3% NaCl ed è
positiva alla prova dell’ureasi. Alcuni ceppi sono positivi per la riduzione dei nitrati e
denitrificazione. Per la crescita utilizzano anche p-idrossibenzoato come fonte di carbonio. Sono
state isolate da urine umane15.
O. urethralis
In precedenza classificata come Moraxella urethralis. Non sono mobili e crescono a 42° C.
Possono moltiplicarsi anche in presenza di 3% NaCl e sono negative per riduzione dei nitrati e
prova dell’ureasi. Per la crescita non utilizzano p-idrossibenzoato come fonte di carbonio. O.
urethralis è stata isolata dalle urine, tratto urinario, e anche dall’orecchio15.
Specie Kingella
Ora sono note 4 specie appartenenti a questo genere: K. denitrificans, K. kingae, K.oralis. e K.
potus16. K. indologenes è stata riclassificata nel genere Suttonella come Suttonella indologenes17.
Le specie Kingella sono costituite da bastoncini diritti, 1.0 μm di lunghezza con le estremità
arrotondate o tozze. Si presentano in coppie e catene a volte brevi. Non formano endospore. Le
cellule sono Gram negative, ma tendono a resistere alla decolorazione. Su agar sangue crescono
due tipi di colonie; una che diffonde, con tipo crescita corrodente e una liscia di tipo convesso. Non
richiedono fattori X o V. La crescita è anaerobia o aerobia facoltativa. La temperatura ottimale di
crescita è 33-37°C2.
Non sono mobili, ossidasi positive, catalasi negative e ureasi negative. Fermentano il glucosio e
altri carboidrati con la produzione di gas, ma non di acido.
Le specie Kingella possono crescere su agar selettivo per Neisseria ed essere quindi
erroneamente identificate come specie patogene di Neisseria. Possono essere differenziate dalle
specie Moraxella e Neisseria con il test della catalasi. La maggior parte delle specie Kingella è
catalasi negativa; le Moraxella e la gran parte delle specie Neisseria (tranne Neisseria elongata)
sono catalasi positive.
K. denitrificans18
In precedenza assegnato al gruppo CDC TM-1. Sono bastoncini coccoidi di 1.0 μm di larghezza.
Le colonie sono piccole, traslucide non-emolitiche e si sviluppano su agar sangue dopo 48 ore
d’incubazione a 37° C. Le colonie possono presentare escavazioni nel terreno. La crescita su agar
sangue avviene in anaerobiosi. Sono ossidasi positive, crescono a 30 e 37° C, al test O /F sono
fermentanti, producono di acido dal glucosio, riducono i nitrati e i nitriti e producono gas dai nitriti.
Sono negative per la catalasi, crescono a 5 e 45° C e in presenza di 4 e 6% di NaCl, crescono in
terreno β-idrossibutirrato contenente minerali, producono acido dal maltosio ma non in presenza di
siero, idrolizzano l’amido e producono ureasi. Sono state isolate dal tratto respiratorio dell’uomo19.
K. kingae20
Le cellule assumono aspetto da coccoide a bastoncini di media dimensione, sono molto simili alle
Moraxella ma lievemente più piccole, hanno estremità tozze, e si sviluppano in coppie e corte
catene. Sono Gram negative, con una certa tendenza a resistere alla decolorazione. Inoltre, non
sono mobili, non dotate di capsula e non producono endospore. Su agar sangue, si sviluppano due
tipi di colonie; quelle dei ceppi appena isolati appaiono come piccole depressioni, con diametro di
0,1 - 0,5 mm, presenza iniziale di una piccola papilla centrale, ma dopo 2 o più giorni
d’incubazione, diffondono in modo evidente e le colonie sono spesso circondate da sottili zone
granulari di crescita. Quando raschiate, le colonie mostrano segni di corrosione sulla superficie
dell’agar. Il secondo tipo di colonia, spesso generata dal primo tipo posto in sottocoltura, è
piccola,fragile, traslucida o leggermente opaca, con diametro di 0,1 - 0,6 millimetri dopo 20 ore di
incubazione su agar sangue, a ridotta emisfericità e liscia. Prolungando l’incubazione, le colonie
aumentano di dimensione, ma non compaiono aspetti di corrosione o diffusione. Entrambi i tipi di
colonie sono circondati da aree evidenti di β-emolisi; la loro consistenza è morbida o adesa e non
sono pigmentate.
Sono aerobie e crescono a temperatura ambiente, ma la loro crescita ottimale è a 33 -37° C.
Sono relativamente esigenti e la loro crescita è buona su agar nutriente di elevata qualità simile a
quella su che si manifesta su agar sangue.
K. kingae sono negative per catalasi e ureasi. Non producono acido da fruttosio, lattosio,
saccarosio, arabinosio, xilosio, ramnosio, mannitolo, dulcitolo, sorbitolo, o glicerolo. Gelatina e
siero non sono liquefatti. I nitrati non sono ridotti o lo sono in modo scarso.
Sono parassiti delle membrane mucose umane. I ceppi sono stati isolati da gola, naso, sangue,
lesioni ossee e articolazioni.
K. oralis21
Sono bastoncini o coccobacilli di circa 0,6 - 0.7μm di diametro e lunghi 1 – 3 μm con estremità
arrotondate. Le cellule possono formare coppie o catene. Le cellule sono dotate di fimbrie
monopolari lunghe fino a 10 micron. Presentano tendenza a resistere alla decolorazione del Gram.
Non sono mobili per mezzo di flagelli, ma le cellule formano colonie che diffondono. Sono
anaerobie o aerobie facoltative. La crescita è favorita da agar sangue di pecora 5% arricchito con
5 mg di emina per litro e 0.5μg di menadione per ml sia per incubazione anaerobia che aerobia
con CO2. Non crescono su agar MacConkey. Le colonie appaiono rotonde con bordi leggermente
irregolare e sono da piatte a umbonate; ogni colonia presenta una periferia granulare. Le colonie
sembrano corrodere la superficie dell’agar. Sono positive per il test ossidasi e negative per nitrati,
nitriti, indolo, ureasi e test di idrolisi dell’esculina. Non producono acido da lattosio, maltosio,
mannitolo, saccarosio, e xilosio.
L'habitat di K.oralis sembra essere quello della placca dentale dell’uomo e sono state isolate in un
campione di placca sopragengivale da un paziente con periodontite.
K. potus22
Sono aerobie, DNasi positive, ossidasi positive e catalasi negative. Le colonie sono circolari,
modicamente convesse, giallo-pigmentate, lisce, con margine continuo, diametro di circa 1,5 - 2
millimetri, e friabili su agar sangue Columbia dopo 48 ore d’incubazione a 37° C. Non sono
emolitiche. Sono prodotti pigmenti gialli non diffusibili. Non riducono nitrati e nitriti. Non idrolizzano
esculina e urea. Non producono Indolo. Non producono acido da fruttosio, glucosio, mannosio,
mannitolo, maltosio, lattosio o saccarosio. Non sono state rilevate attività di fosfatasi alcalina, αglucosidasi, β-galattosidasi, o β-glucuronidasi. Sono state isolate da una ferita umana causata da
un morso da un kinkajou (cercoletto).
il test della DNasi e la loro capacità di produrre pigmento sono utili per differenziare Kingella potus
da altre specie Kingella e componenti del genere Neisseria.
Specie Psychrobacter5,23
Le cellule di Psychrobacter non sono mobili, coccobacilli Gram negativi spesso trovati accoppiati,
con dimensioni di 0,9-1,3 x 1.5-3.8 μm. Sono ossidasi positive, con un metabolismo strettamente
ossidativo e dimostrano una moderata alotolleranza.
A differenza delle moraxellae, molte specie Psychrobacter sono in grado di formare acido dal
glucosio e diversi altri zuccheri in condizione aerobica. Sono in grado di crescere a 5° C,
temperatura ottimale attorno a 25° C. Generalmente sono in grado di crescere a 35-37° C, anche
se alcuni ceppi hanno la loro crescita ottimale proprio a questa temperatura. Su agar infuso cuore
le colonie si presentano di color crema, non sono pigmentate, lisce e opache con consistenza
butirrosa. Alcuni isolati delle specie Psychrobacter possono essere rosa a volte tenue, forse a
causa di proteine dei citocromi accumulate. Sono anche catalasi e tributirrina esterasi positive, e
sensibili alla colistina, ma negative per la fosfatasi alcalina, tripsina, pirrolidonil aminopeptidasi,
produzione di indolo, β-galattosidasi (ONPG), gelatina, esculina idrolasi e arginina diidrolasi, e per
la crescita a 42° C.
Il loro habitat spazia dal fango ghiacciato in Antartide ai tessuti umani, ciò li rende microrganismi
interessanti per la professione medica e per la ricerca microbiologica e ambientale.
Sono ora note 34 specie riconosciute, 6 delle quali sono state isolate dall’uomo24.
Ora sono riconosciute 34 specie, 6 delle quali sono state isolate dall’uomo24.Queste sono di
seguito riportate; P. arenosus, P. immobilis, P. faecalis, P. phenylpyruvicus, P. pulmonis e P.
sanguinis.
P. arenosus25,26
Sono cellule ovoidali aerobiche, non pigmentate, non sporigene (lunghe 1,4 - 1.7 μm e diametro
0.6 - 0.8 μm). Sono psicrotolleranti e crescono a 4-37° C, con una temperatura ottimale a 25 - 28°
C. Non crescono a 39 o 40° C. Si moltiplicano anche a pH 5,0-10,0, con una sviluppo ottimale a
pH 6.0- 9.0. Per la crescita non necessitano di ioni sodio; si sviluppano in presenza di 0-10% (w /
v) di NaCl, ma non a concentrazione del 12%. Su agar sangue, le colonie sono monomorfe,
piccole, e grigie e su tryptic soy agar, le colonie sono opache, circolari, convesse, e color crema.
Producono acido da D-glucosio, ramnosio, galattosio, lattosio e arabinosio. Sono positive per i test
ossidasi e catalasi, ma negative per ureasi, produzione di indolo, idrolisi di esculina e gelatina e
utilizzazione di glucosio, arabinosio, mannosio, maltosio e mannitolo.
P. arenosus è stato originariamente isolato da un campione di sedimenti di sabbia marina del Mar
del Giappone, da acque territoriali russe, e recentemente da un flacone contaminato di eritrociti e
dal sangue del paziente sottoposto a trasfusione, in seguito alla quale si è ammalato.
P. immobilis27
Sono coccobacilli coccoidi spesso a coppie. Crescono a temperature comprese fra i 5-25° C ma
non a 35-37° C. In aerobiosi producono acido da glucosio, mannosio, galattosio, arabinosio, xilosio
e ramnosio, ma non da fruttosio, maltosio, o saccarosio. Sono positivi per riduzione dei nitrati,
deaminazione di fenilalanina e triptofano e test dell'ureasi e negativi per idrolisi dell'amido,
gelatina, siero, formazione d’indolo e produzione di H2S.
P. Immobilis è stato isolato da sedi quali l'occhio, tessuto cerebrale, uretra, liquido cefalorachidiano
e sangue, portando alcuni ricercatori a sospettare che questi batteri possano causare in alcuni
pazienti infezioni opportunistiche. La manifestazione clinica di questa specie è ancora sconosciuta,
anche se è stata isolata in pazienti con meningite, AIDS e altre infezioni.
P. faecalis28
Le cellule sono a forma di bastoncini diritti, 0,8-1,2 x 1.0 - 2.0 μm. Le cellule si presentano isolate e
non sono mobili, Gram negative, ossidasi positive e catalasi positive, con metabolismo ossidativo
chemioeterotrofo. Su agar nutriente le colonie sono circolari, opache, leggermente rilevate e di
colore beige con margini continui. Su agar nutriente non si sviluppa crescita a 45 o 55° C. Sono
negative per la produzione di indolo, ureasi, arginina diidrolasi, lisina decarbossilasi, ornitina
decarbossilasi e crescita su Simmons citrato . Sono saccarolitiche con produzione di acido da
glucosio, arabinosio, lattosio, galattosio, melibiosio, cellobiosio, maltosio e xilosio ma non da
mannitolo. Producono acido anche da glicole etilenico.
P. faecalis e P. pulmonis sono ureasi reduttasi negative e nitriti positive, ciò consente una facile
differenziazione da P. phenylpyruvicus e P. immobilis.
Il microrganismo è stato isolato da campioni clinici di esseri umani, quali ferita, rinofaringe, pus,
liquido pleurico, secrezioni congiuntivali e linfonodi.
P. phenylpyruvicus29
Sono batteri a forma coccoide, ossidasi positivi, non mobili, psicrotolleranti e alotolleranti. La
temperatura di crescita ottimale è di 10° C, non crescono a 30° C o a temperatura superiore. La
crescita di P. phenylpyruvicus migliora nettamente aggiungendo al terreno 1% di Tween 80. Le
colonie sono color crema circolari, leggermente convesse, con circa 2 – 4 mm di diametro,
appaiono sulle piastre d’isolamento dopo 3 a 7 giorni.
Sono catalasi e ossidasi positive; crescita: 4 - 15° C; tolleranza al 6,5% di NaCl; producono C8
esterasi, alanina arilamidasi, e leucina arilamidasi; idrolizzano acido urico e Tween 80; come sole
fonti di carbonio e di energia utilizzano butirrato, L-asparagina, L-glutammato, e L-prolina. Il 90 100% dei ceppi di P. phenylpyruvicus sono ureasi positivi. Sono negativi per riduzione dei nitrati,
prova con citrato di Simmons e produzione di acido da L-arabinosio, D-xilosio, e D-raffinosio Dmannosio, cellobiosio, D-melibiosio, e N-acetilglucosamina.
Le specie Brucella possono essere erroneamente diagnosticate come P. phenylpyruvicus da
qualche confezione d’identificazione commerciale30.
P. phenylpyruvicus è stata isolata da sangue umano e da liquido cerebrospinale.
P. pulmonis31
Sono cellule a forma di cocchi non mobili, catalasi e ossidasi positive. Sono aerobie strette e su
agar sangue a 37° C, crescono in colonie non pigmentate, lisce. La crescita non si manifesta su
agar MacConkey.
Crescono in presenza di NaCl 6,5%, riducono i nitrati, producono acetoina e sono negative per
urea, gelatina e idrolasi della gelatina ed esculina; producono indolo o H2S e acido da glucosio,
mannitolo, inositolo, sorbitolo, ramnosio, saccarosio, melibiosio, amigdalina o arabinosio.
P. pulmonis è stata isolata dal sangue umano.
P. sanguinis32
Non sono emolitiche, non mobili, non pigmentate, coccobacilli non sporulanti (0.5 - 1.0 μm di
larghezza e lunghe 1.0 - 2.0μm). Le colonie sono di 1 - 2 millimetri di diametro, umide, non
pigmentate, circolari e lisce con margini continui. Crescono: 4 - 37° C (temperatura ottimale tra 30 37° C). Crescono su agar e in brodo marino23. Non si osservano crescite su MacConkey agar,
Trypticase Soy agar, Brain Heart Infusion agar o Luria-Bertani agar. Le cellule sono positive per
ossidasi e catalasi, hanno una forte attività dell’ureasi e sono in grado di ridurre i nitrati a nitriti. Le
cellule sono negative per la produzione di acido su terreno di Hugh e Leifson per ossidazionefermentazione con 1% D-glucosio, maltosio, D-mannitolo, lattosio, saccarosio e D-xilosio. Sono
anche negative per crescita a 42° C, utilizzazione del citrato di Simmons, idrolisi dell’esculina e
gelatina, produzione di indolo e completa decarbossilazione di arginina, lisina, ornitina nel terreno
decarbossilasi di Moeller.
P. sanguinis è stata isolata dal sangue umano.
Principi di Identificazione
Le colonie isolate sull’agar sangue o cioccolato sono identificate da: aspetto della colonia,
colorazione Gram e reazione dell’ossidasi. Può essere eseguita poi l’identificazione biochimica. Se
appropriato, gli isolati possono essere inviati al Laboratorio di Riferimento per la conferma e
successiva identificazione.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Test dell’ossidasi
Le specie Kingella e M. catarrhalis sono ossidasi positive è possono essere erroneamente
identificate come specie Neisseria.
Sistemi di Identificazione Commerciali
Le confezioni commerciali non identificano in modo corretto le specie Brucella e P. phenylpyruvicus30.
1
Considerazioni sulla Sicurezza33-49
Microrganismi di Gruppo di Rischio 2.
Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza nella manipolazione di tutti i microrganismi
presentati in questa SMI.
Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza
microbiologica41.
Considerare Neisseria meningitidis da campioni respiratori, cioè goccioline di aerosol.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio.
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto.
2
Microrganismi Bersaglio
Specie Moraxella e microrganismi morfologicamente simili segnalati causa
d’infezione nell’uomo6,8,13,21,22,28,29,32,50,51
M. catarrhalis, M. atlantae, M. lacunata, M. nonliquefaciens, M. osloensis, M. lincolnii, denitrificans
K., K. kingae, K. oralis, K. potus, O. urethralis, O. ureolytica, P. Immobilis, P. phenylpyruvicus, P.
faecalis, P. pulmonis, P. sanguinis, P. arenosus
3
Identificazione
3.1
Aspetto Microscopico
Colorazione Gram (TP 39 - Staining Procedures)
Gram-negativi con tendenza a resistere alla decolorazione.
Specie Moraxella
Bastoncini, spesso coccobacilli. Solitamente a coppie o a corte catenelle con un solo piano di
divisione. A volte, potrebbero apparire come cocchi isolati o in coppia, con lati adiacenti appiattiti,
formando tetradi.
Specie Kingella
Bastoncini coccoidi o coccobacilli a coppie o catenelle.
Specie Oligella
Piccoli bastoncini o coccobacilli, spesso in coppie. Le cellule perdono il tipico aspetto
coccobacillare delle specie Moraxella.
Specie Psychrobacter
Bastoncini, spesso coccobacilli. Di solito si presentano nei piani con un solo piano di divisione. Al
microscopio è possibile differenziare le specie Brucella (coccobacilli molto piccoli) da P.
phenylpyruvicus.
3.2
Terreno di Primo Isolamento
Agar sangue o cioccolato, 16 – 48 ore di incubazione in 5 - 10% CO2 a 35°C - 37°C
3.3
Aspetto delle Colonie
Specie Moraxella
Colonie lisce, piatte, uniformi, color camoscio, diametro 1 – 2 mm.
Su agar sangue le colonie di M. lacunata, M. atlantae e M. liquefaciens sono piccole <1mm.
M. lacunata e M. atlantae possono scavare l’agar. Alcuni ceppi di M. lacunata sono emolitici. Le
colonie possono apparire, lisce, rotonde, uniformi, grigio/marrone e con 1 mm di diametro.
Su agar cioccolato,le colonie di M. catarrhalis sono marrone rosato, simili a quelle di N.
gonorrhoeae.
Specie Kingella
Su agar sangue si sviluppano due tipi di colonie; una liscia, margine continuo, convessa ed una
sciamante. Le colonie dopo 48 ore sono piccole, diametro 0.5 – 1 mm.
Nota: K. kingae produce zone evidenti di beta-emolisi.
Specie Oligella
Dopo 24 ore di incubazione le colonie sono piccole, bianche, opache, con margine continuo e non
emolitiche.
Specie Psychrobacter
Richiede incubazione a 20°C – 25°C. Su agar sangue le colonie sono piccole, lisce e opache. La
crescita è favorita dai sali biliari o da Tween 80 per formare colonie non pigmentate, lisce, od
opache.
3.4
Procedure di Prova
3.4.1. Prove biochimiche
Test dell’ossidasi (TP 26 – Oxidase test)
Le specie Moraxella sono ossidasi positive.
Le specie Neisseria sono pure ossidasi positive e possono essere erroneamente identificate come
specie Moraxella.
Prova della tributirrina
Prova presunta 2-4 ore
Le specie Moraxella sono tributirrina positive.
Questo test è utilizzato anche per differenziare M. catarrhalis dalle specie Neisseria. M. catarrhalis
è positiva e le specie Neisseria sono negative12.
Test della DNAsi (TP 12 – Deoxyribonuclease test)
Positiva per M. catarrhalis
Il test della DNasi può essere utilizzato come prova supplementare per differenziare M. catarrhalis
dalle altre specie Moraxella.
3.4.2 Confezione commerciale di identificazione
Possono essere utilizzati come test complementari o di conferma altri sistemi d’identificazione,
comprese le confezioni commerciali. I laboratori devono seguire le istruzioni del produttore e i test
rapidi e le confezioni commerciali devono essere validati e dimostrare di essere idonee allo scopo
prima del loro utilizzo.
Nota: alcuni sistemi d’identificazione commerciale possono identificare in modo erroneo le specie
Brucella e P. phenylpyruvicus.
3.4.3 Matrix-Assisted Laser desorbimento / ionizzazione - Time of Flight
(MALDI-TOF) Spettrometria di Massa
Questo metodo ha dimostrato di essere uno strumento potente e rapido per la sua riproducibilità,
velocità e sensibilità analitica. Il vantaggio di MALDI-TOF rispetto ad altri metodi d’identificazione è
dovuto alla disponibilità dei risultati delle analisi entro poche ore anziché diversi giorni. La velocità
e la semplicità di preparazione del campione e l'acquisizione del risultato, associato ai costi minimi
di consumo, rendono questo metodo adatto per la routine ed elevati volumi di produttività52.
L'uso di questa tecnica per la distinzione delle sottopopolazioni di M. catarrhalis ha contribuito a
stabilire il suo ruolo nella colonizzazione e nelle manifestazioni della malattia, che è tuttora
sconosciuta. MALDI-TOF applicato a M. catarrhalis integre ha anche messo a disposizione uno
strumento veloce e robusto per la tipizzazione di ceppi di M. catarrhalis che potrebbe essere
applicato in studi epidemiologici. L’unico fattore limitante l'uso di MALDI-TOF MS rimane la
mancanza di un ampio archivio di M. catarrhalis che ostacola ancora oggi la determinazione della
proteina o proteine corrispondenti53.
3.4.4 Test Nucleic Acid Amplification (NAAT)
La PCR è considerata un buon metodo di rilevazione batterica perché semplice, rapida, sensibile e
specifica. La base per le applicazioni diagnostiche della PCR in microbiologia è la rivelazione degli
agenti infettivi e la possibilità di differenziare ceppi non patogeni dai patogeni, tramite la rilevazione
di geni specifici.
Questa tecnologia è stata utilizzata per la rilevazione rapida e la quantificazione di M. catarrhalis in
secrezioni nasofaringee senza la necessità di coltura batterica ricercando specificamente il gene
della proteina copB della membrana esterna; questo può servire come strumento per studiare le
variazioni quantitative di M. catarrhalis in corso d’infezioni del tratto delle vie respiratorie inferiori54.
Questa possibilità è risultata specifica solo per M. catarrhalis e non per le altre specie di Moraxella.
La PCR è stata anche utilizzata in modo attendibile per il rilevamento d’infezioni batteriche miste,
ad esempio, in un singolo dosaggio di amplificazione per M. catarrhalis, Haemophilus influenzae, e
Streptococcus pneumoniae. Quest’approccio ha anche avuto successo su coltura negativa di
versamenti55. Ciò ha contribuito a facilitare la diagnosi rapida e il pronto avvio dell’appropriata
chemioterapia, ed è anche utilizzata per studi epidemiologici.
3.5
Identificazione Successiva
Metodi Molecolari Rapidi
Metodi molecolari hanno avuto un impatto enorme sulla tassonomia di Moraxella. L’analisi delle
sequenze dei geni ha aumentato la conoscenza delle relazioni filogenetiche delle specie Moraxella
e microrganismi correlati e ha comportato il riconoscimento di numerose nuove specie. Le tecniche
molecolari hanno reso più rapide e precise l’identificazione di molte specie rispetto a quanto sia
possibile con le tecniche fenotipiche.
Sono stati sviluppati una grande varietà di metodi di tipizzazione rapida per isolati da campioni
clinici; questi includono tecniche molecolari quali la Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), la
16S rRNA gene sequencing. Tutti questi approcci permettono la sottotipizzazione di ceppi non
correlati, ma con diversa accuratezza, potere discriminante, e riproducibilità.
Tuttavia, alcuni di questi metodi rimangono accessibili solo per i laboratori di riferimento e sono
difficili da implementare nell’identificazione batterica di routine in un laboratorio clinico.
16S rRNA gene sequencing
Il metodo d’identificazione genotipico, noto come sequenziamento del gene 16S rRNA è usato per
studi filogenetici ed è stato in grado di riclassificare i batteri in modo completo in nuove specie, o
anche generi. E’ stato anche usato per descrivere nuove specie che non-sono mai state coltivate
con successo.
La disponibilità del sequenziamento del gene ha rivoluzionato la tassonomia del genere Moraxella
ed è stato utilizzato per chiarire le relazioni tra specie così come decifrare i collocamenti di più
specie scarsamente correlate a Moraxella e ad altri componenti della famiglia appartenenti alle
Moraxellaceae56.
E’ stato anche utilizzato per identificare nuove specie; Psychrobacter sanguinis, e anche per
aggiornare la descrizione delle specie già esistenti; Psychrobacter faecalis e Psychrobacter
pulmonis e anche di ri-classificare i microrganismi, ad esempio il trasferimento di Kingella
indologenes nel genere Suttonella17,28,32.
Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
La PFGE rileva la variazione genetica tra ceppi con rari tagli ottenuti con enzimi di restrizione e
successiva separazione su gel di agarosio dei grandi frammenti genomici ottenuti. La PFGE è nota
per avere un’elevata capacità discriminante ed è frequentemente utilizzata per le indagini di
epidemie avendo acquisito una vasta applicazione nella caratterizzazione degli isolati
epidemiologicamente correlati. Tuttavia, la stabilità della PFGE può essere insufficiente per
un’applicazione affidabile in studi epidemiologici a lungo termine. Inoltre, in funzione delle sue
caratteristiche, richiede tempo (30 ore o più per l’esecuzione) e attrezzature speciali; la PFGE non
è diffusamente usata se non nei laboratori di riferimento57,58.
La PFGE eseguita con NotI è stata usata per caratterizzare ceppi di M. catarrhalis e una migliore
elettroforesi con metodologia su gel a campo pulsato (PFGE) ottenuta con SpeI come la scelta
migliore per tipizzare M. catarrhalis, e buona attività di restrizione dei campioni clinici e buona
correlazione di raggruppamento con NotI59,60.
Questo è stato utile per comprendere la diffusione della malattia negli ospedali e nelle comunità.
3.6
Conservazione e Invio
Se opportuno, conservare un isolato puro su becchi di clarino di agar sangue per l’invio al
Laboratorio di Riferimento.
4 Identificazione di specie Moraxella e di Microrganismi
Morfologicamente Simili
Il Diagramma di Flusso rappresenta solo un’indicazione
5
Refertazione
5.1
Identificazione Presunta
Se sono riscontrate appropriate caratteristiche di crescita, aspetto delle colonie, colorazione Gram
delle coltura, e risultati delle prove dell’ossidasi e della tributirrina.
5.2
Conferma dell’Identificazione
Successiva all’identificazione con confezione commerciale o altre prove biochimiche
5.3
Medico Microbiologo
Per campioni prelevati da sedi normalmente sterili, o in caso di malattie invasive, informare il
medico microbiologo di tutti gli isolati presunti positivi, o confermati, di specie Moraxella o di
microrganismi morfologicamente simili.
Per la refertazione al clinico seguire i protocolli locali
5.4
CCDC
Fare riferimento al Memorandum locale di informazione.
5.5
Public Health England61
Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC ed alle indicazioni del COSURV.
5.6
Gruppo Controllo Infezione
N/D
6
6.1
Invio
Laboratorio di Riferimento
Per l’invio dei campioni, contattare l’appropriato laboratorio nazionale di riferimento per le
informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure di trasporto ed altri requisiti:
Laboratory of Healthcare Associated Infection
Antimicrobial Monitoring and Health Care Associated Infections Reference Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
https://www.gov.uk/amrhai-reference-unit-reference-and-diagnostic-services
Contattare il centralino della PHE: Tel +44(0) 20 8200 4400
7
Notifica al PHE61,62 o Equivalente63,66
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare
Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#healthprotection-regulations-2010
Esistono accordi diversi in Scotland63,64, Wales65 and Northern Ireland66.
Traduzione a cura di Roberto Rescaldani, già primario del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San
Gerardo dei Tintori - Monza.
I testi originali e le traduzioni sono disponibili sul Web APSI - www.apsi.it - Webmaster Sergio Malandrin,
Dirigente di primo livello del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori di Monza
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