Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

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Ricerche Microbiologiche: Procedure
Standard del Regno Unito
Identificazione di Actinomiceti Aerobi
Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Microbiologia - Identificazione I ID 10 I Emissione no 1.3: I Data emissione: 11.03.14 I Pagina 1 di 19
© Crown copyright 2014
Identificazione Actinomiceti aerobi
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica
del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web
http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnerships. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi
gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
http://www.hpa.org.uk/SMI/WorkingGroups).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori
di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si
ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services Division
Public Health England
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website: http://www.hpa.org.uk/SMI
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
Batteriologia – Identificazione I ID 10 I Emissione no: 1.3 | Data emissione; 11.03.14 | Pagina: 2 di 19
UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England
Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL REGNO UNITO: SCOPO E
OBIETTIVO ........................................................................................................................5
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................8
INTRODUZIONE .........................................................................................................................8
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................12
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .......................................................................14
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO .....................................................................................14
3
IDENTIFICAZIONE ..........................................................................................................14
4
IDENETIFICAZIONE DI SPECIE ACTINOMICES AEROBICHE: DIAGRAMMA DI
FLUSSO...........................................................................................................................16
5
REFERTAZIONE ...........................................................................................................16
6
INVIO .............................................................................................................................16
7
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE .......................................................................17
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................18
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected].
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il
sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
3/11.03.14
Emissione eliminata. no
1.2
Emissione inserita no.
1.3
Sezione(i) interessate/Pagina no. Modifica.
Il documento è stato inserito in un nuovo formato che
evidenzia il passaggio della Health Protection Agency alla
Public Health England.
Prima pagina ridisegnata.
Documento intero .
Rinominata la pagina di “Stato come Scopo” e Obiettivo
ed aggiornata in modo appropriato.
I loghi delle organizzazioni professionali sono stati
revisionati ed aggiornati.
Revisionati e aggiornati Standard di sicurezza e referenti
delle denunce
Il contenuto scientifico rimane invariato.
Modifica No/Data.
2/06.11.12
Emissione eliminata. no
1.1
Emissione inserita no.
1.2
Sezione(i) interessate.
Modifica.
Intero documento
Documento presentato in nuovo formato.
Bibliografia
Bibliografia In parte aggiornata.
Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito#:
Scopo e Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
• Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai
professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive.
• Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio
riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni
forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati da parte
dei reparti ospedalieri.
• Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della
sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la
salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione.
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del
processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove
di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).
Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi
differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono
metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione
della prova, la garanzia della qualità, la definizione dell'incertezza della determinazione.
La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo. Nel Regno Unito le SMI rappresentano strategie omogenee per le
prove diagnostiche e la programmazione degli interventi di sanità pubblica
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS,
Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.
L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito
http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnershipshttp. L'inclusione del logo di una organizzazione in una
SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I
rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di
Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente
conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro
organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la
consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione.
Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione
#
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General
Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai
Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte
dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.
Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono
attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno
Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e
neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito.
Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche
addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti
dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere
verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Queste
stesse devono essere utilizzate in associazioni con altre SMI.
Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e
delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo
commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I
laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative
procedure del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il
coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di
operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà
strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di
partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero
al nostro sito web
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere
ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui
pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni
di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1317133470313. I Gruppi di Lavoro SMI
sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al
pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche
a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel
corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo
da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente
accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2014). Identification of Aerobic Actinomycetes. UK Standards for
Microbiology Investigations. ID 10 Emissione 1.3. http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf.
Scopo del Documento
Questa SMI descrive la procedura d’identificazione dei bacilli Gram-positivi ramificati isolati da
campioni clinici. Le colonie possono essere isolate su agar sangue o terreni contenenti uovo.
Questa SMI deve essere usata congiuntamente con le altre SMI.
Introduzione
Tassonomia
La classificazione del gruppo che comprende i bastoncini Gram-positivi ramificati è complessa.
Differenze morfologiche considerevoli sono presenti non solo nell’ambito dei generi ma anche
all’interno dello stesso raggruppamento tassonomico.
Caratteristiche1
Specie Nocardia
Le specie Nocardia producono ife vegetative con morfologia da rudimentale ad estesamente
ramificata, con diametro di 0.5 - 1.2 μm, si sviluppano sulla superfici e penetrano nei terreni
agarizzati. Le ife spesso si frammentano in elementi a morfologia coccoide o bastoncellare. Sono
di consuetudine prodotte ife aeree. Su queste sono presenti catene di conidi di lunghezza
variabile, da corte a lunghe, presenti occasionalmente sulle ife ancorate al substrato. Le cellule
assumono colorazione Gram positiva o Gram variabile e di solito sono acido-resistenti. Lo sviluppo
è aerobico con formazione di colonie gessate, infeltrite o vellutate. La loro morfologia varia in
funzione del tipo di terreno e della temperatura d’incubazione utilizzata. Le colonie possono
apparire di colore marrone, rossiccio, rosa, arancio, rosso, porpora, grigio o bianco. Sui terreni
solidi possono assumere aspetto liscio ed umido o granulare, irregolare, rugoso o ammucchiate
con una superficie vellutata fornita dalla formazione di strutture filamentose aeree. Possono
produrre pigmenti solubili di colore marrone o giallo. Le Nocardia sono catalasi positive e crescono
su agar Sabouraud glucosio, agar sangue, agar con infuso cuore cervello e terreno di LowensteinJensen. La presenza di anidride carbonica (10%) consente uno sviluppo più rapido. Sull’agar
Sabouraud destrosio, le colonie del complesso N. asteroides presentano colorazione variabile da
rosa salmone ad arancio, quelle di N.brasiliensis presentano di solito colorazione arancio-marronerossiccio. Le colonie di N. otitidiscavarum sono pallide, marrone rossiccie, mentre quelle di N.
transvalensis possono presentare colorazione variabile da marrone rossiccio tenue al viola. Le
colonie delle colture pure possono svilupparsi dopo solo 48 ore. Nelle colture miste lo sviluppo di
altri batteri a crescita rapida può mascherare le piccole colonie delle specie Nocardia che
richiedono alcune settimane per la loro crescita. Il terreno modificato di Thayer-Martin o l’agar
tamponato con carbone-estratto di lievito possono migliorare il riscontro delle specie Nocardi2
L’esame microscopico dei campioni clinici colorati con Gram può consentire una diagnosi rapida e
specifica. Rappresenta aspetti caratteristici delle specie Nocardia l’osservazione di filamenti sottili,
delicati, con colorazione Gram positiva debole o netta a carattere irregolare, o ramificati con
formazioni tondeggianti. Per l’esame colturale devono essere inviati campioni multipli. Le specie
Nocardia possono non essere isolate tranne il caso in cui si proceda all’esame di secrezioni da
fistola o di materiale ascessuale. Gli strisci e le colture dei campioni clinici sono spesso negativi
diversamente quelli prelevati con biopsia. Le emocolture di routine sono generalmente negative.
Molte specie Nocardia isolate da campioni clinici presentano acido resistenza variabile nelle
colture di primo isolamento. Utilizzare la colorazione modificata di Kinyoun che utilizza un acido
debole come decolorante (1-2% di acido solforico invece dell’acido-alcool). Non ignorare mai
anche una sola colonia di Nocardia isolata da LCR o da sedi normalmente sterili quali ascesso dei
tessuti molli, spazio pleurico, liquido articolare da paziente con sintomatologia clinica compatibile
Questi microrganismi sono raramente dei contaminanti di laboratorio e non appartengono alla
normale flora corporea. Le procedure di digestione dell’espettorato (N-acetil-L-cIsteina o idrossido
di sodio) possono generare colture negative per specie Nocardia. Non sono disponibili prove per la
diagnosi sierologica3.
Le specie Nocardia sono ubiquitarie ed il loro isolamento dai campioni può essere privo di
significato clinico. La presenza di Nocardia nella coltura dell’espettorato non sempre è indice di
infezione invasiva, ma può essere conseguente a contaminazione di laboratorio o colonizzazione
dell’albero respiratorio. Le difficoltà di interpretazione clinica e di laboratorio includono anche
l’esordio non caratteristico dell’infezione, la frequente richiesta di procedure diagnostiche bioptiche
di tipo invasivo, la difficoltà d’isolamento delle Nocardia, oltre a problemi di identificazione e
classificazione tassonomica. N. farcinica è di solito erroneamente identificata come N. asteroides,
o Rhodococcus o specie Gordona.
Specie Streptomyces
Le specie Streptomyces producono ife vegetative con diametro di 0.5 - 2.0 μm formanti un micelio
molto ramificato raramente frammentato. Questo matura producendo catenelle di tre o più spore
non mobili. Alcune specie producono spore sul micelio substrato. Le cellule sono Gram positive e
non acido-alcol resistenti. La crescita è aerobica obbligatoria e la temperatura ottimale è di 25°C –
35°C. Nella fase iniziale di crescita le colonie presentano superficie liscia, ma poi sviluppano un
micelio aereo che può essere di aspetto fioccoso, granulare, friabile o vellutato. Le colonie sono
isolate, di aspetto lichenoide, coriacee o butirrose. Il micelio vegetativo aereo può essere
pigmentato e possono essere prodotti anche pigmenti diffusibili. Il metabolismo è di tipo ossidativo
e la prova della catalasi è positiva. I nitrati sono ridotti a nitriti e l’esculina è degradata.
Specie Rhodococcus
Le specie Rhodococcus formano cocchi che possono germinare in: corte forme bastoncellari,
forme filamentose con protrusioni laterali, ife ramificate o con ramificazioni multiple. Dalla
frammentazione di bastoncini, filamenti o delle ife prende origine un’altra generazione di cocchi o
forme bastoncellari brevi. Di solito non sono generate microscopiche ife aeree e spore. Le cellule
sono Gram positive e solitamente sono parzialmente acido resistenti. La crescita è di tipo aerobico
Sono noti tre tipi principali di colonie di R. equi. La colonia di tipo classico è di color rosa pallido e
viscosa. Il secondo tipo è di color corallo e non vischiosa, quella di terzo tipo è giallo pallida, non
viscosa e più opaca. Le colonie degli altri rodococchi possono avere aspetto rugoso, liscio o
mucoso e pigmentato di colore crema, camoscio, giallo, corallo, arancio e rosso. Si possono isolare
varianti incolori, specialmente di R. equi. R. equi può presentarsi con morfologia microscopica
variabile (da bacillare a coccoide) è può essere scartato come contaminante4 . La modificazione
morfologica ciclica di R. equi e di alcuni rodococchi non-equi dipende dal tempo d’incubazione e
dalle condizioni di crescita. Tutti i rodococchi presenti nei campioni clinici sono debolmente acido
resistenti. La morfologia della cellula e della colonia non possono essere utilizzate per distinguere
fra Rhodococcus, Gordonia e Tsukamurella. I sistemi commerciali non consentono
un’identificazione affidabile nell’ambito delle specie Rhodococcus e gli isolati clinicamente
significativi devono essere inviati ai Laboratori di riferimento5,
Specie Oerskovia
Le specie Oerskovia producono ife vegetative molto ramificate del diametro di circa 0.5 μm che
crescono in superficie e penetrano nell’agar. Le ife si rompono in formazioni a bastoncino, mobili e
bastoncini flagellati. Si riscontrano anche ceppi privi di mobilità. Non viene prodotto un micelio
aereo. Le cellule sono Gram-positive, sebbene parte del tallo possa risultare Gram negativa in
colture datate e si osservino aspetti corineiformi. Lo sviluppo è di tipo anaerobico facoltativo e la
prova della catalasi è positiva per la crescita aerobica e negativa per quella anaerobica. Le specie
possono presentare pigmentazione gialla. Il glucosio è metabolizzato sia per via ossidativa che
fermentativa.
Microrganismi morfologicamente simili
Specie Actinomadura
Le specie Actinomadura producono ife vegetative molto ramificate che formano un fitto substrato
miceliare che non si frammenta. Il micelio aereo può essere assente o moderatamente sviluppato
in modo da formare corte catenelle di artrospore quando mature, Le catenelle di spore sono diritte,
ricurve o a spirali irregolari. Il micelio aereo può assumere colore blu, marrone, crema, grigio,
verde, rosa, rosso, bianco o giallo. Qualora il micelio sia assente, le colonie assumano aspetto
coriaceo o cartilaggineo . Le colonie assumono di solito aspetto mucoso e dopo 2 giorni
d’incubazione a 35°C assomigliano ad un dente molare. Lo sviluppo avviene in aerobiosi con
temperatura compresa fra 10°C – 60°C. Le cellule sono Gram positive e non acido-alcol resistenti.
Specie Amycolata
Le specie Amycolata producono ife vegetative ramificate di diametro di 0.5 - 2.0 μm che tendono
a frammentarsi in elementi di forma quadrata. Può essere formato un micelio aereo che rimane
stabile o si differenzia in lunghe catenelle di spore ellissoidali o cilindriche dotate di parete liscia.
Catenelle di spore sono prodotte d anche dalle ife vegetative.
Amycolata autotrophica è un raro patogeno umano. E’ Gram-positiva con filamenti ramificati non
acido resistenti al metodo di colorazione di Kinyoun. Le ife aeree sono numerose e la prova di
idrolisi dell’esculina è positiva.
Specie Amycolatopsis
Le specie Amycolatopsis producono un substrato di ife ramificate del diametro 0.5 - 2.0 μm in che
si frammentano in elementi di forma quadrata. Il micelio aereo può essere presente e le ife aeree
possono essere sterili o differenziarsi in lunghe catenelle a parete liscia, di forma da quadrata ad
ellissoidale in strutture simili a spore. Le spore possono essere prodotte su ife di tipo vegetativo.
Dermatophilus congolensis
Dermatophilus congolensis cresce solo su terreni a composizione complessa ed il micelio aereo si
sviluppa solo in atmosfere contenenti anidride carbonica. Il micelio substrato è costituito da lunghi
filamenti affusolati che si ramificano lateralmente ad angolo retto. D. congolensis può essere
facilmente riconosciuto con l’esame microscopico. I setti si formano su paini trasversali, orizzontali
e longitudinali per formare fino ad otto righe parallele di spore mobili. Le cellule sono Gram positive
ma non acido-resistenti.
L’isolamento di D. congolensis può essere difficoltoso. Il materiale clinico, preferibilmente la parte
circostante le croste, dovrebbe essere strisciata su piastra di agar sangue ed incubata poi in
aerobiosi o in presenza di anidride carbonica a 35°C – 37°C. La crescita è di tipo aerobico,
anaerobia facoltativa; prova della catalasi positiva. Il metabolismo non è di tipo fermentativo, ma si
rileva produzione di acido da alcuni carboidrati. Optimun di temperatura di crescita a 37°C.
Specie Gordonia
Costituita da corti bastoncini o da cocchi che assomigliano a sottili coccobacilli a forma di perla.
Sono Gram positivi o Gram variabili e di solito parzialmente acido-resistenti. Dopo 3 - 7 giorni
d’incubazione su agar sangue le colonie sono asciutte, rugose, rilevate, beige, marroni, rosa od
arancio e rosse. Crescita aerobica. La morfologia della colonia e della cellula è indistinguibile da
quelle di Rhodococcus, Gordonia e Tsukamurella.
Specie Nocardiopsis
La specie Nocardiopsis producono un micelio substrato ben sviluppato. Le ife sono lunghe e
fittamente ramificate e possono frammentarsi in formazioni di aspetto coccoide e bacillare. Il
micelio aereo è inoltre abbondante e ben sviluppato ed le ife aeree si frammentano completamente
in spore di diversa lunghezza. L’intervallo di temperatura di crescita è compreso fra 10°C - 45°C.
Specie Rothia
Rothia comprende 5 specie inclusa Rothia mucilaginosa (precedentemente nota come
Stomatococcus mucilaginosus). Alla colorazione Gram si osserva una miscela di cocchi, bastoncini
e forme filamentose. E’ catalasi positiva e temperatura ottimale di crescita a 35°C - 37°C. R.
dentocariosa è anaerobia facoltativa, produce colonie filamentose a raggiera quando cresce in
anaerobiosi. In condizioni aerobiche le colonie sono convesse o spiraliforme e scintillanti. Rothia
mucilaginosa è a forma di cocco con diametro di 0.9 – 1.3 mm, di solito raggruppati in agglomerati.
Specie Tsukamurella
Le specie Tsukamurella sono costituite da bastoncini diritti o moderatamente ricurvi di 0.5 - 0.8 x
1.0 – 5.0 μm. Sono presenti anche bastoncini molto corti. Le cellule sono Gram-positive e
debolmente o intensamente acido-resistenti, sono presenti in forma isolata, a coppie o in ammassi.
Sono immobili, non sporulanti, non producono ife aeree. La crescita è aerobia obbligata con
produzione di piccole colonie di colore da bianco/crema ad arancio, di forma convessa e diametro
di 0.5 - 2.0 mm con margini continui, talvolta rizoidi, asciutti ma facilmente emulsionabili. La
temperatura ottimale di crescita e di circa 37°C. La morfologia della cellula e della colonie non è
distinguibile da quella di Rhodococcus Gordonia e Tsukamurella.
Colonie di Tsukamurella paurometabola: le specie associate ad Infezione crescono in agar infuso
cuore cervello contenente sangue e sviluppano un diametro di 0.5 - 2.0 mm con margine continuo
talvolta rizoide, asciutto, facilmente emulsionabile di colore da bianco a crema ad arancio. Le
colonie rugose sono prodotte dopo incubazione protratta di oltre sette giorni. Queste colonie sono
cerebriformi e non producono ife aeree, ma assomigliano a micobatteri a crescita rapida. La
maggior parte dei ceppi di T. paurometabola è acido resistente al metodo di colorazione di
Kinyoun.
Micetoma
I principali agenti eziologici del micetoma nell’uomo sono:
Actinomadura madurae
Actinomadura pelletieri
Nocardia brasiliensis
Streptomyces somaliensis
Sono coinvolti con minor frequenza: N. asteroides, N. otitidiscaviarum, N. dassonvillei e N.
transvalensis. Nel Sudan, al micetoma sono pure associati Aspergillus nidulans e Curvularia
lunata.
Principi di Identificazione
N/D
Informazione Tecnica/Limitazioni
L’identificazione affidabile di infezioni clinicamente significative da actinomadurae, nocardiae,
actinomycetes e streptomycetes è possibile solo ricercando i marcatori chimici. L’identificazione
deve essere confermata dal Laboratorio di Riferimento. Le prove standard di identificazione
fenotipica forniscono solo un’identificazione presuntiva.
Metodo di dimostrazione della morfologia delle colture (informazione)
Eseguire la coltura di colonie non differenziabili su terreni a minima crescita, quale acqua di
rubinetto o terreno a base di farina privo di destrosio. Le preparazioni sono incubate a 25°C ed
esaminate periodicamente per 2 o 3 settimane. Esaminare al microscopio le colture su vetrino con
l’intento di riconoscere il micelio substrato ramificato, il micelio aereo e la sporulazione. Le ife
substrato delle specie Nocardia appaiono come forme filamentose sottili con ramificazione
dicotomica. Muovendo l’obiettivo con piccoli movimenti fochettando verticalmente per mettere a
fuoco piani diversi, si potranno osservare le ife aeree. La loro presenza consente di differenziare il
genere Nocardia dagli altri generi correlati (Rhodococcus, Gordona, Tsukamurella,
Corynebacterium e Mycobacterium). Solo le specie Nocardia sono dotate di ife aeree in questo
gruppo di microrganismi. I micobatteri a crescita rapida, che fenotipicamente assomigliano alle
nocardiae, sono dotati di corte ife substrato che si ramificano ad angolo acuto. Diversamente, le ife
del complesso substrato delle nocardia è ramificano ad angolo retto e di solito sono presenti
ramificazioni secondarie. I rodococchi si sviluppano come coccobacilli assemblati realizzando un
aggregazione a zigzag.
A. pelletieri differisce da A. madurae in quanto quest’ultima idrolizza l’esculinae A pelletierino.
In coltura la morfologia microscopica di D. congolensis è simile a quella che si evidenzia nei
campioni clinici. La presenza di tipici filamenti ramificati divisi secondo piani trasversali e
longitudinali consente la definizione diagnostica. Colorare con blu di metilene o con Giemsa i
preparati umidi delle colonie o strisci ottenuti dalle stesse o dal campione clinico. La colorazione
Gram non è idonea a visualizzare questi microrganismi per la presenza di un colore di fondo scuro
che maschera i rilievi morfologici più importanti. Si possono osservare elementi a forma di cocco,
molti dei quali dotati di flagello o cellule assemblate in raggruppamenti irregolari. Si possono pure
osservare spore germinanti e filamenti segmentati e non. Gli isolati da colture recenti sono di solito
mobili. Se si osservano solo forme a cocco e si sospetta una D. congolensis, preparare una coltura
più recente ed esaminare per presenza di ife. Dopo 24 ore di incubazione si possono osservare su
agar infuso di cuore cervello addizionato di sangue colonie tondeggianti molto piccole (0.5 - 1.0
mm). Le colonie sono solitamente di colore grigio-bianco, adese e penetranti nel terreno. Dopo due
– cinque giorni si sviluppa un pigmento di colore arancio, la β-emolisi è frequentemente, più
evidente nella aree di terreno in cui le colonie sono addensate. Su agar Sabouraud destrosio non
cresce. D. congolensis. è catalasi positiva ed idrolizza l’urea in 24 ore. Non reduce i nitrati e dal
glucosio è prodotto acido ma non gas dopo 48 ore.
I rodococchi possono essere facilmente differenziati dalla maggior parte delle specie
Corynebacterium, tranne che da Corynebacterium aquaticum; Corynebacterium minutissimum ed il
gruppo CDC group B- che sono infatti dotati di metabolismo fermentativo.
1
Considerazioni sulla Sicurezza6-22
Microrganismi di Gruppo di Rischio 2.
Fare riferimento alle attuali linee guida17,23,24 sulla sicurezza della manipolazione di tutti i
microrganismi appartenenti al gruppo di rischio 2 presentati in questo Metodo Nazionale Standard.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio.
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto.
2
Microrganismi Bersaglio
Specie Nocardia che sono state associate ad infezione
N. asteroides in senso stretto
N. nova
N. farcinica
N. brasilinesis
N. otitidiscaviarum
N. transvalensis
N. brevicatena
N. carnea
N. pseudobrasiliensis
3
Identificazione
3.1
Aspetto Microscopico
(TP 39 - Staining Procedures)
Colorazione Gram
Gram-positivi, possono essere Gram variabili in funzione dell’età della coltura.
Specie Nocardia: presentano ramificazioni, filamenti sottili, delicati con frammentazione.
Rhodococcus, Gordona, Tsukamurella: sono simili ai difteroidi con ramificazione ridotta o sono a
forma coccobacillare.
Specie Streptomyces: sono diffusamente ramificate e presentano catenelle di spore; non si
frammentano facilmente
Specie Actinomadura: moderatamente ramificate, sottili, intrecciate, formano corte catene con
spore.
Specie Dermatophilus: filamenti ramificati divisi secondo piani trasversali e longitudinali; forme
filamentose sottili ed affusolate.
Specie Norcardiopsis: ramificazione con spore interne.
Specie Oerskovia: ramificazione diffusa; le ife si frammentano in elementi bastoncellari mobili.
Specie Rothia: pleiomorfa; forma coccoide predominante e forma bacillare (in brodo) e forme
filamentose ramificate (terreno solido).
ZN modificata
Se la colorazione è positiva l’isolato è probabilmente un actinomicete aerobico parzialmente acido
resistente.
.
3.2
Terreno di Primo Isolamento
Agar cioccolato incubato in 5 - 10% CO2 a 35°C - 37°C per 16 - 48 ore.
Agar sangue incubato in 5 - 10% CO2 a 35°C - 37°C per 16 - 48 ore.
Agar per anaerobi esigenti o equivalente, con o senza neomicina (alcuni microrganismi anaerobi
possono essere inibiti dalla neomicina), incubazione anaerobica per 40 – 48 ore a 35°C - 37°C.
Note: piastre incubate per 2 -3 settimane.
3.3
Aspetto delle Colonie
Genere
Caratteristiche di crescita degli anaerobi esigenti dopo incubazione
Specie Nocardia
Rugose, spesso asciutte, colore da bianco gessato ad arancio - rossiccio
pigmentato, friabili
Colonie ammucchiate di aspetto ceroso a morfologia variabile
Giallo pigmentata, estesa frammentazione con sviluppo superficiale ed
all’interno dell’agar
Non-emolitica, tondeggiante, spesso mucosa di colore rosa/rosso salmone,
sviluppo in 4 -7 giorni
Specie Streptomyces
Specie Oerskovia
Specie Gordonia,
Rhodococcus, e
Tsukamurella
Dermatophilus
congolensis
Specie Actinomadura
Specie Rothia
Specie Nocardiopsis
3.4
Colonie adese grigio-bianche, successiva produzione di pigmento colore
arancio; spesso beta emolitiche
Colonie di colore da bianco a rosa, di solito mucose, assumono l’aspetto di
un dente molare
Colonie piccole lisce – rugose di aspetto asciutto
Grossolanamente rugose e pieghettate con micelio aereo ben sviluppato
Procedure di Prova
Differenziazione dei bastoncini Gram-positivi ramificati
Colorare in duplicato con Gram e metodo modificato di Kinyoun gli strisci delle colonie e del
campione clinico. Gli isolati delle specie Streptomyces possono presentare forme coccoidi acido
resistenti ed ife non-acido resistenti, ma questi microrganismi sono considerati non-acido
resistenti. Può manifestarsi contrasto fra carbol fucsina e controcolorazione. La dimostrazione di
acido-resistenza degli isolati deve essere utilizzata associata ad altre prove di supporto in quanto
non ha valore diagnostico assoluto.
Le specie Nocardia e Streptomyces (β-galattosidase positive) possono essere differenziate dal
gruppo IV dei micobacteri (β-galattosidase negativo) e rodococchi (β-galattosidase variabile)15,
3.5
Identificazione Successiva
Confezioni commerciali d’identificazione o tecniche molecolari
3.6
Conservazione e Invio
Se appropriato, eseguire sottocolture in agar sangue e trasferire l’isolato su agar sangue a becco
di clarino per l’invio al Laboratorio di Riferimento.
4 Identificazione di Actinomiceti Aerobi: Diagramma di
Flusso
N/D
5
Refertazione
5.1
Identificazione Presuntiva
L’identificazione presuntiva può essere eseguita se sono disponibili appropriate caratteristiche
morfologiche e di sviluppo delle colonie, colorazione Gram e risultati di tipo biochimico o di tecniche
molecolari. Conferma dell’Identificazione
5.2
Conferma Identificazione
La conferma dell’identificazione può essere eseguita dall’appropriato laboratorio di
riferimento
5.3 Medico Microbiologo
Informare il medico microbiologo quando il modulo di richiesta riporta informazioni particolari I5.4
CCDC
Fare riferimento al Memorandum of Understanding.
5.5
Public Health England25
Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC e alle indicazioni del COSURV.
5.6
Gruppo Controllo Infezione
N/D
6
6.1
Invio
Laboratorio di Riferimento
Per informazioni su accertamenti disponibili, tempi di risposta, procedure di trasporto ed altre
informazioni riguardanti gli accertamenti disponibili, il tempo di risposta, procedure di trasporto ed
altre richieste per l’invio del campione al laboratorio di riferimento rivolgersi a:
Molecular Identification Service (MISU)
Microbiology Services Division
Public Health England
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
Contact PHE’s main switchboard: Tel. +44 (0) 20 8200 4400
Inghilterra e Galles
http://www.hpa.org.uk/webw/HPAweb&Page&HPAwebAutoListName/Page/1158313434370?p=11
58313434370
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nors
http://www.belfasttrust.hscni.net/Laboratory-MortuaryServices.htm
7
Notifica al PHE25,26 o Equivalente27-30-
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare
Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
Esistono accordi diversi in Scozia27,28, nel Galles29 e Irlanda del Nord30..
Bibliografia
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Bacteriology. 9th ed. Baltimore: Williams and Wilkins; 1994. p. 625-703
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6. European Parliament. UK Standards for Microbiology Investigations (SMIs) use the term "CE marked
leak proof container" to describe containers bearing the CE marking used for the collection and transport
of clinical specimens. The requirements for specimen containers are given in the EU in vitro Diagnostic
Medical Devices Directive (98/79/EC Annex 1 B 2.1) which states: "The design must allow easy handling
and, where necessary, reduce as far as possible contamination of, and leakage from, the device during
use and, in the case of specimen receptacles, the risk of contamination of the specimen. The
manufacturing processes must be appropriate for these purposes".
7. Official Journal of the European Communities. Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the
Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. 7-12-1998. p. 1-37.
8. Health and Safety Executive. Safe use of pneumatic air tube transport systems for pathology specimens.
9/99.
9. Department for transport. Transport of Infectious Substances, 2011 Revision 5. 2011.
10. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances 20132014. 2012.
11. Home Office. Anti-terrorism, Crime and Security Act. 2001 (as amended).
12. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The Approved List of Biological Agents. Health and
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13. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Infections at work: Controlling the risks. Her Majesty's
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14. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Biological agents: Managing the risks in laboratories and
healthcare premises. Health and Safety Executive. 2005.
15. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Biological Agents: Managing the Risks in Laboratories
and Healthcare Premises. Appendix 1.2 Transport of Infectious Substances - Revision. Health and
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16. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal
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17. Health and Safety Executive. Control of Substances Hazardous to Health Regulations. The Control of
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18. Health and Safety Executive. Five Steps to Risk Assessment: A Step by Step Guide to a Safer and
Healthier Workplace. HSE Books. 2002.
19. Health and Safety Executive. A Guide to Risk Assessment Requirements: Common Provisions in Health
and Safety Law. HSE Books. 2002.
20. Health Services Advisory Committee. Safe Working and the Prevention of Infection in Clinical
Laboratories and Similar Facilities. HSE Books. 2003.
21. British Standards Institution (BSI). BS EN12469 - Biotechnology - performance criteria for microbiological
safety cabinets. 2000.
22. British Standards Institution (BSI). BS 5726:2005 - Microbiological safety cabinets. Information to be
supplied by the purchaser and to the vendor and to the installer, and siting and use of cabinets.
Recommendations and guidance. 24-3-2005. p. 1-14
23. Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety
Precautions: Notes for Guidance. Public Health Laboratory Services (PHLS). London. 1993.
24. NHS Estates. Health Building Note 15 Facilities for pathology services. 2nd ed. 2nd Report. The
Stationery Office. London. 2005.
25. Public Health England. Laboratory Reporting to Public Health England: A Guide for Diagnostic
Laboratories. 2013. p. 1-37.
26. Department of Health. Health Protection Legislation (England) Guidance. 2010. p. 1-112.
27. Scottish Government. Public Health (Scotland) Act. 2008 (as amended).
28. Scottish Government. Public Health etc. (Scotland) Act 2008. Implementation of Part 2: Notifiable
Diseases, Organisms and Health Risk States. 2009.
29. The Welsh Assembly Government. Health Protection Legislation (Wales) Guidance. 2010.
30. Home Office. Public Health Act (Northern Ireland) 1967 Chapter 36. 1967 (as amended).

Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

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