Ciccarelli - Arpa Umbria

DETERMINAZIONE DELL’ATP
IN
BIOLUMINESCENZA
METODO DI SCREENING PER IL CONTROLLO
MICROBIOLOGICO DELLE ACQUE PROFONDE
Dr.ssa E.Ciccarelli
Laboratorio Dip. Perugia ARPA UMBRIA
SCOPO DELLA SPERIMENTAZIONE
Scopo dello studio è stato quello di valutare il
possibile utilizzo di
indicatori di
contaminazione microbiologica, proposti da
IRSA-CNR, nella sorveglianza del rischio di
inquinamento degli acquiferi e di verificare
l’applicabilità di tali metodologie analitiche più
rapide direttamente in situ.
ATTIVITA’ SPERIMENTALE
Determinazione del contenuto globale di microrganismi presenti nelle
acque profonde mediante misura dell’ATP con il metodo
bioluminometrico.
Determinazione sugli stessi campioni dei parametri microbiologici
con i metodi colturali tradizionali.
Comparazione secondo criteri statistici dei risultati ottenuti.
PERCHE’ L’ATP?
L’ATP è una molecola presente in tutti le cellule metabolicamente
attive , siano di origine procariotica che eucariotica, in quanto
fornisce l’energia necessaria per le diverse attività cellulari .La
misura dell’ATP è utilizzata pertanto come indicatore del
contenuto di cellule vitali presenti in una determinata matrice.
PRINCIPIO DEL METODO
La misura dell’ ATP presente nelle cellule batteriche, concentrate
mediante filtrazione su membrana, viene determinata utilizzando
l’enzima luciferasi di lucciola, che catalizza in modo specifico
l’idrolisi dell’ATP.
La quantità di luce prodotta da questa reazione enzimatica è
direttamente proporzionale alla quantità di ATP presente nel
campione ed è misurata con un luminometro.
APPLICAZIONI
La determinazione dell’ATP trova applicazione nel controllo di
qualità nell’ industria alimentare, farmaceutica e cosmetica, nel
monitoraggio dell’igiene degli impianti e della qualità delle materie
prime.
E’ stato proposto un metodo APAT IRSA-CNR (9030) che prevede la
misura dell’ATP ai fini della valutazione della biomassa totale in
ambienti acquatici.
L’attivita’ sperimentale è stata svolta su campioni di acque sotterranee
prelevati in 2 aree del reticolo di monitoraggio regionale.Gli acquiferi
controllati microbiologicamente per tale progetto sono caratterizzati
da una qualità delle acque piuttosto scadente a causa dell’elevato
impatto antropico presente in tali aree.
CONCA EUGUBINA
MEDIA VALLE DEL TEVERE
Sono state eseguite 3 campagne di prelievo : la prima nel 20002001(solo Conca Eugubina) la seconda nel 2003 e l’ultima nel 2005. I
campioni esaminati sono stati complessivamente 65. Per alcuni
campioni la misura dell’ATP è stata eseguita sia in campo che in
Laboratorio.
MATERIALI E STRUMENTAZIONE
¾LUMINOMETRO (Pallchek-PALL)
¾Funnel sterili da 0.45μm
¾Reagenti per estrazione ATP
¾Complesso enzimatico luciferina/luciferasi
¾Soluzione di riferimento di ATP
¾Pipette con volume regolabile
¾Materiale monouso sterile: puntali-spatole-supporti-vials-pinzette-provetteguanti
¾Frigorifero (2-8°C)
¾Acqua distillata sterile
¾Pompa e beuta da vuoto
¾Bottiglie sterili
PROCEDURA OPERATIVA
9 Prelievo dei campioni in condizioni di sterilità(APAT
IRSA-CNR Met 6010 Man 29/03)
9 Trasporto e conservazione a 4-10°C
9 Taratura strumento(Curva ATP standard)
8,00000
RLU
6,00000
y = 0,9753x - 0,5683
R2 = 0,9974
4,00000
2,00000
0,00000
0,00000 1,00000 2,00000 3,00000 4,00000 5,00000 6,00000 7,00000 8,00000
ATP
9 Controllo materiali e reattivi (ATP standard-acqua
distillata sterile)
9 Filtrazione di un’aliquota del campione su membrana
con funnel sterili
9 Posizionamento della membrana con pinzette sterili su
apposita piastra con supporto
9 Estrazione dell’ATP intracellulare
(aggiunta Extractant)
9 Aggiunta complesso enzimatico luciferina/luciferasi
reazione di bioluminescenza
ATP
+ O2 + D-luciferina + luciferasi ossiluciferina +AMP +CO2 + LUCE
9 Misurazione emissione luminosa in RLU(Unità
di Luminescenza Relative) e registrazione dei
dati su apposita scheda di campo
SCHEDA REGISTRAZIONE DATI BIOLUMINOMETRO IN CAMPO
Progetto: Progetto APAT 99
Unità Ambientale: Pozzo
Localizzazione___________________________________________________________________
Comune_________________________________________________________________________
Cod. __________________________
Cod. LIMS___________________________________
Reattivi ricostituiti il: ATPreagent
Exstractant
KitATPStandard
Controlli:
Piastra= RLU…………………………………………………………………………(<20RLU)
Piastra+ Supporto = RLU……………………………………………………………(<20RLU)
Piastra+ Supporto+ Exstractant100μl + ATPReagent100μl=RLU……………………………(<80RLU)
Controllo Negativo con lettura su membrana (Acqua MilliQ sterile 100ml +100ml di lavaggio+ Exstractant150μl+ ATPReagent100μl):
RLU……………………………. ……………………………………………..(<150RLU)
Controllo Positivo (ATP):ATP non dil. RLU =
1°dil. RLU =
2°dil. RLU =
3°dil. RLU =
4°dil. RLU =
5°dil. RLU =
6°dil. RLU =
CAMPIONE
I° replica RLU………………………………………………………………………..
CAMPIONE
NOTE:
II° replica RLU……………………………………………………………………….
DATA________________________ORA__________________________________N°_____________
Operatori:_____________________________________RAPP. DI PROVA N°____________________
9 Semina
secondo
per il
acque
campioni per esame colturale
metodi utilizzati normalmente
controllo microbiologico delle
PARAMETRI MICROBIOLOGICI DETERMINATI CON
METODI COLTURALI
CARICA MICROBICA A 37° (UFC/ml)
CARICA MICROBICA A 22° (UFC/ml)
COLIFORMI TOTALI
(UFC-MPN/100ml)
COLIFORMI FECALI
(UFC/100ml)
ENTEROCOCCHI
Escherichia coli
(UFC/100ml)
(MPN/100ml)
I metodi di riferimento utilizzati ( Rapporti ISTISAN, APAT IRSA-CNR, UNI EN ISO ) prevedono
per la determinazione dei microrganismi indicatori di inquinamento (coliformi totali, coliformi fecali,
enterococchi e Escherichia coli ) la tecnica delle membrani filtranti (MF) e dei tubi multipli (MPN) e
per il conteggio della carica microbica la tecnica dell’inclusione su agar.
9 Elaborazione dati e comparazione dei valori
di RLU ottenuti con i dati microbiologici
Confronto fra Cariche microbiche e i valori di RLU
Correlazione CB 37°C/RLU
1,0E+06
1850
6,0000
1650
5,0000
1,0E+04
4,0000
1450
1250
RLU
1050
3,0000
850
650
y = 0,4894x + 4,0416
R2 = 0,6041
2,0000
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0000
450
250
50
0,0000
0,0000
1,0E+00
0,5000
1,0000
1,5000
2,0000
UFC/ML
1,0E+05
2,5000
-150
RLU
CB 37°C
CB 22°C
Il metodo bioluminometrico utilizzato per la
determinazione dell’ATP è risultato dal punto di
vista operativo:
¾Di facile applicazione
¾Rapido rispetto ai metodi tradizionali (circa
30min. a campione )
¾Strumentazione richiesta non ingombrante e
facilmente trasportabile con alimentazione a
batteria
¾Eseguibile anche in campo
(laboratorio mobile fornito di frigorifero 2-8°C e di un piano di
appoggio che possa essere sottoposto a pulizia/disinfezione)
¾ Costo reattivi circa 11€ ad analisi
LABORATORIO MOBILE
RISULTATI E DISCUSSIONE
I risultati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi statistica
mediante l’applicazione del test di correlazione.
Grafici di correlazione
Carica microbica 22°C/ ATP
Carica microbica 37°C/ ATP
dati relativi a 64 campioni
dati relativi a 64 campioni
2000
2000
y = 9E-05x + 61,129
1500
2
R = 0,0774
1000
500
ufc/ml
ufc/ml
1500
y = 0,0001x + 151,03
R2 = 0,114
1000
500
0
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
0
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
RLU
RLU
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
Coliformi fecali/ ATP
dati relativi a 61 campioni
dati relativi a 61 campioni
500
y = -9E-05x + 339,77
2
R = 0,006
ufc/100ml
ufc/100ml
Coliformi totali/ ATP
400
y = 4E-06x + 16,592
300
R = 0,0027
2
200
100
0
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
RLU
RLU
Escherichia coli /ATP
25
20
15
10
dati relativi a 24 campioni
dati relativi a 48 campioni
140
120
y = -0,00000x + 1,86571
2
R = 0,00001
5
0
ufc/100ml
MPN/100ml
35
30
Enterococchi /ATP
100
y = -5E-07x + 8,5641
80
R = 0,0004
2
60
40
20
0,0E+00 5,0E+04 1,0E+05 1,5E+05 2,0E+05 2,5E+05 3,0E+05 3,5E+05 4,0E+05 4,5E+05
RLU
0
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
RLU
I valori di luminescenza (RLU) ottenuti per le acque
sotterranee controllate con il metodo bioluminometrico
non sono risultati correlabili in maniera significativa
con i parametri microbiologici ricercati, neanche con
la conta dei batteri mesofili e termofili.
L’assenza di correlazione può essere spiegata tenendo
conto sia dell’ aspecificità che caratterizza la misura
dell’ATP sia delle caratteristiche dei metodi colturali.
Infatti il metodo bioluminometrico rileva una risposta
biologica complessiva mentre i metodi colturali , anche
quelli meno selettivi, come quelli utilizzati per la carica
a 37 e 22°C, permettono di evidenziare non tutti i
microrganismi presenti, ma solo quelli per i quali le
condizioni ambientali da noi selezionate (temperatura,
composizione terreno, tempi di incubazione ecc…)
risultano ottimali.
Nell’interpretazione di tali risultati c’è da considerare
inoltre che il contenuto di ATP estratto risulta
dipendente non solo dalla concentrazione numerica
della flora microbica presente nella matrice acquosa,
ma anche dalla sua composizione. Infatti i parametri
microbiologici (CB 37°,CB 22°,CT,CF) che sono stati
correlati con i valori di RLU, rappresentano gruppi
eterogenei di microrganismi aerobi e anaerobi
facoltativi , costituiti da specie con differenti capacità
metaboliche e quindi con una diversa capacità di
produrre ATP. Questo può contribuire a spiegare i
diversi casi riscontrati durante tale sperimentazione, in
cui a
valori luminometrici paragonabili sono
corrisposte concentrazioni di cariche microbiche
differenti.
In questo grafico relativo al confronto dei dati di ATP (RLU) con i valori
delle cariche microbiche ottenuti per i pozzi monitorati nel 2005, è possibile osservare
infatti, come a valori di luminosità dello stesso ordine di grandezza corrispondono
ampie oscillazioni dei conteggi della carica a 37°C e a 22°C (ai 14 valori di RLU
dell’ordine di 104 corrispondono valori di carica microbica che oscillano da 1 a 1840ufc
per quella a 37°C e da 6 a 1780ufc per quella a 22°C ).
Confronto fra Cariche microbiche e i valori di RLU
1,0E+06
RLU
CB 37°C
CB 22°C
1,0E+05
1800
1600
RLU
1200
1000
1,0E+03
UFC/ML
1400
1,0E+04
800
1,0E+02
600
400
1,0E+01
200
EU
2
C
EU
13
C
EU
15
C
EU
16
C
EU
21
C
EU
22
C
EU
11
C
EU
18
C
EU
6
C
EU
19
M
V
T1
5
M
V
T1
4
M
V
T1
6
M
V
T1
7
M
V
T2
4
C
T1
6
M
TV
18
M
TV
19
M
V
T2
0
M
V
T2
1
M
V
T2
3
M
TV
27
M
V
M
V
M
V
T1
3
0
T1
2
1,0E+00
L’assenza di una correlazione statisticamente significativa non ha permesso
pertanto di individuare valori di luminescenza (RLU) ai quali possano essere
associate concentrazioni microbiche ben definite, utilizzabili per discriminare il
grado di contaminazione degli acquiferi e individuare situazioni di rischio.
CB 37°C /Coliformi totali
CB 37°C/Coliformi fecali
CB37°C/Enterococchi
500
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
150
400
y = -0,0837x + 443,88
y = -0,0042x + 22,59
300
2
R = 0,0005
y = -0,0048x + 9,8569
100
2
R = 0,0003
200
2
R = 0,0042
50
100
0
0
0
500
1000
1500
0
2000
500
1000
1500
2000
0
500
1000
1500
2000
Le considerazioni fatte per i dati ottenuti per l’ATP con il metodo bioluminometrico
valgono anche per gli indicatori microbiologici aspecifici determinati con metodi
colturali , infatti dai grafici di correlazione riportati (dati 2003-2005), si può notare
che anche le cariche microbiche a 37°e a 22°C, pur fornendo importanti indicazioni
sul contenuto totale di microrganismi e sulle variazioni della qualità dell’acqua non
risultano correlate in maniera statisticamente significativa, con nessuno dei tre gruppi
specifici di microrganismi utilizzati normalmente per valutare il grado di
inquinamento delle acque e la presenza di possibili patogeni.
CB22°C/Coliformi fecali
CB 22°C/Coliformi totali
CB22°C/Enterococchi
500
8000
y = 0,1975x + 392,94
R2 = 0,0036
6000
4000
80
60
400
y = 0,0278x + 15,395
R2 = 0,0166
300
200
2000
40
20
0
100
0
0
0
500
1000
1500
2000
0
500
1000
1500
y = 0,0035x + 5,8673
R2 = 0,0074
2000
0
500
1000
1500
2000
Durante la sperimentazione 24 campioni di acque sotterranee sono
stati analizzati in doppio, sia in campo che in laboratorio. I grafici
riportati sotto ,evidenziano l’assenza di correlazione significativa fra
le due serie di dati luminometrici ottenuti, anche se nel 60% dei casi
sono risultati dello stesso ordine di grandezza.
Confronto RLU in campo/RLU in laboratorio
3,50E+06
1,0E+07
in campo
3,00E+06
in laboratorio
1,0E+06
RLU
Correlazione RLU in campo /in laboratorio
2,50E+06
2,00E+06
1,0E+05
y = 0,1548x + 158887
R2 = 0,089
1,50E+06
1,0E+04
1,00E+06
5,00E+05
1,0E+03
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4
campioni
0,00E+00
0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06
L’elaborazione dei risultati ottenuti ha permesso di ottenere oltre ad informazioni sulla
correlazione del metodo bioluminometrico con i parametri microbiologici tradizionali, alcune
utili indicazioni che potranno essere sviluppate ed approfondite da tutti coloro che volessero
applicare tale metodo nel controllo delle acque.
Valori RLU determinati nelle acque profonde monitorate nelle 3 campagne di prelievo
2001- 2005
2001
2003
2005
10000000,0
1000000,0
RLU/500ml
100000,0
10000,0
1000,0
100,0
VALORI CONTROLLO ACQUA STERILE
9,6E2
4,0E2
3,2E2
10,0
M
V
T
M 12
V
T
M 13
V
T1
M 6
TV
M 18
TV
M 19
V
T
M 20
V
T2
M 1
V
T
M 23
TV
M 27
V
T1
M 5
V
T
M 14
V
T
M 16
V
T1
M 7
V
T2
4
C
EU
C 1
EU
1
C 2
EU
1
C 7
EU
C 8
EU
C 10
EU
M 14
V
T2
6
C
EU
C 3
EU
6
C
EU
C 2
EU
C 13
EU
1
C 5
EU
C 16
EU
C 21
EU
C 22
EU
1
C 1
EU
1
C 8
EU
C 6
EU
19
1,0
pozzi
Una prima indicazione è riferita al ”livello di background” individuato analizzando con il
metodo bioluminometrico campioni di acqua sterile nelle stesse condizioni operative dei
campioni esaminati . In base alla nostra esperienza tale livello è risultato per le misure in campo
a < 1000 RLU, infatti i valori medi ottenuti per i controlli negativi nelle tre campagne di
prelievo oscillano da 320 a 960 RLU. Tale valore è piuttosto elevato in quanto risente di tutte
quelle interferenze ambientali, che in campo risultano più difficili da tenere sotto controllo
rispetto al Laboratorio ( valore medio acqua sterile 300 RLU), come la contaminazione delle
superfici e dell’aria.
Distribuzione dei valori RLU determinati nelle acque profonde monitorate dal 20012005
10000000
4,7 %
1000000
27,7 %
RLU/500ml
100000
10000
14,1%
1000
100
81,2 %
53,5 %
0%
10
M
V
T
M 12
V
T
M 13
V
T
M 16
V
T
M 18
V
T
M 19
V
T
M 20
V
T
M 21
V
T
M 23
V
T
M 27
V
T
M 15
V
T
M 14
V
T
M 16
V
T
M 17
V
T2
4
C
EU
C 1
EU
C 12
EU
1
C 7
EU
C 8
EU
C 10
EU
M 14
V
T2
6
C
EU
M
V 3
T3
0
C
EU
C 2
EU
C 13
EU
C 15
EU
C 16
EU
C 21
EU
C 22
EU
C 11
EU
1
C 8
EU
C 6
EU
19
1
pozzi
2001
2003
2005
Nel grafico sopra, è possibile osservare che tutti i valori di bioluminescenza
registrati per i 34 pozzi esaminati, risultano > di 1000 RLU. Tale valore
sembrerebbe quindi rappresentare, nella valutazione del grado di contaminazione
delle acque sotterranee esaminate il valore soglia inferiore per il metodo
bioluminometrico.
Si può inoltre notare come la maggior parte dei 64 valori di RLU ottenuti si
collocano nell’intervallo fra 10.000 – 1.000.000 RLU (52 campioni pari al 81,2% )
Modesto è invece il numero di campioni per i quali sono stati registrati valori
compresi fra 1.000-10.000 RLU (9 campioni 14,1%) e >1.000.000 RLU (3
campioni 4,7%).
Ci è sembrato interessante valutare anche la qualità microbiologica complessiva dei
campioni analizzati rispetto ai dati luminometrici ottenuti.
A tale scopo è stata riportata nella tabella sotto la distribuzione nei diversi range di
luminosità dei campioni conformi e di quelli non conformi rispetto ai limiti definiti
dal D.L. 31/2001 sulle acque potabili per gli indicatori fecali.
Intervalli RLU
Da 1.000-10.000
Campioni
Non Conformi
1
Campioni
conformi
16(51,6%)
13(41,9%)
da 100.000-1.000.000
11(35,5%)
11(35,5%)
3
.50%
Non conformi
50%
7
da 10.000-100.000
>1.000.000
Conformi
0
L’ampiezza dell’ intervallo (da 10.000 a 1.000.000 RLU) in cui sono collocati la
prevalenza dei campioni non conformi(87,1%) e la distribuzione nello stesso intervallo
anche della maggior parte dei campioni non fecalizzati (77,4%), conferma la non
idoneità di indicatori aspecifici, come la misura dell’ATP , per screening in situazioni
di emergenza.
CONCLUSIONI
In conclusione non si possono che riassumere alcuni
punti già evidenziati nel corso della presentazione
Il metodo bioluminometrico è risultato
rapido
di facile esecuzione
applicabile anche in campo
ma
aspecifico
Per la sua aspecificità il metodo bioluminometrico per la
determinazione dell’ATP è risultato non adeguato per
discriminare il grado di contaminazione degli acquiferi e come
screening per individuare situazioni di rischio microbiologico.
Grazie per l’attenzione
Un ringraziamento al personale del
Laboratorio e ai collaboratori che
hanno permesso la realizzazione della
sperimentazione.