Meccanismi molecolari di trasduzione del segnale

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Meccanismi molecolari di
trasduzione del segnale
III
Copyright © 2001-2012 by Giorgio Sartor.
Versione 1.2 – jan 2012
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M04 - Trasduzione del segnale II
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Recettori
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Recettori canali ionici
• Il legame del ligando
modifica la
conformazione del
recettore in modo tale
che specifici ioni
possono fluire
attraverso esso, il
risultante movimento
ionico altera il
potenziale elettrico
della membrana
cellulare.
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Recettore dell’acetilcolina
•
•
•
•
•
•
•
I recettori per l’acetilcolina sono presenti
sulla superficie delle cellule muscolari
concentrati nelle sinapsi
Una forma simile si trova anche ne SNC e
permette il passaggio dell’informazione tra
le cellule nervose
Questi recettori sono composti di cinque
catene proteiche arrangiate a formare una
“tubo” che attraversa la membrana
Due di queste catene sono il sito di legame
dell’acetilcolina, quando si lega la forma
del recettore cambia leggermente aprendo
il canale transmembrana
Ciò permette il passaggio di ioni positivi
(Na+, K+, Ca++) attraverso la membrana.
Le cellule muscolari pompano
costantemente Na+ verso l’esterno.
Quando arriva il segnale il canale si apre e
Na+ entra a favore di gradiente facendo
partire il processo della contrazione
muscolare.
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2BG9
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Recettori
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Recettori con attività enzimatica intrinseca
• Recettori transmembrana che contengono ed esprimono
attività enzimatiche.
• Quando uno di questi recettori viene attivato da un ligando
extracellulare, catalizza direttamente la produzione di un
secondo messaggero intracellulare.
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Molecole segnale
Ligando segnale
Recettore
Epidermal Growth Factor (EGF)
EGFR
Insulina
Rettore per l’insulina
Insulin-like Growth Factor
(IGF-1 e IGF-2 )
IGFR-1
Nerve Growth Factor (NGF)
Trk A
Platelet-derived Growth Factor
(PDGF AA, BB, AB)
PDGFR (α e β)
Macrophage-colony-stimulating
factor (M-CSF)
M-CSFR
Fibroblast Growth Factor
(FGF-1 -> FGF-24)
FGF-R1 -> FGF-R4
(e isoforme)
Vascular Endothelial Growth
Factor (VEGF)
VEGFR
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Risposte
Stimola la proliferazione in
diversi tipi di cellule
Stimola l’utilizzo dei
carboidrati e la sintesi
proteica
Stimola la crescita cellulare e
la sopravvivenza
Stimola la crescita cellulare e
la sopravvivenza di alcuni
neuroni
Stimola la sopravvivenza, la
crescita e la proliferazione in
diversi tipi di cellule
Stimola la proliferazione e il
differenziamento in monociti
e macrofagi
Stimola la proliferazione di
diversi tipi di cellule, inibisce
il differenziamento in alcuni
precursori cellulari
Stimola angiogenesi
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EGF – EGFR
Epidermal Growth Factor
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INTERAZIONE COL LIGANDO
↓
DIMERIZZAZIONE
↓
AUTOFOSFORILAZIONE / Attivazione
(siti di legame ad alta affinità)
↓
ASSOCIAZIONE A PROTEINE TARGET
↓
FOSFORILAZIONE DI ALCUNE PROTEINE TARGET
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↓
DIMERIZZAZIONE
↓
↓
↓
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EGF
• EGF è un polipeptide di 53 AA stabilizzato da tre legami
sulfidrilici.
• due molecole di EGF, A e B, interagiscono in una unità
asimmetrica, formando un potenziale dimero.
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EGF
• Alcuni aminoacidi sono
indispensabili per il
legame di EGF al suo
recettore, suggerendo un
ruolo cruciale nell’indurre
la dimerizzazione del
recettore.
• I residui importanti ai fini
dell’interazione EGF/EGFR
sono:
• Tyr13, Leu15, His16,
Tyr37, Arg41, Gln43,
• Ile23, Ala25, Leu26,
• Leu47.
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EGFR
• I recettori per EGF, chiamati ErbB-1, (dal gene,
ErbB, derivato dall’oncogene virale per il quale
sono omologhi: Erythroblastic Leukemia Viral
Oncogene) sono costituiti da una regione
extracellulare costituita da circa 620 aminoacidi,
una singola regione transmembrana, una regione
citoplasmatica con attività tirosinkinasica e una
corta regione che connette queste ultime.
• La regione extracellulare di ogni famiglia è fatta
da quatto sottodomini: L1, CR1, L2 e CR2, dove
"L" significa “leucine-rich” e "CR" significa
“cysteine-rich”.
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EGFR
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ErbB
• L1 (blu), CR1 (verde), L2 (giallo), CR2 (rosso)
• Questi sottodomini sono anche chiamati domini I-IV,
• Files pdb:
– 1NQL (ErbB-1), 1S78 (ErbB-2), 1M6B (ErbB-3) and 2AHX (ErbB-4)
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DIMERIZZAZIONE
↓
↓
↓
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EGF
EGF
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3NJP
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EGF
EGF
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3NJP
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Model for molecular mechanism of ligand-induced EGFR activation.
Lammerts van Bueren J J et al. PNAS 2008;105:6109-6114
v.
1.2 by
©National
gsartor
2012 of Sciences
©2008
Academy
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Dimerizzazione di EGFR
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↓
DIMERIZZAZIONE
↓
↓
↓
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Fosforilazione in tirosina
O
*
N
H
OH
Proteina-tirosin-kinasi
ADP
ATP
O
*
N
H
PO4---
H2 O
O
Proteina-tirosin-fosfatasi
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*
P
O
*
O
O
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Autofosforilazione
•
Avviene in due tappe:
1. Si fosforila il “labbro” di fosforilazione in
prossimità del sito catalitico.
–
Questo porta ad una variazione conformazionale
che favorisce il legame dell’ATP (recettore per
l’insulina) o l’interazione con proteine target
(FGFR).
2. Fosforilazione di altre Tyr del dominio
citosolico
–
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Diventano siti di aggancio delle altre proteine
coinvolte nella trasduzione del segnale.
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Autofosforilazione
• Per alcuni recettori (insulina) le
subunità sono legate in modo
covalente e l’autofosforilazione
avviene solo in presenza
dell’agonista.
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Autoregulatory Mechanisms in Protein-tyrosine Kinases
Stevan R. Hubbard, Moosa Mohammadi, and Joseph Schlessinger
J Biol Chem, Vol. 273, Issue 20, 11987-11990, May 15, 1998
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Dominio kinasico di EGFR
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↓
DIMERIZZAZIONE
↓
↓
↓
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Growth factor receptor-bound protein 2
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Proteine di raccordo
• GRB2 Growth factor receptor-bound protein 2
– Contiene un dominio SH2 che lega sequenze di Tyr fosforilate e
due domini SH3 che formano complessi con regioni ricche di
prolina di altre proteine.
SH3
SH2
SH3
1GRI
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42
Proteine di raccordo
• Il dominio SH3 N-terminale lega sequenze ricche di prolina e lega
Ras-guanine exchange factor SOS.
• Il dominio SH3 C-terminale lega peptidi che possiedono il motivo PX-I/L/V/-D/N-R-X-X-K-P e si legano specificatamente a proteine
come Gab-1.
SH3 N-terminale
SH3 C-terminale
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1GRI
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GRB2
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Src Homology 2
1KKA
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SH3
1SHG
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46
Src
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Sarcoma di Rous
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20.4 Analysis of eye development in
Drosophila has provided insight into RTK
signaling pathways
Wild-type
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sevenless mutant
Figure 20-24
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20.4 Genetic analysis of induction of R7
photoreceptor in the Drosophila eye
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Figure 20-25
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Sos-Ras
• Sos viene rilocalizzato dal citosol alla
membrana dopo legame con GRB2
che lo porta a contatto con Ras-GDP;
• Il contatto Sos Ras-GDP provoca
variazioni conformazionali nelle zone
Switch I e Switch II;
• Si apre la tasca che lega il GDP che
scambia con il GTP (100 volte più
concentrato nella cellula);
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Son of Sevenless (SOS)
RAS:SOS:RAS-GDP
1XD2
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Ras
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53
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GEF: fattore di scambio dei
nucleotidi guaninici
GAP: proteina che attiva la
GTPasi.
• Ras non possiede il residuo di Arg nell’interruttore I che
stabilizza la transizione quindi interviene una GAP. La
struttura del complesso Ras-GAP mostra che la GAP
fornisce un residuo di Arg al sito attivo di Ras.
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A valle di Ras
• Ras attivata porta alla attivazione di Raf e
quindi della cascata delle chinasi che porta
all’attivazione della Mitogen Activated
Protein Kinase (MAPK)
• È una kinasi in serina/treonina che può
essere traslocata nel nucleo e fosforila i
fattori di trascrizione di proteine coinvolte
nella gestione del ciclo cellulare;
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A valle di Ras
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Raf (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)
• Una volta attivata Raf-1
può fosforilare due proteinkinasi: MEK1 e MEK2 che
attivano le serina/treonina
protein-kinasi ERK1 e
ERK2
• Le ERK attivate hanno un
effetto pleitropico
(differenti effetti in
differenti cellule) a
secondo della linea
cellulare interessata.
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La fosforilazione di Tyr e Thr attiva MAP kinasi
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Proteine scaffold
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ErbB
• ErbB1
– EGFR
• ErbB2
– Ligandi non identificati
– Forma eterodimeri con tutti
• ErbB3
– Assente l’attività tirosin kinasica
• ErbB4
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Dimeri
•
•
•
•
•
Il legame del ligando: EGF-like o
NRG (neuregulina) alla porzione
extracellulare di ErbB porta alla
formazione di dimeri.
Sia ErbB3 (privo di attività
tirosinkinasica) o ErbB4 possono
formare omodimeri
Quando ErbB2 è sovraespresso di
formano preferibilmente
eterodimeri
Gli omodimeri sono inattivi
(ErbB3) o hanno bassa attività
mentre gli eterodimeri con ErbB2
possiedono un’attività che
prolunga il segnale a valle
Apparentemente gli omodimeri
ErbB2 generano un segnale
intracellulare più debole degli
eterodimeri che lo contengono.
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Internalizzazione
• Vi è una possibile localizzazione nucleare dei
RTK;
• In un caso, ErbB-4, il recettore è processato da
due proteasi di membrana per produrre un
dominio citoplasmatico solubile che include il
dominio tirosinkinasico;
• Il frammento generato è presente nel nucleo ;
• Tre altri RTK sono stati trovati nel nucleo in
assenza di processi proteolitici;
• In alcuni casi la localizzazione nucleare dipende
dal legame con il growth-factor.
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Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi:
– CHAMPE Pamela , HARVEY Richard , FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BIOCHIMICA [ISBN 9788808-17030-9] – Zanichelli
– NELSON David L. , COX Michael M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER - Zanichelli
– GARRETT Reginald H., GRISHAM Charles M. BIOCHIMICA con aspetti molecolari della Biologia
cellulare - Zanichelli
– VOET Donald , VOET Judith G , PRATT Charlotte W FONDAMENTI DI BIOCHIMICA [ISBN 9788808-06879-8] – Zanichelli
– Harvey Lodish, A Berk, C.A. Kaiser, M. Krieger, M.P. Scott, A. Bretscher, P. Ploegh, Paul
Matsudaira - Biologia molecolare della cellula - Zanichelli
• E dalla
–
–
–
–
consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali:
Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/
Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/
Rensselaer Polytechnic Institute:
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/MB1index.html
Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:
http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ oppure da http://www. gsartor.org/
Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza
limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna a Ravenna
Giorgio Sartor - [email protected]
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Meccanismi molecolari di trasduzione del segnale

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