Valutazione di nuovi markers immuno-istochimici e bio

COLLEGIO ITALIANO DI FLEBOLOGIA
Borsa di Studio “M. GEORGEV”
Per progetto di Ricerca in
“INNOVAZIONI E BIOTECNOLOGIE IN FLEBOLINFOLOGIA”
TITOLO DEL PROGETTO:
Valutazione di nuovi markers immuno-istochimici e bio-umorali della
infiammazione e della ipossia tissutale nella insufficienza venosa cronica.
RICERCATORE PRINCIPALE: dott.ssa Rita COMPAGNA (Dottore di Ricerca e Borsista di Ricerca c/o Centro
di Eccellenza ITC della Facoltà di Medicina e Chirurgia – Università Federico II Napoli) indirizzo: Via S. Panini,
n. 5 – Dipartimento di Chirurgia Generale e Tecnologie Avanzate (Edif. 6)
tel: 081. 7462515 – email: [email protected]
1)
TITOLO DEL PROGETTO: Valutazione di nuovi markers immuno-istochimici e bio-umorali della
infiammazione e della ipossia tissutale nella insufficienza venosa cronica.
2)
RICERCATORE PRINCIPALE: dott.ssa Rita COMPAGNA (Dottore di Ricerca e Borsista di Ricerca c/o
Centro di Eccellenza ITC della Facoltà di Medicina e Chirurgia – Università Federico II Napoli) indirizzo:
Via S. Pansini, n. 5 – Dipartimento di Chirurgia Generale e Tecnologie Avanzate (Edif. 6) tel: 081. 7462515 –
email: [email protected]
3)
AREA TEMATICA: INSUFFICIENZA VENOSA
4)
RAZIONALE SCIENTIFICO DEL PROGETTO:
Introduzione: Nell’ambito della insufficienza venosa cronica degli arti inferiori, la Sindrome Post-flebitica (SPF)
rappresenta l’insieme delle manifestazioni cliniche tardive conseguenti ad un processo trombotico che abbia interessato
il sistema venoso profondo di un arto (Trombosi Venosa Profonda: TVP). La formazione di un trombo all’interno di
una vena profonda segue un’evoluzione che può portare o meno alla ricanalizzazione del vaso (totale o parziale), alla
quale, soprattutto in mancanza di un adeguato trattamento nella fase acuta, residuerà un danno definitivo e
ingravescente non solo della parete e del sistema valvolare, ma anche, e soprattutto, del compartimento linfatico e
muscolo-cutaneo. L’incompetenza delle valvole del sistema venoso profondo e delle vene perforanti determina infatti il
prodursi di reflussi patologici in direzione delle vene superficiali, le quali subiscono gli effetti di un regime pressorio
sproporzionato alla loro struttura, con conseguente sofferenza tissutale, soprattutto evidenziabile a livello muscolare,
sottocutaneo e cutaneo. La compartecipazione delle strutture linfatiche contribuisce poi all’instaurarsi di un quadro
clinico di particolare intensità, con sintomatologia soggettiva, spesso assente o sottovalutata nelle fasi iniziali, ma
successivamente, a volte a distanza anche di anni, testimoniata da senso di pesantezza dell’arto, parestesie o vera e
propria dolenza e flebiti superficiali ricorrenti. L’evoluzione successiva, soprattutto in mancanza di un trattamento
efficace, è rappresentata dalla comparsa di edema cronico non riducibile, varici (definite “secondarie”), colorito
cianotico e alterazioni trofiche della cute e del sottocute fino alla comparsa di ulcerazioni, con tendenza alla recidiva ed
alla cronicizzazione. Per queste motivazioni, una volta riconosciuta una SPF, le finalità del trattamento sono rivolte al
miglioramento delle condizioni emodinamiche dell’arto e al contenimento dell’edema. Le possibilità terapeutiche in
caso di sindrome post-flebitica comprendono:
a)
Mezzi fisici (declivo-terapia, pressoterapia sequenziale, bendaggio elastico, calza elastica, massoterapia)
b) Farmacologici (anticoagulanti, emoreologici);
c)
Chirurgia: (interruzione sottofasciale delle vene perforanti (SEPS), safenectomie regolate, trattamento
chirurgico della incontinenza del circolo venoso profondo, valvuloplastiche, innesti cutanei)
d) Scleroterapia complementare o per il mantenimento dei risultati in occorrenza di recidive varicose che sono
particolarmente frequenti in questa condizione morbosa.
5) BACKGROUND and AIMS: Nel settore della Flebolinfologia, i vari trattamenti proposti ed applicati per la
insufficienza venosa cronica sintomatica (sindrome post-flebitica) hanno però finora ricevuto validazioni solo parziali e
poco standardizzabili, attraverso report scientifici basati prevalentemente su parametri clinici (sintomi clinici: senso di
peso e gonfiore dell’arto; edema della caviglia e del polpaccio; evidenza di varici; incidenza delle complicanze
flebitiche e/o ulcerative; tempi di guarigione delle ulcere; intervallo libero per la recidiva flebitica e/o ulcerosa; ecc.),
mentre non è stato finora individuato un modello di validazione che possa rilevare i gradi di alterazione dei tessuti
muscolari della gamba esposta alla stasi venosa cronica ai fini di una valutazione obiettiva delle varie procedure
terapeutiche offerte, in particolare per quelle di tipo farmacologico.
Recenti studi di immunoistochimica, di microscopia elettronica effettuati sul muscolo cardiaco e periferico, oltre a
numemerosi studi biochimici su sangue periferico e distrettuale, per lo studio della variazioni indotte dalle ischemia
acuta e cronica, ci hanno indicato la possibilità di valutare con efficacia e precisione alcuni indicatori di alterazioni
immunoistichimiche e bio-umorali (indotte dalla flogosi e dalla ipossia cronica) attraverso la titolazione di recettori di
cellule endoteliali (endoglina, laminina), muscolari (VEGF, CD4, CD8) e nervose (integrina, proteine MAP), al fine di
poter apprezzare il grado di sofferenza tissutale in caso di flogosi ed ipossia cronica da stasi venosa.
Tali studi immunoistochimici e bio-umorali possono quindi essere indicatori del grado di omeostasi tissutale e del
trofismo muscolare anche nel caso della insufficienza venosa cronica sintomatica (sindrome post-flebitica) e
rappresentare quindi i parametri ai quali riferirsi per dimostrare la presenza ed il grado della patologia, nonchè
l’eventuale efficacia della scelta terapeutica dei presidi fisici e chirurgici; e anche un modello di validazione obiettiva
circa l’efficacia dei presidi farmacologici proposti dalle industria farmaceutiche ai fini del loro riconoscimento
terapeutico.
6) END-POINTS DEL PROGETTO: Tale protocollo di ricerca si propone quindi quale
end-point principale: quello di determinare i range di normalità ed i range di patologia per IVC di markers
immunoistochimici tissutali e biochimici sierici sensibili alla patologia venosa cronica.
endpoints secondario: quello di verificare la variazione dei markers immuno-istochimici tissutali e biochimici serici
validati per IVC, dopo un periodo di terapia compressiva controllata.
Il raggiungimento di tali end-points rappresenta un significativo apporto alla ricerca biomedica nel settore della
flebolinfologia: l’interesse è rappresentato dalla possibilità di fornire in primis al mondo della ricerca industriale
farmaceutica, ed in generale alla ricerca flebologica, nuovi parametri di validazione dell’effetto terapeutico dei presidi
utilizzati nella terapia e nella profilassi delle complicanze della insufficienza venosa cronica sintomatica.
Ciò risulta di grande interesse:
- per indicare dei parametri alternativi a quelli clinici (esposti a numerosi bias di soggettività) per la verifica dei risultati
delle ricerche effettuate;
- per offrire standard bio-umorali su cui la ricerca farmacologia potrebbe indirizzarsi nel settore della prevenzione e
della terapia della insufficienza venosa cronica sintomatica;
- per ottenere con maggiore valenza il riconoscimento terapeutico di efficacia di un farmaco a livello della comunità
scientifica e delle autorità governative competenti alla validazione di efficacia, anche ai fini della commercializzazione;
- per offrire uno strumento scientifico adeguato a classificare e ottenere parametri specifici per precisare lo stato clinico
dei pazienti affetti da insufficienza venosa cronica sintomatica (finalità medico-terapeutiche, medico-legali e
assicurative).
Le ricadute pratiche nel settore della flebolinfologia potranno quindi essere sicuramente quelle di facilitare la ricerca
farmacologia ai fini della produzione di revisioni cliniche controllate (RCT) ed offrire ai clinici ed ai ricercatori un
modello supplementare di parametri ai quali fare riferimento per le scelte terapeutiche del settore.
7)
METODOLOGIA UTILIZZATA PER CONDURRE LA RICERCA:
La ricerca rappresenta uno studio osservazionale analitico di tipo caso-controllo, sequenziale, in cieco; non sono
indicate e necessarie procedure di randomizzazione.
L’organizzazione della ricerca è pluridipartimentale (Dipartimento di Chirurgia Generale e Tecnologie Avanzate,
Dipartimento di Patologia Sistematica e Genetica, Dipartimento di Igiene e Profilassi, Epidemiologia e Statistica
Medica) nell’ambito della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università degli Studi di Napoli Federico II.
La ricerca ha come obiettivo una indagine quantitativa e comparativa su alcuni dei più recenti e significativi
- markers immunoistochimici tissutali (endoglina, laminina, VEGF, CD4, CD8, integrina, proteine MAP) e
- bio-umorali (Trasforming Growth Factor alfa e beta, Vascular Endothelial Growth Factor A, Fibroblast
Growth Factor 2; LDH, CPK, mioglobina e ET-1 plasmatici)
riconosciuti nel settore della infiammazione cronica e della ipossia cronica tissutale, quale si verifica nelle
condizioni di insufficienza venosa cronica sintomatica.
La valutazione analitica avviene attraverso:
a) l’esecuzione di prelievi ematici (10 cc. da vena del braccio) e
b) biopsie muscolari seriate del muscolo gastrocnemio
in:
- un gruppo di soggetti adulti non affetti da IVC (gruppo controllo),
- un gruppo di soggetti adulti con insufficienza venosa cronica (IVC) sintomatica con edema cronico
(gruppo campione 1) e
un gruppo di soggetti adulti con IVC sintomatica complicata da ulcere venose (gruppo campione 2) .
La selezione viene effettuata scegliendo 20 soggetti per ogni gruppo, con i seguenti
- criteri di inclusione:
• età compresa fra 55 e 75 anni
• sintomi di IVC insorti da almeno 3 anni (per gruppi campione 1-2)
-
criteri di esclusione:
•
capacità di fornire consenso informato
•
•
•
•
•
•
•
•
partecipazione ad altri trial clinici
precedenti interventi chirurgici agli arti inferiori
diabete
malattie infiammatorie croniche
processi infettivi acuti in atto
processi febbrili, traumi o interventi chirurgici nei precedenti 60 giorni
terapia anticoagulante o antiaggregante piastinica in atto
arteriopatia periferica o coronariopatia acuta recente (ultimi 6 mesi)
Il progetto prevede l’esecuzione di n.3 procedure per ognuno dei 60 soggetti campionati, con seguenti tempi:
a) all’arruolamento dei soggetti (T0)
b) dopo 30 giorni di fasciatura compressiva con bendaggio fisso (ricambio settimanale) (T1)
c) dopo 60 giorni di fasciatura compressiva con bendaggio fisso (ricambio settimanale) (T2)
La procedura di investigazione consiste, previa adesione al protocollo di indagine attraverso la firma di un
consenso informato, nella esecuzione di indagini biochimiche su siero da prelievo venoso dal braccio, e di
indagini morfologiche, immuno-istochimiche e bio-umorali attraverso biopsie muscolari effettuate a livello del
muscolo gastrocnemio, secondo la seguente tecnica:
- Biopsia del muscolo gastrocnemio dell’arto (a destra per il gruppo controllo ed a livello dell’arto
interessato per i gruppi campione) con ago TRU-CUT 14G.
- Condizioni di sterilità: sterilizzazione cutanea secondo tecnica chirurgica; uso di guanti sterili, garze e
batuffoli sterili, telini sterili.
- Posizione del paziente: distesa prona.
- Anestesia locale (lidocaina 20% -5cc) iniettata progressivamente nella cute, sottocute, fascia e
muscolo.
- Incisione cutanea con bisturi (lama 11) per 4-5 mm.
- Introduzione sottocutanea dell’ago Tru-cut, dopo aver ottenuto emostasi da compressione per 5 min.,
- Biopsia muscolare, indirizzando l’ago caudalmente a 45°
- Compressione per 5 min., quindi cerotto adesivo sterile per chiusura della incisione, e bendaggio
compressivo (per ridurre il rischio di ematoma), con avviso di possibile dolore muscolare alla
deambulazione per i successivi 2-3 giorni).
-
I campioni bioptici vengono quindi inviati al laboratorio accompagnati da una mattonella refrigerante
e da una scheda di segnalazione con identificazione numerica. All’arrivo in laboratorio il campione
fresco viene congelato per immersione in isopentano pre-raffreddato in azoto liquido e conservato a –
80° C.
-
Con il criostato vengono eseguite sezioni seriali che sono colorate con metodi istologici ed istochimici
di routine quali ematossilina-eosina e tricromica di Engel per valutare forma e dimensioni delle
miofibre, il tessuto connettivo endomisiale e perimisiale e per l’evidenziazione delle cellule
infiammatorie), Periodic Acid Schiff (per l’evidenziazione di accumuli di polisaccaridi
intramiofibrali), colorazioni istoenzimatiche e di immunoistochimica.
Descrizione delle proteine analizzate:
Recettori di adesione cellulare e indicatori di metabolismo cellulare:
- La Endoglina è una glicoproteina di membrana di tipo I. Si trova sul recettore cellulare di superficie
del complesso del TGF-beta. Questa proteina è di 180 kDa con legami disolfuro. E' stato riscontrata
in prevalenza nelle cellule endoteliali, macrofagi attivati , fibroblasti e cellule muscolari lisce.
Endoglina è parte del complesso che forma il TGF-beta 1. Quindi potrebbe essere coinvolta in vari
recettori vincolanti, come TGF-beta 1, TGF-beta 3, activina-A, BMP2 e BMP7. Oltre ad essere
coinvolta nella via di segnalazione del TGF-beta, la endoglina può avere altre funzioni. E’ stato
ipotizzato il suo possibile coinvolgimento nella organizzazione del citoscheletro e della morfologia
cellulare, fattori che influenzano entrambi la migrazione delle cellule. La endoglina svolge anche un
ruolo importante nel sistema cardiovascolare per il rimodellamento vascolare. La sua espressione è
regolata durante lo sviluppo dei vasi. Negli esseri umani, endoglina sembra essere implicata in una
malattia autosomica dominante conosciuta come telangiectasia emorragica ereditaria di tipo 1. Questa
malattia è caratterizzata da frequenti sanguinamenti dal naso, teleangectasie della pelle e delle mucose
-
-
e può causare malformazioni artero-venose in diversi organi, compreso cervello, polmoni e fegato.
La laminina è una famiglia di glicoproteine che consistono di tre diverse catene polipeptidiche legate
da ponti disolfuro. Ne sono stati identificati 15 tipi e le loro molecole assumono la forma di una croce
con tre bracci corti ed uno lungo. Pesa 800 kDa: 400kDa la catena A e 200kDa le catene B1 e B2 che
legano il collagene di tipo IV. La laminina non è sintetizzata da fibroblasti, bensì dalle cellule
epiteliali.
Le laminine influenzano, al pari della fibronectina, la migrazione embrionale, la crescita ed il
differenziamento cellulare, ad esempio mediando lo spostamento delle cellule germinali primordiali
dal sacco vitellino embrionale alle gonadi in via di sviluppo, attraverso il circolo sanguigno. Le
laminine possono anche legare altre laminine, proteoglicani, collagene e altri componenti della
matrice extracellulare. Alcuni studi evidenziano che laminine e molecole di collagene IV compongono
reti interconnesse nella membrana basale che conferiscono a quest'ultima forza ed elasticità.
Con la terminologia fattore di crescita dell'endotelio vascolare (in inglese vascular endothelial growth
factor, da cui la sigla VEGF) si usa indicare una specifica sottofamiglia di fattori di crescita coinvolta
sia nella vasculogenesi (intesa come genesi ex novo di un sistema circolatorio in età embrionale) sia
nell'angiogenesi (la formazione di vasi da strutture già esistenti). Tutti i membri della famiglia VEGF
stimolano risposte cellulari legandosi ai recettori tirosin-chinasici sulla superficie cellulare,
forzandone la dimerizzazione e l'attivazione tramite transfosforilazione. I recettori per VEGF hanno
una porzione extracellulare consistente in 7 domini simili a immunoglobuline, una singola porzione
attraversante la membrana e una porzione intracellulare contenente un dominio tirosina chinasi. Il
VEGF-A si lega con i recettori VEGFR-1 (Flt-1) e VEGFR-2 (KDR/Flk-1): di questi il secondo media
quasi tutte le risposte cellulari note al VEGF, il primo invece, meno conosciuto, pare modulare
l'attività dell'altro.. Un'altra funzione del VEGFR-1 potrebber essere di agire da inibitore competitivo
nei confronti del 2, riducendone l'attività. Esiste inoltre un terzo recettore, VEGFR-3, in grado di
legare VEGF-C e VEGF-D intervenendo nella linfo-angiogenesi.
Indici di flogosi cellulare e stato immunitario:
- La glicoproteina CD4 è una proteina transmembrana di 55 kDa presente su Linfociti T definiti CD4 +
o Helper. Riconosce il complesso TCR-MHC di classe II ed è necessario insieme al CD3 ed alla
catena zeta nella trasduzione del segnale di riconoscimento antigenico. Probabilmente anche in vivo,
come in vitro, esplica questa funzione favorendo la formazione di un reticolo di un gran numero di
complessi TCR - MHC di classe II - CD3-CD4. Il CD4 appare inoltre un marker specifico di flogosi
del microcircolo linfo-venoso.
- La glicoproteina CD8 (chiamata anche T8, Leu-2 o Lty-2) è una proteina transmembrana
omodimerica (α-α) o eterodimerica (α-β) presente sui linfociti T citotossici e su una piccola
popolazione di linfociti T Helper. La presenza di questo antigene sulla superficie della cellula assegna
il linfocito alla popolazione denominata CD8+: la sua titolazione è molto sensibile alla ipossia
muscolare. La proteina interagisce con la porzione laterale del complesso recettore TCR-MHC di
classe I e forse fa da ponte nella formazione di un polimero di complessi. La parte intracitoplasmatica
trasduce un segnale attivatorio in conseguenza del riconoscimento.
- La integrina, o recettore all'integrina, è una glicoproteina integrale di membrana presente nella
membrana cellulare che lega le proteine della matrice extracellulare, in particolare le fibronectine.
Svolge un ruolo nel collegamento della cellula con la matrice extracellulare (MEC) e nella
trasduzione del segnale dalla MEC alla cellula. Vi sono molti tipi di integrina e molte cellule ne hanno
svariati tipi sulla loro superficie. La connessione della cellula alla matrice extracellulare è un requisito
base per formare un organismo pluricellulare. Le integrine non sono dei semplici ganci, ma danno alla
cellula informazioni circa la natura dell'ambiente circostante. Insieme ai segnali provenienti dai
recettori dei fattori di crescita solubili come il VEGF, l' EGF e molti altri, determinano la decisione
cellulare su quale azione biologica intraprendere, sia essa collegamento, movimento, morte o
differenziazione. Così le integrine stanno al cuore, sia letteralmente che figurativamente, di molti
processi cellulari.
- In biologia cellulare, le proteine associate ai microtubuli (conosciute con l’acronimo di MAP) sono
proteine che interagiscono con i microtubuli del citoscheletro cellulare. La XMAP215 è generalmente
coinvolta nella stabilizzazione dei microtubuli. Durante la mitosi l’instabilità dinamica dei
microtubuli è stata osservata crescere di approssimativamente dieci volte. Questo è in parte dovuto
alla fosforilazione di XMAP215, il quale produce la rapida depolimerizzazione dei microtubuli. In
questo modo la fosforilazione delle MAP gioca un ruolo nelle mitosi. Ci sono molte proteine MAP il
cui effetto condiziona il microtubulo, come la catastrofina, la quale destabilizza i microtubuli, la
catanina, che li scinde, le proteine associate al legame citoplasmatico (CLASP), le quali facilitano le
interazioni con la membrana plasmatica, e un numero di proteine motrici che trasportano le vescicole
lungo i microtubuli. Le MAP legano direttamente i microtubuli per stabilizzarli o destabilizzarli e
unirli a varie componenti cellulari inclusi altri microtubuli.
Markers Bio-umorali:
- Il fattore di crescita trasformante alfa (TGF-α, Transforming growth factor alpha in inglese) è un
fattore di crescita prodotto dai macrofagi, dalle cellule cerebrali e dai cheratinociti. Tale fattore di
crescita risulta iperespresso in alcune neoplasie umane. Si può legare al recettore del fattore di crescita
epidermale (EGFR) con effetti simili. Stimola anche la proliferazione delle cellule neuronali nelle
patologie neurodegenerative come è emerso al Congresso degli Stati Uniti dei National Institutes of
Health sulle cellule staminali del 2001.
-
Fattore di crescita trasformante-β (TGF-β, Transforming growth factor beta in inglese) è prodotto
da piastrine, macrofagi, linfociti. È sintetizzato in due forme, una latente ed una attiva. La forma attiva
si lega al recettore2 formando un complesso stabile primario, il quale si lega al recettore1formando il
complesso stabile secondario, che comporta la fosforilazione dei fattori di trascrizione SMAD2 e 3, i
quali poi si legano al fattore di trascrizione SMAD4. Ne risulta un eterodimero che è capace di entrare
all'interno del nucleo e favorire o inibire l'attivazione genica. Il TGF-β, determina l'aumento di
concentrazione di fattori inibenti le CDK, comportando il blocco del ciclo cellulare. Inoltre, interviene
nella stabilizzazione dei vasi sanguigni neoformati, reclutando proteine della matrice cellulare.
-
Il FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) è un gene che agisce attraverso una famiglia di recettori
tirosino chinasici, tra cui FGFR1 (Fibroblast Growth Factor Receptor 1). E’ stato recentemente
dimostrato che l’inattivazione selettiva di FGFR1 nel CNS di topo e’ in grado di diminuire la
proliferazione di progenitori neuronali e il numero di neuroni periferici e muscolari, influenzando la
struttura assonale solo marginalmente. L’inattivazione di tale recettore potrebbe rappresentare uno
strumento utile per analizzare il ruolo di questo sistema nei disturbi neuro-vascolari.
-
La L-lattato deidrogenasi (o LDH) è un enzima, appartenente alla classe delle ossidoreduttasi, che
catalizza la seguente reazione: (S)-lattato + NAD+ ⇄ piruvato + NADH + H+. LDH è un tetramero
formato da due tipologie di monomeri: il tipo H (H dall'inglese heart), maggiormente presente nel
cuore, e il tipo M, caratteristico del muscolo. Dalla diversa composizione monomerica, si hanno
cinque forme isoenzimatiche: LDH1, LDH2, LDH3, LDH4, LDH5 che differiscono tra loro per
composizione strutturale, proprietà biochimiche e diffusione tissutale. Valori normali nel siero sono
considerati compresi tra 100-240 UI/L e nelle urine tra 800-3600 UI/L. In termini di rapporto fra
isoenzimi, valori normali sono considerati: LDH1 18-30%, LDH2 28-30%, LDH3 15-30%, LDH4 616%, LDH5 2-13%. Valori anomali di LDH1 e LDH2 si riscontrano nell'infarto miocardico e
nell'anemia emolitica. Il livello di LDH1, a seguito di infarto del miocardio, raggiunge il picco dopo
48 h e rimane alterato per 1-3 settimane. In particolare i livelli di LDH3 sono aumentati in relazione a
trombosi venosa profonda ed embolia polmonare.
-
La fosfochinasi (CPK), è un enzima prodotto da varie specie tissutali che appartiene alla classe delle
transferasi. La sua funzione consiste nel catalizzare la trasformazione della creatina a fosfocreatina,
consumando ATP e liberando energia chimica. Catalizza la seguente reazione: ATP + creatina = ADP
+ fosfocreatina + H+. La reversibilità della reazione permette di liberare energia sotto forma di ATP
sfruttando la defosforilazione della fosfocreatina. Sono poche le reazioni dove l'ATP dona energia a
una molecola tramite idrolisi perché principalmente fornisce energia alle altre molecole per
trasferimento di gruppi fosfato. L'idrolisi in sè produce solo la liberazione di calore che non può
essere usata in sistemi omeotermi. ATP può dunque o donare un gruppo fosforico o donare
l'Adenilato. L'adenilazione è fondamentale per portare l'acido grasso a un livello energetico superiore
preparandolo cosi al suo legame con il trasportatore: rappresenta quindi un markers metabolico della
stabilità cellulare, specie a livello muscolare.
-
La mioglobina è una proteina globulare la cui funzione specifica è quella di legare reversibilmente
l'ossigeno. Fu studiata dal vincitore del Nobel John Kendrew attraverso i tessuti di cetaceo
(capodoglio). La sua funzione fisiologica è quella di trasportatore intracellulare di ossigeno in cellule
specializzate (fibrocellule muscolari) che per espletare al meglio la loro funzione contrattile in
condizioni aerobiche richiedono che grosse quantità di ossigeno siano convogliate verso i mitocondri
per le necessità della catena respiratoria. La mioglobina, in pratica, favorisce una rapida diffusione
dell'ossigeno in queste cellule ed il suo meccanismo di azione è alquanto diverso da quello della
emoglobina. Pertanto, si trova in grande quantità nei muscoli a cui conferisce stabilità cellulare in
situazioni di ipossia.
-
L’ Endothelina-1 (ET-1) è un peptide composto da 21 aminoacidi isolato dal sovranatante di colture
di cellule di endotelio di aorta porcino, con una potente azione vasocostrittrice, in vitro e in vivo. La
sua azione ET-1 coinvolge il turnover del fosfatidilinositolo, la mobilizzazione del calcio
intracellulare e l’attivazione della protei-chinasi C. Le cellule endoteliali hanno distinti recettori per
differenti ormoni idrosolubili, fra cui l’angiotensina svolge un ruolo prevalente nella regolazione delle
cellule muscolari lisce che regolano le resistenze periferiche vascolari, attraverso il rilascio dell’ET-1.
Questo meccanismo può avere un importante ruolo fisiopatologico in condizioni di stress cellulare,
come in caso di anossia da stasi vascolare.
8)
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PLoS One. 2011;6(6):e21250
9) PARAMETRI UTILIZZATI PER L’ANALISI DEI RISULTATI DELLA RICERCA
Valutazioni statistiche saranno effettuate sui risultati quantitativi ottenuti con analisi grafica descrittiva per studi
primari e mediante test di significatività (P-value, analisi multivariata, chi-square test).
I criteri di validazione saranno invece verificati con i test di sensibilità, specificità, predittività positiva e
negativa.
10) RISORSE ECONOMICHE NECESSARIE PER LO SVOLGIMENTO DELLA RICERCA
Il progetto prevede i seguenti costi:
a) personale di ricerca (n.3)
(60.000 euro)
b) Copertura assicurativa per i pazienti (n.60)
(30.000 euro)
c) costi delle procedure di prelievo (n.120)
(12.000 euro)
d) costi delle analisi immuno-istochimiche (n.960)
(48.000 euro)
e) costi delle analisi laboratoristiche (n. 960)
( 5.760 euro)
f) raccolta dei dati ed analisi statistica
( 1.000 euro)
g) costi di diffusione (pubblicazioni e congressi)
( 5.000 euro)
11) DURATA DEL PROGETTO
Il progetto prevede uno sviluppo che si estende con la seguente tempistica:
a) Fase di preparazione amministrativa del progetto
2 mesi
b) Fase di arruolamento dei pazienti
6 mesi
c) Fase di controllo 1
1 mese
d) Fase di controllo 2
1 mese
e) Fase di analisi dei risultati
2 mesi
f) Fase di pubblicazione e diffusione dei risultati
2 mesi
Si prevede pertanto che tale progetto possa essere contenuto nell’ambito di 12 mesi.
Un report trimestrale verificherà l’avanzamento dello studio e valuterà eventuali necessità di ampliamento
temporale delle fasi previste. Il report trimestrale segnalerà il numero di soggetti arruolati, il numero delle
procedure di prelievo effettuate, ed il numero e la tipologia delle analisi effettuate.
12) STRATEGIE PER LA DIVULGAZIONE DEI RISULTATI
La diffusione prevede:
a) Report preliminari in sede di incontri di “Journal Club” e seminari dipartimentali nell’ambito
dei dipartimenti coinvolti (Dipartimento di Chirurgia Generale e Tecnologie Avanzate,
Dipartimento di Patologia Sistematica e Genetica, Dipartimento di Igiene e Profilassi,
Epidemiologia e Statistica Medica)
b) La partecipazione a Congressi di settore (Biochimica, Genetica, Cardiologia, Angiologia,
Flebologia, Chirurgia Vascolare) con Oral Reports
c) La pubblicazione su riviste di settore peer-review
13)
DICHIARAZIONE DI ASSUNZIONE DI RESPONSABILITA’ DEGLI OBBLIGHI DI LEGGE
RELATIVE ALLA CONDUZIONE DI PROGETTI DI RICERCA DA PARTE DEL RICERCATORE
PRINCIPALE
Il Ricercatore principale si impegna affinché le procedure riportate nello studio riguardanti la conduzione, lo
svolgimento e la documentazione siano sottoposte al Comitato Etico della struttura di appartenenza (Università
degli Studi di Napoli Federico II – Facoltà di Medicina e Chirurgia), nonché siano approntate per assicurare che
si tenga fede ai principi etici riportati nella Dichiarazione di Helsinki e sue revisioni.
Lo studio verrà condotto tenendo conto dei requisiti regolatori e degli adempimenti di legge. In particolare, il
riferimento normativo è rappresentato dal DL n.211, 24/06/2003 e DM 17/12/2004 sugli studi no profit.
Inoltre:
- Prima della registrazione, tutti i pazienti potenzialmente eleggibili riceveranno le informazioni complete sullo
studio.
- Per poter essere registrati sarà necessario che i pazienti diano il consenso al trattamento dei dati personali in
forma anonima ed aggregata, ai sensi della legge 675/1996 e della legge legge 196/03 sulla tutela delle persone
e rispetto al trattamento dei dati personali.
- I moduli di informazione dei pazienti e di esplicitazione del consenso sono riportati in allegato
- Una lista di decodifica del codice paziente esisterà esclusivamente presso il centro dipartimentale e presso la
segreteria dello studio.
Eventuali eventi avversi gravi che si verifichino nel corso del trattamento e nei 30 giorni successivi
all’interruzione del trattamento saranno raccolti e trasmessi utilizzando la “Scheda di segnalazione eventi
avversi gravi” (SEAG). La SEAG dovrà essere compilata ed raccolta dalla segreteria dello studio entro il
termine massimo di 2 giorni lavorativi dal momento in cui lo sperimentatore sia venuto a conoscenza
dell’evento.
Allegato A “Lettera informativa per i soggetti reclutati”
PROGETTO DI RICERCA:
Valutazione di nuovi markers immuno-istochimici e bio-umorali della infiammazione e della
ipossia tissutale nella insufficienza venosa cronica.
Gentile Signore/a,
come Lei sa, le è stato/a diagnosticato/a una insufficienza venosa cronica complicata. Il trattamento di
questa malattia richiede elastocompressione, ed eventuale terapia chirurgica e/o farmacologia
Il trattamento oggetto dello studio è la valutazione di parametri genetici e laboratoristici per indirizzare il
miglior procedimento terapeutico adatto alla sua malattia.
La invitiamo quindi a partecipare ad uno studio clinico che prevede n.3 prelievi di sangue e n.3 biospie
muscolari effettuate dalla sua gamba. In anestesia locale, in regime ambulatoriale.
Prima di decidere liberamente se vuole partecipare o meno, legga attentamente questa scheda e ponga al
suo medico tutte le domande che riterrà opportuno fare al fine di essere pienamente informato/a degli scopi,
delle modalità di effettuazione e dei possibili inconvenienti connessi con lo studio.
L’obiettivo di questo studio è quello di individuare markers genetici e laboratoristici specifici per la
insufficienza venosa cronica complicata.
E’ possibile che la la procedura di elastocompressione che le verrà effettuata comporterà un beneficio del
suo stato patologico attuale, riducendo anche il rischio eventuale di una ricaduta in futuro. Tuttavia è anche
possibile che il trattamento oggetto dello studio non determini per Lei nessun vantaggio clinico duraturo. I
risultati di questo studio aiuteranno comunque a definire il trattamento ottimale per altre persone affette dalla
sua stessa malattia.
Le eventuali terapie alternative al trattamento proposto sono la terapia chirurgica, la terapia sclerosante e la
elastocompressione con tutori terapeutici.
Se deciderà di partecipare allo studio riceverà il trattamento elastocompressivo con fasciature per la durata
di circa 8 settimane.
Prima di iniziare il trattamento le verranno richiesti alcuni esami di laboratorio e strumentali. Questi esami
serviranno a caratterizzare meglio la sua malattia.
La controindicazione più frequente legata al procedimento terapeutico di elastocompressione può essere
rappresentata da fenomeni allergici transitori.
Nel caso compaiano i suddetti sintomi, la invitiamo a contattare subito il suo medico di riferimento che ne
controllerà la gravità e la seguirà nella cura fino alla loro risoluzione. Qualora il trattamento dovesse
dimostrarsi per Lei troppo fastidioso, causandole cioè degli effetti collaterali importanti, tali da peggiorare la
Sua qualità di vita, verrà comunque sospeso.
Ogni cura è stata presa e continuerà ad essere presa per prevenire qualunque problema connesso alla Sua
partecipazione allo studio. Nel caso decidesse di partecipare, Lei sarà garantito da una copertura
assicurativa.
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina dell’Università degli Studi di
Napoli, e sarà condotto secondo i principi definiti dalla Conferenza di Helsinki sui diritti del paziente.
La decisione di partecipare a questo studio deve essere presa liberamente e senza alcuna pressione, con
tutto il tempo necessario per decidere e/o consultarsi con i familiari e/o il medico curante. Lei potrà in
qualsiasi momento porre tutte le domande che desidera e può scegliere di non eseguire questo particolare
trattamento e procedure, o accettare ora e decidere in seguito di sospenderle; non dovrà esserci in nessun
caso alcuna particolare giustificazione da parte Sua, e verrà comunque seguito/a con la massima attenzione
e trattato con la migliore terapia altrimenti disponibile.
I suoi dati clinici verranno trattati con riservatezza e utilizzati solo in relazione all'analisi statistica dello
studio.
Per qualsiasi problema o domanda concernente lo studio, i suoi diritti come partecipante o i possibili effetti
collaterali potrà contattare il:
Dr.ssa RITA COMPAGNA al seguente n. telefonico 081.7462515
Allegato B “Consenso informato del paziente”
Il mio nome e cognome da me personalmente scritti e la mia firma qui sotto indicano che ho letto o mi
hanno letto tutte le informazioni sopra riportate circa questa ricerca clinica, comprese quelle relative al
trattamento, alle procedure ed alla durata dello studio, ai rischi possibili, agli effetti collaterali ed ai possibili
benefici. Il contenuto e il significato di queste informazioni mi sono stati spiegati in modo esauriente e con
un tempo adeguato e li ho compresi.
Acconsento volontariamente a partecipare alla ricerca sopra descritta. Autorizzo inoltre, ai sensi e per gli
effetti del d. lgs 196/2003, il medico sperimentatore, gli incaricati del monitoraggio e dell’analisi statistica ed i
funzionari delle Autorità Sanitarie eventualmente interessati allo studio ad esaminare i miei dati personali,
inclusi quelli relativi al mio stato di salute (dati sensibili).
Riceverò una copia firmata di questo Consenso Informato.
NOME E COGNOME DEL PAZIENTE…………………………………………..
FIRMA DEL PAZIENTE…………………………………………DATA…………
NOME E COGNOME DEL MEDICO SPERIMENTATORE………………………………..
Confermo di aver spiegato quanto sopra al paziente alla data dichiarata su questo Consenso informato.
FIRMA DELLO SPERIMENTATORE………………………….DATA………….
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