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MBL Oligomer ELISA Kit
MBL Oligomer ELISA Kit KIT 029 IVD :_W]deij_Yi IT MBL Oligomer ELISA Kit MBL Oligomer ELISA Kit Leggere attentamente queste istruzioni DESTINAZIONE D’USO Per la determinazione in vitro della lecitina legante mannosio nel siero e nel plasma-eparina. IMPORTANZA CLINICA Determinazione della suscettibilità alle infezioni e quindi di una aggressiva somministrazione di antibiotici in: Pazienti sottoposti o che stanno per sottoporsi a chemioterapia o a trattamento immunosoppressivo Pazienti affetti da fibrosi cistica Bambini con infezioni ricorrenti Può anche essere usato come marker prognostico della gravità della malattia nell’artrite reumatoide e nel lupus eritematoso sistemico. • • • La lecitina legante-mannosio (MBL, chiamata anche proteina legante il mannosio) è una proteina multimerica che si lega ai carboidrati, prodotta nel fegato e secreta nel sangue dove costituisce un importante elemento nella immunodifesa innata contro microrganismi invasori. Le sue forme di norma oligomerizzate si associano alle specifiche pro-proteasi del siero (le MASP) che si attivano quando MBL si lega alle superfici microbiche del carboidrato e, successivamente, attivano il complemento attraverso il percorso di MBL o della lecitina1. La mancanza di MBL normalmente oligomerizzata può essere associata con una accresciuta suscettibilità alle infezioni quando il sistema immune adattivo è immaturo (nella prima infanzia) 2 o è stato soppresso (per es. dopo un trapianto o durante la chemioterapia) 3. La mancanza è anche associata con gravi malattie auto-immuni come il lupus eritematoso sistemico (SLE) 4 o l’artrite reumatoide5 e con una prognosi infausta nella fibrosi cistica 6. La mancanza di MBL può essere causata da varianti alleliche nelle regioni promotrici e/o strutturali del gene MBL7. Certi alleli promotori vengono associati con concentrazioni di MBL più basse nel siero mentre le varianti strutturali hanno effetto sia sulla normale oligomerizzazione di MBL che 2 sulla sintesi totale della catena. Soggetti omozigoti per un difetto strutturale mostrano livelli di MBL oligomerizzerata molto bassi mentre gli eterozigoti mostrano livelli basso-intermedi. In 100 donatori di sangue danesi sani, le concentrazioni di MBL nel siero determinate da un immunotest oligomeroselettivo mostrarono valori bassi (<50 ng/mL) in 12 soggetti Ciò era dovuto ad una serie di combinazioni di alleli strutturali e/o promotori7. Questo indica la prevalenza, in una popolazione occidentale, di bassi livelli di MBL che possono dare origine a manifestazioni cliniche. Non si sa perché, però, alcuni soggetti con bassi livelli di MBL mostrano una accresciuta suscettibilità alle infezioni; tra le spiegazioni c’è la possibilità di differenze nell’esposizione o la possibile necessità della coesistenza di un’altra, magari leggera, immunodeficienza. La determinazione delle concentrazioni di MBL nel siero può essere utile per chiarire sospetti difetti immuni e come indicatore prognostico che avvisa della necessità di misure terapeutiche o profilattiche maggiori in pazienti immunosoppressi tra cui quelli sottoposti a chemioterapia e quelli affetti da fibrosi cistica, SLE o artrite reumatoide. PRINCIPIO DELLA PROCEDURA DEL TEST Si tratta di un test ELISA eseguito in micropozzetti rivestiti di anticorpo monoclonale contro il dominio MBL che si lega ai carboidrati. MBL legata viene rilevata con lo stesso anticorpo che è stato etichettato con biotina, seguito dallo sviluppo di streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP) e incubazione con un substrato cromogenico. Il confronto dei risultati del test con la cromatografia della dimensione molecolare della immunoreattività di MBL in singoli campioni di siero umano, suggerisce che l’anticorpo monoclonale usato è selettivo per gli oligomeri MBL se usato sia come anticorpo di cattura che di rilevamento. Il test è una procedura in quattro fasi: Fase 1. Aliquote di calibratori, campioni di siero diluiti e qualsiasi controllo vengono incubati in micropozzetti pre-rivestiti con anticorpo monoclonale contro MBL. MBL presente nella soluzione si legherà ai pozzetti rivestiti di anticorpo attraverso i Plates are precoated with ManOligomer ELISA Kit nan. Mannan TheMBL plates are ready for use IT domini leganti i carboidrati. Il materiale non legato viene rimosso per mezzo di lavaggio. Fase 2. Anticorpo biotinilato MBL monoclonale di rilevamento viene aggiunto a ciascun pozzetto e incubato. L’anticorpo di rilevamento si attacca agli oligomeri MBL attraverso i domini leganti i carboidrati che non sono occupati essendo legati al rivestimento. L’anticorpo di rilevamento non legato viene rimosso per mezzo di lavaggio. Fase 3. Streptavidina-HRP viene aggiunta a ciascun pozzetto a formare un complesso con l’anticorpo biotinilato legato. Il coniugato non legato viene rimosso per mezzo di lavaggio. Fase 4. Un substrato cromogenico per la perossidasi contenente tetrametilbenzidina (TMB) viene aggiunto a ciascun pozzetto del test. La HRP-streptavidin legata reagisce con il substrato generando un prodotto colorato. La reazione enzimatica viene interrotta chimicamente e l’intensità del colore viene letta a 450 nm in un lettore ELISA. La densità del colore (densità ottica) è una funzione della concentrazione delle forme oligomeriche di MBL originariamente aggiunta a ciascun pozzetto. I risultati per i calibratori vengono utilizzati per costruire una curva di calibrazione da cui vengono lette le concentrazioni di MBL presenti nei campioni. Mannan Plates are precoated with ManMannan Mannan nan.Mannan The plates are ready for use 1 hour Plates are precoated precoated with with ManManare MBL PRINCIPIOPlates DELLA PROCEDURA DEL TEST Mannan nan. The plates are ready for use Plates are precoated with ManMannan nan. The plates are ready forManuse Plates are precoated with nan.Mannan Theplates platesMBL areready readyfor foruse use 1 hour Mannan Anticorpo nan. The are Diluted samples and calibrators Plates are precoated precoated with with ManManMBL Plates are are added to each well and Le sono pre-rivestite con an-1 hour nan.piastre The plates are ready for useincuPlates are precoated with Mannan. The plates are ready for use 1 hour Plates are precoated with Manticorpo primario MBL. Lecalibrators piastre bated MBL nan.MBL The platesare areand ready foruse usesono11hour Diluted samples hour nan. The plates ready for pronte per l’uso MBL to each well and incuare MBL added Diluted samples samples and and calibrators calibrators 11hour hour 1 hour bated Diluted B MBL are added to each each wellcalibrators and incu- 1 hour Diluted samples and calibrators MBL MBL are added to well and incuBiotinylated MBL antibody Diluted samples and 1 hour bated areBadded added to each each well well and and incuincu- 1 hour MBL to bated are MBL Campioni e calibratori sono agDiluted samples and diluiti calibrators bated Biotinylated MBL antibody Diluted samples and calibrators bated Biotinylated detection antibody giunti a ciascun pozzetto eand incubati are added to each each wellcalibrators incu- is1 hour Diluted samples and are well and incuBadded 1 hour Diluted samples and calibrators B added to to each well and incubabated Biotinylated MBL antibody are added to each well and incuBiotinylated detection antibody is 11hour hour bated Biotinylated areBBadded to eachMBL well antibody and incuted Biotinylated MBL antibody bated added to each well and incubaAnticorpo Biotilinata MBL Biotinylated MBL antibody bated Biotinylated detection antibody antibody isis 11hour hour tedB Biotinylated detection B Anticorpo MBL diincubarivelazione Biotinylated MBL antibody added toBiotilinata each well and Biotinylated detection antibody is 1 hour 1 hour MBL antibody added to each well and incubaBiotinylated detection antibody is B Biotinylated B èted aggiunto a ciascun pozzetto e incu-1 hour added to each each well and incubaBiotinylated MBL antibody 1 hour ted Streptavidin -and HRP added to well incubaMBL antibody batoBiotinylated Biotinylated detection antibody ted Streptavidin HRP Biotinylated detection antibody isis ted added to each each well and and incubaBiotinylated detection antibody 1 hour added to well incuba1 hour Biotinylated detection antibody isis is HRP-conjugated streptavidin ted Streptavidin -streptavidin HRP added to each each well well and incubaincubaHRP-conjugated is 11hour hour Streptavidina HRP-conjugata ted Streptavidin HRP added to and added to each eachwell well and incubaStreptavidin HRP ted Streptavidin added to and incuba--HRP ted Streptavidina HRP-conjugata -è aggiunted HRP-conjugated streptavidin hour ted HRP-conjugated streptavidin isis 11hour ta a ciascun pozzetto e and incubata Streptavidin HRP added to each each well incubaHRP-conjugated streptavidin hour Streptavidin --streptavidin HRP added to well and incubaHRP-conjugated isis 11hour ted added to each each well well and incubaincuba- 15 min.15 min. Streptavidin HRP ted added to and Streptavidin --HRP HRP-conjugated streptavidin isis SS ted TMB Substrate Substrato TMBstreptavidin TMB Substrate HRP-conjugated ted added to each each well well and incubaincubaHRP-conjugated streptavidin min. added to and HRP-conjugated streptavidin isis 1515min. S Ilted aggiunto aeach ciascun TMB Substrate added to each each well to and incubaSubstrate isè added well.poz-1515min. S substrato min. ted TMB Substrate added to well and incubaSubstrate is added to each well. zetto. Sviluppare 15 minutiinal the buio S TMB Substrate ted Develop for 15perminutes S TMB Substrate ted Develop foradded 15 minutes in the Substrate to each each well. well. 15 min. dark Substrate isis added to 15 min. S dark TMB Substrate Develop for 15 minutes in the 15 min. Substrate is added to each well. S Soluzione di Arresto TMB Substrate Develop for 15 minutes in the Substrate is added to each well. 15 min. S dark Develop for 15 minutes minutes inin the the TMBfor Substrate S dark Develop 15 TMB Substrate Substrate added to to each well. a Soluzione di Arresto viene aggiunta darkStop solution Substrate isis added each well. dark ciascun pozzetto. Leggere la well. piastra Develop for 15 minutes minutes the Substrate added to each each Stop solution Develop for 15 ininwell. the Substrate isis added to entro 30 min. dark Stop solution Develop for 15 15 minutes the Stop Solution is minutes added toinineach dark Stop solution Develop for the Stop solution dark Read plate within 30 min. misuIwell. risultati qualitativi siadded ottengono Stop solution dark Stop Solution is to each Stop Solution Solution added to each each450 rando le assorbanze dei pozzetti Stop isis added to well. Read plate within 30 min. Stop solution well. Read plate within 30 min. Stop Solution is added to each nm Quantitative results are obtained Stop solution well. Read plateiswithin 30to min. Stop Solution added each well. Read plate within 30min. min. of Stop solution by measuring the absorbances well. Read plate within 30 Stop solution Stopwells Solution added toobtained each Quantitative results Quantitative results areare obtained the at 450 Stop Solution isisnm added to each Quantitative results are obtained well. Read plate within 30obtained min. by measuring the absorbances of of Quantitative results are Stop Solution added to each by measuring the absorbances well. Read plate within 30 min. by measuring the absorbances of Quantitative results are obtained Stop Solution isis added to each the wells at 450 nm by measuring the absorbances of assay well. Read plate within 30min. min. Total time less 3 the wells at 450 nm wells at 450 nm by measuring the absorbances of well. Read plate within 30 Quantitative results are obtained obtainedthan 4 hours the wellsat at450 450 nm are Quantitative results the wells nm by measuringresults the absorbances of assay time less Total Quantitative are obtained B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B S S B S B B S B B S B S S S S S B B S B S S S S B B S B B B S S S S S S B B S B S S S S S S B B S B B B MBL Oligomer ELISA Kit COMPONENTI DEL KIT Articolo 3a Contenuto Quantità 1 12 x 8 Pozzetti ricoperti + supporto 96 pozzetti 2 Diluente per campione 1 x 60 mL - 3h Calibratori MBL, 1-8 8 x 1 mL 4 25x soluzione di lavaggio concentrata 1 x 30 mL 5 Anticorpo biotinilato MBL 1 x 12 mL 6 Streptavidina-HRP 1 x 12 mL 7 Substrato TMB 1 x 12 mL 8 Soluzione di arresto 1 x 16 mL Nota: i reagenti liquidi contengono i conservanti azoturo di sodio, timerosal o Bronidox L. Le sostanze in esso contenute possono essere nocive se ingerite. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1.Micropipette regolabili in una gamma da 1 a 1000 µL e corrispondenti punte per pipette usa e getta 2.Provette il polipropilene in grado di contenere fino a 1000 µL 3.Porta-provette 4.Micropipetta regolabile da 8- o 12-canali (gamma 50-250 µL) o micropipetta a ripetizione (opzionale) 5.1 cilindro pulito graduato da 1 L 6.Acqua deionizzata e distillata 7.Coperchio per micropiastra 8.Contenitore pulito per soluzione di lavaggio diluita 9.Dispositivo per pulire i pozzetti durante la procedura di lavaggio (opzionale) 10.Fazzoletti di carta non garzati o carta assorbente 11.Serbatoi per pipettaggio usa e getta 12.Timer (60-minuti) 13.Lettore a piastra ELISA calibrato in grado di leggere a 450 nm (preferibilmente sottraendo i valori di riferimento a 650° 620 nm) 4 14.Ipoclorito di sodio (candeggiante domestico diluizione 1:10) per la decontaminazione di campioni, reagenti e materiali) PRECAUZIONI Solo per uso diagnostico in vitro 1.L’utilizzo di questo kit è riservato esclusivamente a personale di laboratorio qualificato. 2.I calibratori MBL furono preparati da MBL purificata di plasma umano. Ciascuna unità di sangue usata per la preparazione fu testata secondo metodi approvati e trovata non reattiva per l’antigene superficiale dell’epatite B (HBsAg) e per anticorpi contro il virus da immunodeficienza umana (HIV) e il virus dell’epatite C (HCV). Inoltre il prodotto fu sottoposto a procedure di disattivazione dei virus. siccome, però, nessuna metodica di test può offrire la completa sicurezza che siano assenti agenti infettivi, i calibratori e i campioni dei pazienti devono essere maneggiati a livello di biosicurezza 2 come raccomandato nel manuale CDC/ NIH “Biosafety In Microbiology and Biomedical Laboratories”, 1999. Per qualsiasi siero umano o campione di sangue potenzialmente infetto, le soluzioni contenenti siero umano devono essere trattate come potenzialmente infette e maneggiate di conseguenza. 3.Usare punte di pipette separate per ciascun campione, calibratore e reagente per evitare la contaminazione incrociata. 4.Usare serbatoi separati per ciascun reagente. Questo si applica soprattutto al substrato TMB. 5.Dopo l’uso, decontaminare tutti i campioni, i reagenti e i materiali immergendo per almeno 30 minuti in soluzione di ipoclorito di sodio (candeggiante domestico diluito 1:10). 6.Per evitare la formazione di goccioline durante il lavaggio, aspirare la soluzione di lavaggio in una bottiglia contenente candeggiante. 7.Evitare il rilascio nell’ambiente. Smaltire i contenitori e il contenuto inutilizzato in modo sicuro e in conformità con le disposizioni nazionali e locali. 8.I reagenti di questo kit sono conservati con un massimo di 0,05% di azoturo di sodio, 0,038% timerosal, chiamato anche tiomersal o mertiolato, o 0,2% Bronidox L. Questi possono essere tossici se ingeriti. 9.La soluzione di arresto contiene 0,5 mol/L di acido solforico e può causare irritazioni o ustioni alla pelle e agli occhi. In caso di contatto, sciacquare abbondantemente con acqua e consultare immediatamente un medico. 10.Non scambiare i componenti di kit con numeri di lotto diversi. I componenti sono stati standardizzati come unità per un dato lotto. 11.Campioni emolizzati o iperlipemici possono dare risultati errati. 12.Non diluire i campioni di siero o il plasma direttamente nei micropozzetti. 13.Non toccare né raschiare il fondo dei micropozzetti quando si pipetta o si aspira il liquido. 14.Tempi e temperature diversi da quelli specificati possono dare risultati errati. 15.Non lasciare che i pozzetti si asciughino una volta che il test è iniziato. 16.Il substrato TMB è sensibile alla luce. Conservare lontano da fonti di luce. 17.Non riutilizzare i pozzetti né versare di nuovo i reagenti nelle bottiglie una volta versati. STABILITÀ E CONSERVAZIONE 1.Conservare il kit con tutti i reagenti a 2-8°C. Non congelare. 2.Usare tutti i reagenti prima della data di scadenza riportata sull’etichetta delle fiale. 3.La soluzione di lavaggio diluita resta stabile per 4 settimane a 2-8°C. Se non devono essere utilizzati tutti i pozzetti, diluire solo la parte di soluzione di lavaggio concentrata richiesta. 4.Per l’uso successivo, conservare le strisce di pozzetti nella sacca di alluminio con il disseccante in dotazione e sigillare di nuovo. Lasciare sempre che la sacca protettiva si equilibri a temperatura ambiente prima di aprire per evitare la condensazione in/su i micropozzetti rivestiti. RACCOLTA DEI CAMPIONI Maneggiare e smaltire tutti i campioni di sangue, siero e plasma come se fossero potenzialmente infetti. Vedere Precauzioni, sezioni 2, 3, 5, 6 e 7. La determinazione di MBL in un singolo campione richiede 5-50 µL di siero o plasma. I campioni di sangue devono essere raccolti in modo asettico in una provetta semplice o eparinizzata da parte di personale qualificato che usa tecniche di venopuntura approvate. Il siero o il plasma devono essere preparati con tecniche standard per test clinici di laboratorio. Coprire i campioni e conservarli a 2-8°C per testarli entro 24 ore. Se il test non può essere eseguito entro 24 ore o se il campione deve essere spedito, coprire il campione e tenerlo congelato ad una temperatura di almeno −20°C. Evitare congelamento e scongelamento ripetuti. Non usare campioni emolizzati, iperlipemici, trattati a caldo o contaminati. PREPARAZIONE DI REAGENTI E CAMPIONI 1.Portare tutti i campioni e i reagenti a temperatura ambiente (20-25°C). Mescolare a fondo i campioni capovolgendoli delicatamente e, se necessario, eliminare materia particellare visibile con una centrifugazione a bassa velocità. 2.Stabilire il numero di campioni da testare (in duplicato) oltre a qualunque campione di controllo interno del laboratorio (in duplicato) e qualsiasi pozzetto del bianco reagente. I pozzetti pre-rivestiti possono essere utilizzati nel formato strip o singolarmente. I pozzetti singoli possono essere utilizzati spaccandoli individualmente ed inserendoli nell’apposita cornice nella posizione prevista. Lettere e numeri permettono l’identificazione di ogni pozzetto. Aggiungere 16 pozzetti per gli 8 calibratori (in duplicato). Estrarre il numero di micropozzetti necessario e rimettere le rimanenti nel sacchetto di alluminio con il dissecante a 2-8°C. 3.Soluzione di lavaggio: Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 25x versando tutto il contenuto della bottiglia (30 mL) in un cilindro 5 IT MBL Oligomer ELISA Kit MBL Oligomer ELISA Kit graduato da 1 L e aggiungere acqua distillata o deionizzata fino a raggiungere un volume di 750 mL. Mescolare bene e, dopo l’uso conservare a 2-8°C. 4.Diluente per campione: Pronto all’uso, non diluire ulteriormente. 5.Calibratori MBL: Pronti all’uso. Le concentrazioni assegnate sono indicate sulle etichette. Non diluire ulteriormente. 6.Anticorpo biotinilato MBL: Pronto all’uso, non diluire ulteriormente. 7.Streptavidina HRP-coniugata: Pronta all’uso, non diluire ulteriormente. 8.Substrato TMB: Pronto all’uso, non diluire ulteriormente. 9.Soluzione di arresto: Pronta all’uso, non diluire ulteriormente. 10.Campioni paziente: Diluire ciascun campione in una proporzione registrata con diluente per campione fino ad ottenere almeno 250 µL di soluzione diluita che può essere impostata in pozzetti duplicati a 100 µL per pozzetto. Per la maggior parte dei campioni, si consiglia uno screening iniziale ad una diluizione di 1/100 (per es. 5 µL di siero + 495 µL di diluente per campione, mescolati capovolgendo o ruotando lentamente), seguito da un nuovo test di campioni fuori gamma a diluizione più bassa o più alta secondo come è appropriato. Non usare diluizioni inferiori a 1/10. PROCEDURA DEL TEST 1.Preparare il protocollo del test, assegnando i pozzetti appropriati per impostare calibratori, campioni paziente diluiti e qualsiasi controllo interno di laboratorio in duplicato. Se non è disponibile una lunghezza d’onda di riferimento di 650 o 620 nm sul lettore ELISA, può essere assegnato un pozzetto del bianco-reagente Questo viene impostato con 100 µL di diluente per campione invece che siero o plasma diluiti ed elaborati come gli altri pozzetti. 2.Pipettare volumi di 100 μL di ciascun calibratore, campioni diluiti e qualsiasi controllo interno di laboratorio nelle corrispondenti 6 posizioni di micropozzetti. Coprire i pozzetti e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante impostata a 200/ minuto. 3.Aspirare il contenuto dei micropozzetti e lavarli tre volte con almeno 300 μL di soluzione di lavaggio diluita. Se il lavaggio si esegue manualmente, svuotare i micropozzetti capovolgendoli e scuotendoli delicatamente in un contenitore adatto tamponando successivamente in posizione capovolta su un asciugamano di carta. Si consiglia una sosta di 1 minuto prima di svuotare almeno per l’ultimo lavaggio del ciclo. La forza con cui la soluzione di lavaggio entra o esce dai pozzetti influenza lo sviluppo finale del colore. Il pipettaggio manuale, che può essere molto delicato e portare ad un elevato sviluppo di colore, è consigliato solo in assenza di alternative come il riempimento dei pozzetti per immersione, utilizzando un dispenser di lavaggio manuale multicanale o un dispositivo di lavaggio automatico. 4.Versare 100 μL di anticorpo biotinilato MBL (pronto all’uso) in ciascun micropozzetto. Può essere usata una micropipetta multicanale o a ripetizione. Coprire i pozzetti e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante (200/minuto). 5.Lavare come descritto in precedenza, nella fase 3. 6.Versare 100 μL di streptavidina HRP-coniugata (pronta all’uso) in ciascun micropozzetto. Può essere usata una micropipetta multicanale o a ripetizione. Coprire i pozzetti e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante (200/minuto). 7.Lavare come descritto in precedenza, nella fase 3. 8.Versare 100 μL di substrato TMB (pronto all’uso) in ciascun micropozzetto. L’uso di una micropipetta multicanale è consigliato per ridurre il tempo di pipettaggio. Coprire i pozzetti ed incubare per esattamente 15 minuti a temperatura ambiente, al buio. Impostare l’orologio quando si riempie il primo pozzetto. MBL Oligomer ELISA Kit VISTA SCHEMATICA Portare i reagetni a TA Diluire i campioni dei pazienti Calibratori o campione diluito 100 µL IT 9.Aggiungere 100 µL di soluzione di arresto (pronta all’uso) a ciascun pozzetto, mantenendo la stessa sequenza e lo stesso tasso di pipettaggio della fase 7. Mescolare scuotendo delicatamente per 20 secondi, evitando fuoriuscite. Leggere i pozzetti entro 30 minuti. 10.Leggere le densità ottiche (OD) o assorbanze dei pozzetti a 450 nm in un lettore per micropiastra appropriato (lunghezza d’onda di riferimento 650 o 620 nm). Se non è disponibile alcuna lunghezza d’onda di riferimento, il valore di ciascun bianco reagente è sottratto da ciascuno degli altri valori prima di eseguire gli altri calcoli. Incubare 1 h a TA Lavare x 3 100 µL Anticorpo Biotilinato MBL Incubare 1 h a TA Lavare x 3 100 µL Streptavidina HRP-coniugata Incubare 1 h a TA Lavare x 3 100 µL Substrato TMB Incubare 15 min a TA al buio 100 µL Soluzione di Arresto Leggere a 450 nm CALCOLO DEI RISULTATI Il principio di base è quello di costruire una curva di calibrazione punteggiando la media dei valori di densità ottica duplicata per ciascun MBL calibratore sull’asse y rispetto alle corrispondenti concentra- 7 MBL Oligomer ELISA Kit zioni di MBL in ng/mL sull’asse x. La curva di calibrazione deve corrispondere ai requisiti di validazione. La concentrazione di MBL per ciascun campione di siero diluito viene quindi trovata localizzando il punto sulla curva che corrisponde alla media dei valori di densità ottica in duplicato per il campione diluito e leggendo la concentrazione corrispondente in ng/mL sull’asse x. La concentrazione di MBL nel campione di siero non diluito è calcolata moltiplicando questo risultato per il fattore di diluizione del campione. Questa procedura può essere eseguita manualmente usando grafici con scale lineari x e y. Una curva intera può essere disegnata attraverso i punti oppure i punti adiacenti possono essere uniti con linee diritte. La seconda procedura può leggermente sovrastimare i valori di concentrazione tra i punti nel caso in cui la curva è leggermente convessa verso sinistra, cosa che si riscontra comunemente. Sebbene la curva può approssimarsi ad una linea diritta, è praticamente e teoricamente scorretto calcolare e tracciare la linea diritta del miglior adattamento e leggere i risultati da questo. La procedura può anche essere eseguita con un programma software di lettura ELISA che include procedure di adattamento alla curva. La procedura maggiormente scelta è usare assi lineari x e y con adattamento logistico alla curva a 4-parametri. Campioni diluiti che danno un valore di densità ottica medio superiore a quello per il MBL calibratore da 40 ng/mL o al di sotto di quello per il MBL calibratore da 0,5 ng/mL sono fuori dalla gamma del test e le loro concentrazioni devono essere annotate rispettivamente come >40 ng/mL e <0,5 ng/mL. Le concentrazioni corrispondenti nei sieri non diluiti sono calcolate rispettivamente >(fattore di diluizione 40 x) ng/mL e <(fattore di diluizione 0,5 x ) ng/mL. Questi campioni devono essere ritestati a diluizioni maggiori e minori, rispettivamente per campioni ad alta e bassa lettura. I nuovi fattori di diluizione devono essere quelli stimati per dare valori di densità ottica che ricadano entro la gamma della curva di calibrazione ma non devono essere usate diluizioni inferiori a 1/10. 8 VALIDAZIONE DELLA CURVA DI CALIBRAZIONE Il valore medio OD (densità ottica) per 40ng/mL di calibratore MBL dovrebbe essere >1,5. Il valore medio OD per ogni calibratore MBL dovrebbe essere superiore a quello del precedente calibratore MBL, per es. OD(10 ng/mL MBL) > OD(5 ng/mL). La curva standard dovrebbe essere lievemente convessa verso sinistra quando i risultato vengono plottati su un asse lineare. Punti fuori linea per singoli calibratori: Uno o più calibratori singoli possono dare letture anomale dell’OD. Uno o entrambi i valori duplicati possono essere fuori linea e la media dei duplicati può essere fuori linea. Questo errore è significativo se crea problemi ad un adattamento soddisfacente della curva con il metodo logistico a 4 parametri che, come risultato del valore anomalo, viene allontanato dagli altri punti del calibratore che sono in realtà corretti. I punti del calibratore e la curva adattata devono essere esaminati per verificare l’adattamento corretto prima di accettare qualunque calcolo della concentrazione desunto da esso. Una curva che non si adatta in modo soddisfacente sarà rivelata anche da un’alta somma di quadrati residuali. Se è influenzato solo un calibratore, che non è il più alto, sono possibili due azioni: i) Un risultato erroneo singolo o duplicato deve essere eliminato dalla curva e i rimanenti risultati riadattati con la procedura logistica a 4-parametri. Se si ottiene un adattamento soddisfacente, i risultati di concentrazione di previsione possono essere calcolati a partire da esso. ii) Se non si può ottenere un adattamento soddisfacente in questo modo ma la curva è comunque coerente, i risultati di previsione si possono ottenere dalle linee diritte tra le medie dei duplicati, omettendo i punti erronei. Se sono influenzati due o più calibratori, il test deve essere ripetuto. Un risultato deviante per un singolo calibratore può essere dovuto ad un errore dell’operatore o ad un deterioramento del calibratore. Se entrambi i valori duplicati sono coerentemente fuori linea MBL Oligomer ELISA Kit TRACCIABILITÀ DEL VALORE DEL CALIBRATORE L’assegnazione del valore MBL è stata realizzata da ELISA assicurando la tracciabilità rispetto agli standard interni applicati presso lo Statens Serum Institut (Danimarca). INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI L’intera gamma delle concentrazioni di MBL nel siero o nel plasma di donatori umani sani così come misurata da questo test è da 0 a 7000 µg/mL. Valori al di sotto di 100 ng/mL possono essere trovati in genotipi strutturali O/O (dove O = B, C o D) qualunque sia il genotipo promotore, o in genotipi strutturali A/O (dove A = di tipo selvatico) in combinazione con genotipi promotori HY/LX o LX/LY, o nel genotipo promotore LX/LX. Valori tra 100 ng/mL e 1000 ng/ mL possono essere trovati in genotipi strutturali A/O o in genotipi strutturali LX/LY o LX/LX. Valori al di sopra di 1000 ng/mL sono associati con MBL di tipo selvatico (A/A), sebbene eterozigoti A/D possono occasionalmente raggiungere questo livello. Il genotipo promotore HY/HY di solito mostra valori al di sopra di 1500 ng/mL per MBL di tipo selvatico ma tali valori sono anche mostrati da altri genotipi promotori in assenza di alleli strutturali O. Studi clinici hanno usato valori di cut-off di 50 ng/mL o 100 ng/mL per definire una grave deficienza di MBL. Valori al di sotto di questi cut-off possono essere associati, in certi soggetti, con una storia di accresciuta suscettibilità alle infezioni. CONTROLLO DELLA QUALITÀ Laboratori che intendono eseguire test ripetuti devono fissare i propri sieri di controllo ad alta lettura (>1000 ng/mL) e a bassa lettura (<100 ng/ mL) conservati in piccole aliquote (per es. 50 µL) a temperatura di -20°C o inferiori. Un’aliquota di ciascuno deve essere scongelata e testata in ciascun saggio e deve essere conservata una registrazione dei successivi risultati. Ciò serve da controllo della performance e dell'integrità del test e dell'affidabi- lità dell'operatore. Questi risultati devono essere esaminati per verificare lo spostamento (tendenza dei risultati successivi a innalzarsi o a cadere) o una significativa deviazione dalla media dei risultati precedenti. I valori che non deviano di più del 20% dalla media dei valori precedenti possono essere presi ad indicare l’accettabilità del test. Una volta scongelate, le aliquote del siero di controllo non devono essere ricongelate per saggi ripetuti e, se si esegue un altro test, devono essere usate aliquote di controllo fresche e diluizioni fresche di campioni paziente. IT in test successivi, il calibratore è difettoso e deve essere tralasciato. LIMITI Una bassa concentrazione di MBL nel siero o nel plasma non implica necessariamente l’esistenza di una patologia. I medici devono interpretare il significato di qualunque deficienza di MLB alla luce del quadro clinico di ciascun paziente. RISULTATI PREVISTI 108 campioni di plasma di donatori di sangue danesi, sani, furono testati nell’BioPorto Diagnostics MBL oligomer ELISA. I valori di concentrazione di MBL andavano da <2 ng/mL a 4443 ng/mL. Le concentrazioni medie e mediane erano rispettivamente di 1470 ng/mL e 1190 ng/mL, con una deviazione standard (standard deviation, SD) di 1325 ng/mL. 18 campioni (16,7%) diedero letture al di sotto di 100 ng/mL, 30 campioni (27,8%) diedero letture tra 100 ng/mL e 1000 ng/mL, e 60 campioni (55,5%) diedero letture oltre 1000 ng/mL. CARATTERISTICHE DELLA PERFORMANCE Limite di rilevamento: La concentrazione più bassa di MBL che dà una lettura OD superiore a 2 SD al di sopra della lettura media del calibratore zero (n = 8) era di 0,02 ng/mL, che corrisponde ad una concentrazione di siero di 2 ng/mL in un campione diluito 1/100. Riproducibilità intratest (entro un ciclo): Due sieri furono elaborati in 10 repliche per stabilire la riproducibilità entro un ciclo. Furono ottenuti i seguenti risultati (CV = coefficiente di variazione): 9 MBL Oligomer ELISA Kit Siero 1 Siero 2 Conc. MBL media 2279 ng/mL 28,4 ng/mL SD 81,2 1,07 CV 3,6% 3,8% Riproducibilità intertest (fra cicli) (giorni/ operatori diversi): Gli stessi due sieri furono elaborati in duplicato in 4 diversi test eseguiti da 2 operatori in giorni diversi per stabilire la riproducibilità tra cicli. Si ottennero i seguenti risultati: Siero 1 Siero 2 Conc. MBL media 2310 ng/mL 29,7 ng/mL SD 212 1,28 CV 9,2% 4,3% Specificità: Il Western blot di plasma o frazioni di plasma non ha identificato bande che reagiscono con l’anticorpo se non quelle attribuibili a MBL. L’assenza di reazioni incrociate con altri componenti del plasma è supportata dal fatto che letture non distinguibili da zero si ottengono da alcuni donatori con deficienza di MBL ma normali sotto altri profili. RESPONSABILITÀ Per le diagnosi in vitro è consentito l’utilizzo solo all’interno dell’Unione europea, il Canada e l’India. Per motivi di ricerca, è possibile l’utilizzo nel resto del mondo. Non è ancora stata inoltrata una richiesta di approvazione per l’utilizzo diagnostico nel resto del mondo. Questo kit è destinato solo alla determinazione in vitro della lecitina legante mannosio nel siero e nel plasma umano. Il kit è destinato ad essere usato solo da personale qualificato che svolge attività di ricerca o di diagnostica. Se la persona che riceve questo kit, lo passa in qualunque modo a terzi, queste istruzioni devono essere allegate, e il suddetto ricevente deve a 10 proprio rischio rendersi garante nei confronti della BioPorto Diagnostics A/S per tutti i relativi limiti e responsabilità. BioPorto Diagnostics A/S non sarà responsabile per danni o perdite causati dall’uso di questo kit diverso da quello espressamente dichiarato in queste istruzioni. La responsabilità di BioPorto Diagnostics A/S non andrà in alcun modo oltre il valore commerciale del kit. In nessuna circostanza, BioPorto Diagnostics A/S sarà responsabile per danni indiretti, speciali o consequenziali compresa, ma non solo, la perdita di profitti. REVISIONE: MO2007-12-EN-IT MBL Oligomer ELISA Kit BIBLIOGRAFIA IT 1.Turner MW (1998) Mannose-binding lectin (MBL) in health and disease. Immunobiology 199:327-339. 2.Koch A, Melbye M, Sorensen P, Homoe P, Madsen HO, Mølbak K, Hansen CH, Andersen LH, Hahn GW, Garred P (2001) Acute respiratory tract infections and mannose-binding lectin insufficiency during early childhood. JAMA 285:1316-1321. 3.Peterslund NA, Koch C, Jensenius JC, Thiel S (2001) Association between deficiency of mannose-binding lectin and severe infections after chemotherapy. Lancet 358:637-638. 4.Garred P, Voss A, Madsen HO, Junker P (2001) Association of mannose-binding lectin gene variation with disease severity and infections in a population-based cohort of systemic lupus erythematosus patients. Genes Immun 2:442-450. 5.Saevarsdottir S, Vikingsdottir T, Vikingsson A, Manfredsdottir V, Geirsson AJ, Valdimarsson H (2001) Low mannose binding lectin predicts poor prognosis in patients with early rheumatoid arthritis. A prospective study. J Rheumatol 28:728-734. 6.Garred P, Pressler T, Madsen HO, Frederiksen B, Svejgaard A, Hoiby N, Schwartz M, Koch C (1999) Association of mannose-binding lectin gene heterogeneity with severity of lung disease and survival in cystic fibrosis. J Clin Invest 104:431-437. 7.Steffensen R, Thiel S, Varming K, Jersild C, Jensenius JC (2000) Detection of structural gene mutations and promoter polymorphisms in the mannan-binding lectin (MBL) gene by polymerase chain reaction with sequence-specific primers. J Immunol Methods 241:33-42. 11 MBL Oligomer ELISA Kit REF Numero di catalogo Utilizzare entro IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro Fabbricante LOT Codice del lotto Evitare l’esposizione alla luce del sole 8˚C Consultare le istruzioni per l’uso Limiti di temperatura 2˚C Conformità europea 12 Non riutilizzare MBL Oligomer ELISA Kit Attenzione, vedere le istruzioni per l’uso Rischio biologico Non utilizzare se la confezione è danneggiata WASH SOLUTION SAMPLE DILUENT 25X 5X Soluzione di lavaggio concentrata Diluire prima dell’uso. Diluente per campione concentrata. Diluire prima dell’uso. 13 MBL Oligomer ELISA Kit :_W]deij_Yi BioPorto Diagnostics A/S Grusbakken 8 DK-2820 Gentofte Denmark Phone Fax E-mail Web (+45) 4529 0000 (+45) 4529 0001 [email protected] www.bioporto.com
