3 PCR seconda parte

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR
GENE X
5’
3’
3’
5’
1.
2.
3.
4.
5.
Analisi del DNA in medicina legale (es. Test di paternità)
Diagnosi pre-natale di malattie genetiche (es. Anemia
falciforme, Distrofia di Duchenne, talassemia)
Diagnosi di malattie tumorali (es. Linfoma)
6.
Clonaggio e sequenziamento di prodotto PCR
Taq
UPPER primer
LOWER primer
Identificazione di agenti patogeni nell’uomo, negli
animali o negli alimenti (batteri e virus)
Identificazione di organismi geneticamente modificati
(OGM)
1
2
PRINCIPALI TIPI DI PCR a)
•
•
PRINCIPALI TIPI DI PCR b)
RT-PCR: serve a valutare l’espressione di un gene
tramite l’amplificazione dell’mRNA da esso
trascritto
PCR COMPETITIVA: serve a valutare la
concentrazione iniziale di DNA o RNA attraverso
l’amplificazione in contemporanea con un DNA
standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di
reazione. Il campione standard si amplifica con la
stessa coppia di inneschi del DNA di interesse.
•
•
•
3
ADIPOCITA, normale
PRINCIPALI TIPI DI PCR a)
•
•
NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore
specificità del prodotto di amplificazione utilizzando
in successione due coppie di inneschi: la prima più
esterna mentre la seconda più interna rispetto al
segmento di DNA di interesse
MULTIPLEX PCR: consente di amplificare
contemporaneamente diversi segmenti dello stesso
gene di interesse utilizzando coppie di inneschi
differenti (es. Distrofia duchenne)
PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in
tempo reale l’andamento della reazione di PCR
utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le
4
quantità assolute di molecole di partenza
RT-PCR: serve a valutare l’espressione di un gene
tramite l’amplificazione dell’mRNA da esso
trascritto
PCR ASIMMETRICA: serve ad ottenere DNA a
singolo filamento utilizzando uno dei due inneschi in
quantità molto ridotta rispetto all’altro
5
OSTEOCITA, normale
Profili di espressione genica
Nella cellula di un tessuto sono presenti
tutti i geni del genoma, ma solo quelli
caratteristici di un tessuto sono attivi.
Il profilo di espressione genica o
“pattern di espressione” è l’insieme dei
geni attivati in un tessuto.
In figura è riportato un esempio di due
cellule normali appartenenti a tessuti
diversi: sebbene contengano mRNA e
proteine comuni (geni costitutivi),
ciascuna di esse ha mRNA e proteine
peculiari (rappresentate con colori
diversi).
6
1
OSTEOCITA normale
OSTEOCITA tumorale
Profili di espressione genica nei tumori
E’ possibile misurare le differenze tra un
tessuto normale ed uno tumorale dello
stesso tipo, analizzandone l’espressione
genica. Mentre cellule normali di uno
stesso tessuto presentano un identico
profilo di espressione, quando insorge un
tumore tale profilo varia.
Le alterazioni dell’espressione genica
possono
causare
variazioni
nella
produzione delle proteine o nella loro
reciproca interazione.
Proteine fondamentali potrebbero non
essere più disponibili, altre essere prodotte
in eccesso.
Le cellule tumorali derivano quindi da una
combinazione di più variazioni a livello
genico e proteico.
7
TRASCRIZIONE INVERSA (oligo dT)
MISURA DEL LIVELLO DI ESPRESSIONE
(TRASCRIZIONE) DI UN GENE: RT-PCR
Per misurare il livello di mRNA trascritto da un determinato
gene e quindi avere indicazioni sul suo livello di espressione (es.
tessuto, organo, batteri, cellule in coltura, etc.) è necessario:
1) Estrarre l’RNA totale dal campione biologico che si vuole
esaminare
2) Trasformare il pool di RNA (che conterrà anche l’mRNA
trascritto dal gene di interesse) in cDNA tramite la reazione di
trascrizione inversa
3) Evidenziare il cDNA di interesse tramite la reazione di PCR
utilizzando una coppia di primers specifici.
8
RT-PCR=REVERSE TRANSCRIPTASE PCR
Esameri RANDOM
1.
La reazione di TRASCRIZIONE INVERSA consente di produrre una molecola di cDNA
(DNA complementare) a partire da mRNA (RNA messaggero).
2.
L’enzima che catalizza questa reazione è la trascrittasi inversa, una DNA polimerasi RNAdipendente.
3.
Questo enzima è stato inizialmente identificato nei retrovirus (ad esempio il virus HIV).
4.
Le due trascrittasi inverse più utilizzate in laboratorio sono la AMV (isolata dall’Avian
Myeloblastosis Virus) e la MoMLV (isolata dal Moloney Murine Leukemia Virus).
5.
Il pool di cDNA ottenuto dalla reazione di trascrizione inversa è utilizzato per misurare
9 il
livello di espressione di un gene mediante la tecnica PCR
•
La RT-PCR amplifica un RNA
convertendolo prima in cDNA (o
DNA complementare all’RNA)
tramite l’enzima trascrittasi
inversa, e poi amplificandolo
tramite PCR con inneschi
specifici per la sequenza di
interesse.
•
La RT-PCR viene utilizzata, ad
esempio, per valutare il livello di
espressione
di
un
gene
misurando la quantità di mRNA
da esso trascritto.
•
La trascrittasi inversa viene
utilizzata dai retrovirus (o virus
ad RNA, es HIV).
10
PRINCIPALI TIPI DI PCR a)
ANALISI SU GEL DI AGAROSIO DI
PRODOTTI DI RT-PCR
•
•
β-actina
500 bp
AT1
306 bp
11
RT-PCR: serve a valutare l’espressione di un gene
tramite l’amplificazione dell’mRNA da esso
trascritto
PCR COMPETITIVA: serve a valutare la
concentrazione iniziale di DNA o RNA attraverso
l’amplificazione in contemporanea con un DNA
standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di
reazione. Il campione standard si amplifica con la
stessa coppia di inneschi del DNA di interesse.
12
2
PCR COMPETITIVA
PCR COMPETITIVA
La sequenza in esame (es. genoma virale) viene amplificata
insieme ad una sequenza nucleotidica che funge da controllo
interno (standard) e che possiede un’elevata omologia con
la sequenza del DNA virale. Nella reazione di coamplificazione si avrà competizione tra la sequenza
bersaglio ed il controllo interno: utilizzando concentrazioni
scalari note del controllo interno sarà possibile risalire alla
quantità di acido nucleico (virus) presente nel campione.
Controllo interno
bersaglio INCOGNITO
13
14
1088107710661055104410331022
1088107710661055104410331022
15
PRINCIPALI TIPI DI PCR b)
•
•
•
NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore
specificità del prodotto di amplificazione utilizzando
in successione due coppie di inneschi: la prima più
esterna mentre la seconda più interna rispetto al
segmento di DNA di interesse
MULTIPLEX PCR: consente di amplificare
contemporaneamente diversi segmenti dello stesso
gene di interesse utilizzando coppie di inneschi
differenti (es. Distrofia duchenne)
PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in
tempo reale l’andamento della reazione di PCR
utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le
17
quantità assolute di molecole di partenza
16
NESTED PCR
1a PCR
Amplificato 1
100 bp
2a PCR
Amplificato 2
65 bp
Il vantaggio di questa reazione e’ di aumentare la specificita’ e la
sensibilita’ dell’ amplificazione.
18
3
MULTIPLEX PCR
PRINCIPALI TIPI DI PCR b)
•
•
•
NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore
specificità del prodotto di amplificazione utilizzando
in successione due coppie di inneschi: la prima più
esterna mentre la seconda più interna rispetto al
segmento di DNA di interesse
MULTIPLEX PCR: consente di amplificare
contemporaneamente diversi segmenti dello stesso
gene di interesse utilizzando coppie di inneschi
differenti (es. Distrofia duchenne)
PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in
tempo reale l’andamento della reazione di PCR
utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le
19
quantità assolute di molecole di partenza
DNA
3’
5’
5’
3’
20
PRINCIPALI TIPI DI PCR b)
•
•
•
NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore
specificità del prodotto di amplificazione utilizzando
in successione due coppie di inneschi: la prima più
esterna mentre la seconda più interna rispetto al
segmento di DNA di interesse
MULTIPLEX PCR: consente di amplificare
contemporaneamente diversi segmenti dello stesso
gene di interesse utilizzando coppie di inneschi
differenti (es. Distrofia duchenne)
PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in
tempo reale l’andamento della reazione di PCR
utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le
21
quantità assolute di molecole di partenza
Real Time PCR
Tecnica che consente di monitorare in tempo
reale l’andamento di una reazione di
amplificazione
Tecnica basata sulla fluorescenza:l’emissione
di fluorescenza è direttamente correlata
alla quantità di DNA amplificato.
22
Curva di amplificazione
detector
350,000
pixels
filters
excitation
filters
PIASTRA
CAMPIONI
Theoretical
Quantità di DNA
intensifier
halogen
tungsten
lamp
Real Life
Numero
di cicli
23
www.biorad.com
24
4
PCR: Curve di
amplificazione
Exponential
phase
Plateau phase
25
26
Cos’è il ciclo soglia Ct ?
Cos’è il ciclo soglia Ct ?
Rappresenta il ciclo di ciascuna reazione di amplificazione
in corrispondenza del quale la fluorescenza del campione
supera un valore soglia
2

Strettamente correlato con la quantità iniziale di DNA stampo
Qual è il
Threshold
Baseline
Sample
1,6
primo?
Qual è
l’ultimo?
1,2
0,8
CT
0,4
0
0
10
20
21
30
40
27
Come quantizzare un campione
di DNA
28
Standard curve
29
30
5
Agenti intercalanti
Real Time PCR
EtBr (bromuro di etidio)
SYBR Green, agente intercalante dotato di
una maggiore sensibilità
(200 volte più sensibile)
CHIMICA utilizzata
31
32
Agenti intercalanti
Agenti intercalanti
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
5’
3’
3’
ID
Intercalation Dyes
Thermal Stable
DNA Polymerase
5’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
ID
5’
3’
3’
5’
3’
3’
ID
3’
5’
ID
5’
5’
5’
Denaturazione
3’
λ
ID
Taq 5’
ID
5’
ID
λ
Estensione
5’
ID
ID
ID
Taq
3’
5’
ID
λ
3’
λ
Taq
ID
Taq
λ
5’
Taq
5’
5’
d.NTPs
Primers
3’
3’
5’
3’
3’
λ
5’
33
Annealing
34
TaqMan® Probes
Donor dye
(Reporter)
5’
5’
intensifier
halogen
tungsten
lamp
detector
350,000
pixels
Acceptor dye
(Quencher)
3’
Sonda (probe) libera in
soluzione
Light
filters
Energy transfer
Taq
excitation
filters
Probe and primers legano il bersaglio
Light
Light Emission
PIASTRA
CAMPIONI
Taq
35
www.biorad.com
36
6
TaqMan® Probes
Donor dye
(Reporter)
Acceptor dye
(Quencher)
5’
5’
3’
Sonda (probe) libera in
soluzione
Light
Energy transfer
Taq
Probe and primers legano il bersaglio
Light
Light Emission
Taq
37
38
TaqManTM probe
TaqManTM
3’
5’
R
PRIMA DEL TAGLIO
5’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
3’
Q
3’
5’
3’
Primers
5’
5’
Thermal Stable
DNA Polymerase
3’
3’
5’
d.NTPs
3’
R
5’
3’
5’
5’
Probe
Q
3’
Reaction Tube
3’
5’
3’
5’
Taq
R
DOPO IL TAGLIO
3’
3’
3’
5’
5’
Q
λ
5’
39
Denaturation
3’
5’
R
5’
Annealing
Q
3’
40
TaqManTM
Q
R
3’
5’
5’
3’
5’
3’
Extension Step
R
R
Q
Taq
3’
1. Strand Displacement
5’
5’
3’
R
Q
3’
Taq
2. Cleavage
5’
5’
3’
R
Taq
Q
3’
3. Polymerization
Complete
5’
5’
3’
λ
R
Taq
Q
3’
5’
5’
3’
4. Detection
41
42
7