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Doc.: INS AVM.CE/it
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Date: 02/2003
HAV IgM
Test immunoenzimatico (ELISA)
a “cattura” per la determinazione
dell’anticorpo di classe IgM anti
Virus dell’Epatite A
in siero o plasma umano
- solo per uso diagnostico “n vitro” -
DIA.PRO
Diagnostic Bioprobes Srl
Via Columella n° 31
20128 Milano - Italy
Phone +39 02 27007161
Fax +39 02 26007726
e-mail: [email protected]
REF AVM.CE
96 tests
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HAV IgM
A. SCOPO DEL SAGGIO
Il prodotto denominato HAV IgM è un kit immunoenzimatico
(ELISA) per la determinazione degli anticorpi di classe IgM anti
Virus dell’Epatite A in siero o plasma umano, con metodica a
cattura.
Il kit è inteso per l’identificazione dell’agente virale infettante,
causa di epatite nel paziente, ed il follow-up dell’infezione
acuta.
Solo per uso diagnostico “in vitro”.
B. INTRODUZIONE
Il “Center for Disease Control or CDC”, Atlanta, USA, definisce
il Virus dell’Epatite A come segue:
L’Epatite A continua ad essere una delle malattie più
frequenti nel mondo nonostante l’esistenza di un vaccino sin
dal 1995. L’utilizzo di un protocollo di vaccinazione applicato
su larga scala sulla popolazione appropriata farebbe
sostanzialmente diminuire l’incidenza della malattia e
potenzialmente eliminare la trasmissione del Virus
dell’Epatite A.
L’agente eziologico, virus di 27-nm ad RNA classificato come
Picornavirus può generare sia un’infezione asintomatica che
sintomatica negli uomini, dopo un periodo medio di 28 giorni
di incubazione (da 15 a 50 giorni). La malattia causata da
infezione da HAV mostra una tipica manifestazione
sintomatologica che include febbre, malessere, anoressia,
nausea, disturbi intestinali, urine scure, e ittero. La
probabilità di avere sintomi da infezione HAV è correlata
con l’età della persona.
Nei bambini di meno di 6 anni, la maggioranza delle
infezioni (70%) è asintomatica. Se la malattia sussiste non è
usualmente accompagnata da ittero.
Tra i bambini di età superiore e gli adulti, l’infezione è
normalmente asintomatica con ittero presente in più del
70% dei pazienti. Segni e sintomi normalmente durano meno
di 2 mesi, sebbene il 10-15% delle persone con
sintomatologia mostrino una malattia più lunga, o
ricorrente, fino a 6 mesi.
Nelle persone infette, l’HAV si replica nel fegato, viene
escreto nella bile ed eliminato con le feci. Il picco di
infettività di tali persone è presente durante le due
settimane che precedono l’ittero o l’aumento dei livelli degli
enzimi epatici, quando la concentrazione del virus nelle feci
è maggiore.
La concentrazione del virus nelle feci declina dopo l’ittero.
Bambini e neonati possono eliminare l’HAV per un periodo
più lungo che non gli adulti, fino a diversi mesi dopo la
manifestazione della malattia.
L’eliminazione cronica dell’HAV nelle feci non è fenomeno
normale; tuttavia tale eliminazione può avvenire in persone
che mostrano eventi ricorrenti di malattia. La viremia viene
osservata immediatamente dopo l’infezione e persiste
durante il periodo in cui si presentano alti valori di enzimi
epatici.
L’Epatite A non può essere differenziata da altri tipi di
epatite virale unicamente sulla base delle caratteristiche
cliniche o epidemiologiche. Sono necessari i test serologici
che determinano gli anticorpi IgM verso le proteine
capsidiche dell’HAV (anti HAV IgM) per confermare una
diagnosi di infezione acuta da HAV. In molti pazienti, le IgM
anti HAV diventano determinabili 5-10 giorni prima della
manifestazione dei sintomi e possono persistere fino a 6
mesi dopo l’infezione. Anticorpi IgG anti HAV, che appaiono
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presto nel decorso della malattia, rimangono presenti per
tutta la vita dell’individuo e conferiscono una protezione
duratura contro la malattia.
Sono disponibili in commercio tests per la determinazione di
IgM e anticorpi totali (IgM e IgG) anti HAV in siero e
plasma.
L’HAV RNA può essere determinate nel sangue e nelle feci
della maggioranza delle persone durante la fase acuta
dell’infezione con l’utilizzo di tecniche di amplificazione degli
acidi nucleici e il loro sequenziamento è stato utilizzato per
verificare la correlazione tra diversi isolati.
L’infezione da HAV è acquisita sostanzialmente per via orofecale per contatto tra persone o ingestione di cibi
contaminati o acqua infetta.
In rare occasioni l’infezione da HAV è stata trasmessa da
trasfusione di sangue o da emoderivati raccolti da donatori
durante la fase di viremia dell’infezione.
Nei primati infettati sperimentalmente, l’HAV è stata
trovato nella saliva durante il periodo di incubazione;
tuttavia la trasmissione per tale via non è stata dimostrata.
A seconda delle condizioni, l’HAV può essere stabile
nell’ambiente per mesi.
La cottura dei cibi ad una temperatura superiore ad 85°C
per 1 minuto o la disinfezione delle superfici con candeggina
1:100 in acqua sono due metodi che permettono
l’inattivazione del virus.
Poiché la maggioranza dei bambini ha una infezione
asintomatica o non riconoscibile, questi giocano un ruolo
importante nella trasmissione dell’HAV e servono come
bacino d’infezione per gli altri.
In uno studio condotto su adulti senza origine d’infezione
identificata, il 52% di loro aveva un bambino di età inferiore
a 6 anni in casa; la presenza di tale persona è stata associata
alla trasmissione dell’HAV tra i conviventi.
In studi dove test serologici erano stati effettuati sulla
stessa tipologia di persone, il 25-40% dei contatti avevano
parentela con bambini inferiori a 6 anni con evidenza di
infezione da HAV (IgM anti HAV).
C. PRINCIPLE OF THE TEST
Il dosaggio è basato sul principio a “cattura IgM” dove le IgM
del campione sono catturate prima in fase solida da un
anticorpo adeso anti hIgM.
Dopo aver eliminato tramite lavaggio tutti gli altri componenti
del campione ed in particolare gli anticorpi IgG, gli anticorpi IgM
specifici presenti in fase solida sono messi in evidenza
dall’aggiunta di una preparazione di HAV, purificata, inattivata e
marcata con un anticorpo coniugato con perossidasi (HRP).
Dopo incubazione, la micropiastra viene lavata per rimuovere il
coniugato non legatosi e quindi viene aggiunto il
Cromogeno/Substrato.
In presenza di perossidasi tale reagente incolore viene
idrolizzato ad un prodotto di reazione colorato, la cui densità
ottica può essere misurata e risulta proporzionale alla quantità
di anticorpo IgM anti HAV presente nel campione.
D. COMPONENTI
Il kit contiene reagenti per 96 determinazioni.
1. Micropiastra MICROPLATE
12 strips da 8 pozzetti removibili attivati con anticorpo anti
hIgM, purificato per affinità, sigillata in un contenitore a
chiusura ermetica, in presenza di essiccante.
Portare la micropiastra a temp.amb. prima dell’apertura del
contenitore. Riporre le strips inutilizzate nell’apposito
contenitore e sigillare in presenza di essiccante, riponendo a
2..8°C.
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2. Controllo Negativo: CONTROL 1x2.0ml/flacone. Pronto uso, contiene proteine seriche di
capra, 10 mM tampone Tris-HCl pH 6.0+/-0.1, 0.1% Tween 20,
0.09% sodio azide e 0.1% Kathon GC come conservante.
Il controllo negativo è incolore.
3. Controllo Positivo: CONTROL +
1x2.0ml/flacone. Pronto uso, contiene proteine seriche di
capra, anticorpo IgM anti HAV, 10 mM tampone Tris-HCl pH
6.0+/-0.1, 0.1% Tween 20, 0.09% sodio azide e 0.1% Kathon
GC come conservanti.
Il controllo positivo ha codice colore verde.
4. Calibratore: CAL ….
n° 1 flacone liofilo. Da dissolvere con il volume di acqua grado
EIA riportato in etichetta.Contiene 2% BSA, anticorpo IgM anti
HAV, 10 mM tampone Tris-HCl pH 6.0+/-0.1, 0.09% sodio
azide e 0.1% Kathon GC come conservanti.
Nota: Il volume necessario per dissolvere il contenuto del
flacone può variare da lotto a lotto. Utilizzare il volume
esatto riportato in etichetta.
5. Soluzione Lavaggio conc.: WASHBUF 20X
1x60ml/flacone. Soluzione concentrata 20x da diluire fino ad un
volume totale di 1200 ml con acqua grado EIA prima dell’uso.
Una volta diluita la soluzione contiene 10 mM tampone fosfato
sodico pH 7.0+/-0.2, 0.05% Tween 20 e 0.05% Kathon GC.
6. Coniugato Enzimatico 20X: CONJ 20X
1x0.8 ml/flacone. Soluzione 20X concentrata. Contiene
anticorpo specifico anti-HAV coniugato con HRP in presenza di
10 mM tampone Tris-HCl pH 6.8+/-0.1, 2% BSA, 0.1% Kathon
GC e 0.02% gentamicina solfato come conservanti.
7. Antigene HAV: Ag HAV
1x16 ml/flacone. Soluzione pronto uso. Contiene antigene HAV
inattivato e stabilizzato in presenza di 10 mM tampone Tris-HCl
pH 6.8+/-0.1, 2% BSA, 0.1% Kathon GC e 0.02% gentamicina
solfato come conservanti.
Il reagente ha codice colore rosso.
8. Diluente Campione: DILSPE
2x60.0 ml/flacone. Tampone proteico per la diluizione del
campione. Contiene proteine seriche di capra, 10 mM tampone
Tris-HCl pH 6.0+/-0.1, 0.1% Tween 20, 0.09% sodio azide e
0.1% Kathon GC come conservanti.
Il reagente ha codice colore blue.
9. Cromogeno/Substrato: SUBS TMB
1x16ml/flacone. Contiene 50 mM tampone citrato-fosfato
solido pH 3.5-3.8, 0.03% tetra-metil-benzidina (o TMB) e 0.02%
perossido d’idrogeno (o H2O2).
Nota: Conservare al riparo dalla luce in quanto
fotosensibile .
10. Acido Solforico: H2SO4 O.3 M
1x15ml/flacone. Contiene una soluzione 0.3 M H2SO4.
Attenzione: Irritante (Xi R36/38; S2/26/30)
11. Adesivo plastico per piastra n° 2
12. Istruzioni per l’uso n° 1
E. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
1. Micropipette calibrate nel range 10-1000 ul e puntali
monouso di plastica.
2. Acqua grado EIA (bi-distillata o de-ionizzata, trattata con
carbone attivo per rimuovere agenti chimici ossidanti usati
quali disinfettanti).
Date: 02/2003
3. Timer da 60 min o superiore.
4. Carta assorbente.
5. Incubatore termostatico per micropiastre ELISA calibrato
ed impostato a +37°C.
6. Lettore per micropiastre ELISA calibrato ed in possesso di
filtri da 450nm (lettura) e possibilmente da 620-630 nm
(azzeramento).
7. Lavatore per micropiastre ELISA calibrato.
8. Vortex o strumentazione di miscelatura simile..
F. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1. Il kit deve essere utilizzato solo da personale tecnico
esperto e propriamente istruito, sotto la supervisione del
responsabile del laboratorio.
2. Tutto il personale coinvolto nell’esecuzione del dosaggio
deve indossare indumenti protettivi di laboratorio, guanti in
gomma senza talco ed occhiali. Evitare ogni uso di materiale
appuntito (aghi) e tagliente (lamette). Tutto il personale
dovrebbe essere istruito in procedure di bio-sicurezza, come
raccomandato dal Center for Disease Control, Atlanta, U.S., e
riportato nella pubblicazione del National Institute of Health’s:
“Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, ed.
1984. Riferirsi inoltre alla legislazione vigente in Italia.
3. Tutto il personale coinvolto nella manipolazione dei
campioni di origine umana dovrebbe essere vaccinato per HBV
e HAV, agenti per i quali esiste un vaccino sicuro ed efficace.
4. L’ambiente del laboratorio dovrebbe essere sotto controllo
per evitare ogni contaminazione da polvere o da agenti
microbici trasportati dall’aria, quando flaconi e micropiastra
vengono aperti e quando il dosaggio viene eseguito.
Proteggere il Cromogeno/Substrato da forte illuminazione ed
evitare ogni vibrazione del banco di lavoro quando il test viene
eseguito.
5. A ricevimento, conservare il kit in un frigorifero o in una
camera fredda a temperatura controllata di 2..8°C.
6. Non utilizzare componenti provenienti da lotti diversi. Si
raccomanda anche di non utilizzare componenti di due kits
diversi della stessa tipologia anche se dello stesso lotto.
7. Controllare che i reagenti siano limpidi e che non
contengano particelle o aggregati visibili. In caso contrario,
avvisare il supervisore del laboratorio per iniziare le procedure
necessarie alla risoluzione del problema.
8. Evitare
contaminazioni
crociate
tra
campioni
(siero/plasma) utilizzando puntali monouso, scartati dopo ogni
singolo utilizzo.
9. Evitare contaminazioni crociate tra i componenti del kit
con l’utilizzo di puntali monouso, scartati dopo ogni singolo
utilizzo.
10. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza riportata sulle
etichette
esterne
(contenitore
primario)
ed
interne
(flaconi/micropiastra).
11. Manipolare i campioni di origine umana come
potenzialmente infettivi. Questi dovrebbero essere manipolati a
livello 2 di Bio-Sicurezza, come raccomandato dal Center for
Disease Control, Atlanta, U.S., in accordo con quanto citato
nella pubblicazione del Institutes of Health: “Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories”, ed. 1984. Fare
comunque riferimento alla normativa di legge nazionale in
merito alla manipolazione dei campioni biologici.
12. Si raccomanda l’uso di materiali di laboratorio in plastica
nella preparazione della soluzione di lavaggio o nel
trasferimento dei componenti nei contenitori di stazioni ELISA
automatiche, in modo da evitare contaminazioni.
13. Gli scarti prodotti durante l’uso del kit devono essere
smaltiti in accordo con le vigenti normative nazionali a
proposito dello smaltimento di sostanze chimiche e biologiche.
In particolare i rifiuti generati dalle procedure di lavaggio, dai
residui dei controlli e dei campioni devono essere trattati come
materiali potenzialmente infettivi e quindi inattivati.
Si
suggeriscono quali processi di inattivazione il trattamento con
una soluzione al 10% di conegrina domestica per 16-18 ore o
l’inattivazione al calore per autoclave a 121°C per 20 min.
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14. Eventuali schizzi accidentali devono essere prima
assorbiti con carta bibula imbevuta di conegrina domestica. La
carta utilizzata deve quindi essere smaltita negli appositi
contenitori per rifiuti ospedalieri.
15. L’acido solforico è classificato come irritante. In caso di
schizzi lavare la superficie con acqua abbondante.
16. Gli altri materiali di scarto generati dall’uso del prodotto (
esempio: puntali, micropiastre, etc.) dovrebbero essere
maneggiati come potenzialmente infettivi e smaltiti secondo la
legge in vigore a tal proposito al momento nel paese.
G. CAMPIONE: PREPARAZIONE E RACCOMANDAZIONI
1. Prelevare il sangue in modo asettico per puntura venosa e
preparare il plasma o il siero con le procedure standard di
preparazione del campione per analisi cliniche di
laboratorio. Non si sono osservati effetti sul saggio dovuti a
preparazioni ottenute con citrato, EDTA o simili ed eparina.
2. Evitare ogni aggiunta di conservanti, in particolare sodio
azide in quanto questo reagente chimico è in grado di
inattivare l’attività enzimatica del coniugato, generando
risultati falsamente negativi.
3. I campioni devono essere chiaramente identificati con
codice o nome in modo da evitare ogni errore di
interpretazione del risultato.
4. Scartare i campioni visibilmente emolizzati (rossi) e/o
iperlipemici (lattescenti) in quanto questi possono dare
origine a falsi risultati. Scartare inoltre quei campioni con
evidenti residui di fibrina o grossi particolati o filamenti e
corpi di origine microbica in quanto anche questi possono
generare falsi risultati.
5. I campioni (sieri e plasmi) possono essere conservati a
2..8°C fino a 5 giorni dalla loro preparazione. Per una loro
conservazione più prolungata, i campioni possono essere
congelati a –20°C per parecchi mesi. Ogni campione non
dovrebbe essere congelato per più di una volta in quanto
questo procedimento può generare particolati che
potrebbero dare problemi nel saggio.
6. Se sono presenti particelle in sospensione, centrifugare il
campione a 2.000 rpm per 20 min a temp.amb. o filtrare su
filtro da 0.2-0.8 u per chiarificarlo prima del test.
H. PREPARAZIONE DEI COMPONENTI ED AVVERTENZE
Uno studio condotto su di un kit aperto non ha messo in
evidenza perdite di reattività rilevanti fino a tre mesi dalla prima
apertura.
1. Micropiastra:
Portare la micropiastra a temperatura ambiente (circa 1 hr)
prima di aprire il contenitore. Controllare che il colore
dell’essiccante non sia virato al verde, indicando così un difetto
di fabbricazione. In tale caso contattare il Servizio Clienti della
Dia.Pro srl.. Le strips non utilizzate devono essere quindi
riposte nell’apposito sacchetto di alluminio, e questo chiuso
ermeticamente e riposto a 2..8°C. Dopo la prima apertura, le
strips sono stabili fino a che l’indicatore di umidità presente
nell’essiccante non viri al verde.
2. Controllo Negativo:
Pronto uso. Miscelare con cura su vortex prima dell’uso.
3. Controllo Positivo:
Pronto uso. Miscelare con cura su vortex prima dell’uso.
4. Calibratore:
Aggiungere al liofilo il volume di acqua grado EIA riportato
sull’etichetta; lasciare dissolvere completamente e quindi
agitare vu vortex con cautela.
Nota: Il Calibratore quando dissolto non è stabile. Conservare
in aliquote a –20°C.
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5. Soluzione di Lavaggio concentrata:
L’intero contenuto della soluzione 20X concentrata deve essere
portato a 1200 ml totali con acqua grado EIA e miscelata con
cura per capovolgimento prima dell’uso.
Una volta diluita, la soluzione di lavaggio è stabile per 1
settimana a 2..8°C. Durante la preparazione evitare con cura la
formazione di schiuma in quanto la presenza di bolle d’aria
potrebbe creare problemi di efficienza durante il ciclo di
lavaggio.
6. Coniugato Enzimatico:
Preparazione concentrata 20X. Miscelare su vortex.
Evitare ogni contaminazione del liquido con agenti ossidanti ,
polvere o microbi quando il reagente viene aspirato per l’uso.
7. Antigene HAV:
Pronto uso. Miscelare con cura su vortex prima dell’uso.
Maneggiare questo componente come potenzialmente infettivo
anche se l’HAV è stato inattivato chimicamente.
6+7. Complesso Antigene HAV/Anticorpo:
Circa 5-10 min prima dell’uso, diluire il Coniugato Enzimatico
20X concentrato nel volume di Antigene HAV necessario al
dosaggio. Quindi miscelare con cura su vortex.
Esempio: per esaminare 2 strips diluire 100 ul di Coniugato
Enzimatico 20X concentrato in 2 ml di Antigene HAV.
Nota: L’immunocomplesso così formato non è stabile;
eliminare l’eccesso non utilizzato.
8. Diluente Campione:
Pronto uso. Miscelare con cura su vortex prima dell’uso.
9. Cromogeno/Substrato:
Pronto uso. Miscelare con cura su vortex prima dell’uso.
Evitare ogni contaminazione del liquido con agenti chimici
ossidanti, polvere e microbi trasportati dall’aria. Non esporre a
forte illuminazione, agenti ossidanti e superfici metalliche.
Se questo componente dovesse essere trasferito utilizzare
unicamente contenitori monouso di plastica, possibilmente
sterili.
10. Acido Solforico:
Pronto uso. Miscelare su vortex prima dell’uso.
Attenzione: Irritante (Xi R36/38; S2/26/30).
Legenda: R 36/38 = Irritante per occhi e pelle.
S 2/26/30 = In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente con eccesso d’acqua e richiedere intervento
medico.
I. MATERIALI E STRUMENTI DA USARE IN
COMBINAZIONE CON IL KIT
1. Le micropipette devono essere calibrate per dispensare il
volume corretto richiesto dal saggio e quelle parti che
possano accidentalmente venire in contatto con il
campione devono essere sottoposte a regolare
decontaminazione (alcool domestico, soluzione 10%
conegrina, disinfettanti ospedalieri). Eseguire anche
regolarmente operazioni di decontaminazione di spruzzi e
residui dei componenti del kit. Le micropipette dovrebbero
essere anche sottoposte a regolare manutenzione in modo
da garantire una precisione dell’ 1% ed un’esattezza del
2%.
2. L’incubatore ELISA deve essere impostato ad una
temperatura di +37°C (tolleranza +/-0.5°C) e regolarmente
controllato per assicurare che tale temperatura sia
mantenuta. Sono adatti per l’incubazione sia incubatori ad
aria che ad acqua, ammesso che tali strumenti siano
comunque convalidati per i tests ELISA.
3. Il lavatore ELISA è estremamente importante per le
caratteristiche del saggio. Tale strumento deve essere
preventivamente
convalidato
con
attenzione
e
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correttamente ottimizzato utilizzando i controlli/calibratori
del kit e pannelli di riferimento, prima del suo utilizzo di
routine con il prodotto. Normalmente sono sufficienti 4-5
cicli di lavaggio (aspirazione + dispensazione di 300ul/well
di soluzione di lavaggio = 1 ciclo) per garantire le migliori
prestazioni del kit, come da atteso. Si suggerisce un tempo
di “soaking” di 20-30 secondi tra ciclo e ciclo. Per definire
correttamente tali parametri, si raccomanda di eseguire un
saggio con i controlli/calibratori del kit e campioni negativi e
positivi ben caratterizzati. Verificare quindi di ottenere i
valori di controllo qualità interno riportati nell’apposita
sezione O e i parametri definiti nella sezione
“Caratteristiche del Test”. Condurre regolari operazioni di
calibrazione del volume dispensato e di manutenzione (
decontaminazione e pulizia degli aghi), secondo quanto
descritto a tale proposito nelle istruzioni d’uso fornite dal
produttore dello strumento.
4. I tempi di incubazione hanno una tolleranza di +5%.
5. Il lettore ELISA deve essere fornito di filtro di lettura da
450nm e possibilmente da un secondo filtro (620-630nm)
per le operazioni di azzeramento. Il sistema ottico del
lettore deve essere calibrato regolarmente per assicurare
che sia misurata la corretta densità ottica. Il lettore
dovrebbe essere sottoposto a regolare manutenzione
come riportato nel manuale d’istruzioni del produttore dello
strumento.
6. Quando viene utilizzata una stazione automatica ELISA di
processamento, assicurarsi che tutte le operazioni critiche
(dispensazione, incubazione, lavaggio, lettura, trattamento
dati, etc.) siano correttamente impostati, calibrati, controllati
e regolarmente sottoposti a manutenzione in modo da
ottenere i valori di controllo qualità interno riportati nella
sezione specifica e le caratteristiche specifiche del kit. Il
metodo di esecuzione del saggio deve essere inserito nel
sistema operativo dello strumento e valicato come riportato
per lavatore e lettore. Inoltre, anche il sistema idrodinamico
dello strumento (dispensazione e lavaggio) deve essere
convalidato e correttamente impostato.
Particolare
attenzione si deve porre nell’evitare fenomeni di “carry
over” dovuti agli aghi di dispensazione e di lavaggio.
Questo fenomeno deve essere studiato con attenzione per
minimizzare il rischio di contaminazione di pozzetti
adiacenti.
L’utilizzo
di
stazioni
automatiche
è
raccomandabile quando il numero dei campioni da
esaminare superi le 20-30 unità per seduta analitica.
7. Il Servizio Clienti della Dia.Pro srl offre un servizio di
supporto all’utilizzatore nell’impostazione e nel controllo
degli strumenti utilizzati in combinazione con il kit in modo
da garantire il raggiungimento delle caratteristiche descritte
sopra. Viene fornito anche un supporto tecnico per
l’installazione di nuovi strumenti da utilizzarsi in
combinazione con il prodotto fornito.
L. CONTROLLI ED OPERAZIONI DI PRE-SAGGIO
1. Controllare la data di scadenza del kit, stampata
sull’etichetta esterna della confezione e sui contenitori
primari. Non utilizzare il prodotto se scaduto.
2. Verificare che i componenti liquidi del kit non siano
contaminati da particelle visibili ad occhio nudo o da
aggregati. Controllare che il Cromogeno/Substrato
(TMB/H2O2) sia incolore o leggermente azzurrino
aspirando un piccolo volume in una pipetta sterile di
plastica trasparente. Controllare che nessuna rottura si sia
verificata durante il trasporto e nessuna perdita di liquido
sia presente all’interno della scatola. Infine verificare che il
sacchetto porta micropiastra non sia bucato o danneggiato.
3. Diluire come descritto sopra il contenuto della Soluzione di
Lavaggio 20X concentrata.
4. Dissolvere il Calibratore come descritto sopra e miscelare
con delicatezza.
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5. Portare tutti gli altri componenti del kit a temperatura
esterna (circa 1 hr) e quindi miscelare con delicatezza tutti i
componenti liquidi.
6. Impostare l’incubatore ELISA a +37°C e preparare il
lavatore ELISA effettuando un’operazione di “priming” con
la soluzione di lavaggio diluita, come da istruzioni del
produttore dello strumento. Impostare il corretto numero di
cicli di lavaggio, come identificato nello studio di convalida
dello strumento nel suo utilizzo in combinazione con il
prodotto.
7. Verificare che il lettore ELISA sia acceso ed assicurarsi che
lo sia almeno 20 minuti prima della lettura.
8. In caso di utilizzo di una stazione ELISA automatica,
accendere lo strumento, verificare le impostazioni ed
assicurarsi che sia utilizzato il protocollo di saggio
specifico.
9. Controllare che le micropipette siano impostate sul volume
richiesto dalla procedura.
10. Verificare che tutti gli altri strumenti siano disponibili e
pronti all’uso.
11. Se qualche problema dovesse sussistere, non procedere
oltre con il test ed avvisare il responsabile.
M. PROCEDURA DI DOSAGGIO
Il test deve essere condotto in accordo con quanto descritto in
seguito, ponendo cura a mantenere lo stesso tempo di
incubazione per tutti I campioni in dosaggio.
1.
Diluire I campioni 1:101 dispensando in un tubo di
diluizione prima 10 µl di campione e successivamente 1
ml di Diluente Campione; miscelare con cura su vortex.
2.
Posizionare sull’apposita cornice il numero di pozzetti
necessari al dosaggio. Lasciare vuoto il pozzetto A1 per le
operazioni di azzeramento.
3.
Dispensare in duplicato 100 µl di Controllo Negativo in
triplicato, 100 µl di Controllo Positivo in duplicato e quindi
i100 µl di Calibratore in duplicato in pozzetti appropriati.
Non diluire i controlli ed il calibratore in quanto essi sono
pronto uso !
4.
Dispensare infine 100 µl di campione diluito nel pozzetto
appropriato e quindi controllare che tutti i pozzetti dei
campioni siano colorati di blu e che controlli e calibratori
siano stati correttamente dispensati.
5.
Incubare la micropiastra per 60 min a +37°C .
Nota importante: Sigillare le strips con l’adesivo fornito solo
se il test è condotto a mano. Non ricoprire le strips con
l’adesivo in caso di procedura automatica con stazione ELISA.
6.
Circa
5-10
minuti
prima
dell’uso,
preparare
l’immunocomplesso HAV/Coniugato come descritto in
precedenza.
7.
Lavare la micropistra con un lavatore ELISA automatico
come descritto nella sezione I.3.
8.
Pipettare 100 µl di immunocoplesso HAV/Coniugato in
ciascun pozzetto, ad esclusione di A1 e coprire la
micropiastra con l’adesivo. Verificare che tutti i pozzetti
abbiano un colore rosso, eccetto A1.
Nota importante: Fare attenzione a non toccare la superficie
interna del pozzetto con il puntale pieno di coniugato
enzimatico; si potrebbero ottenere fenomeni di contaminazione.
9.
Incubare la micropiastra 60 min a +37°C .
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10. Lavare la micropiastra come riportato sopra.
11. Pipettare 100 µl di Cromogeno/Substrato in tutti I pozzetti,
incluso A1. Quindi incubare la micropiastra a temp.amb.
(18-24°C) per 20 minuti.
Nota importante: Non esporre a forte illuminazione diretta. Si
potrebbe generare un fondo elevato.
12. Pipettare 100 µl di Acido Solforico in tutti I pozzetti per
bloccare la reazione enzimatica, utilizzando la stessa
sequenza di pipettamento usata al punto 10. L’aggiunta
dell’acido solforico provoca un viraggio di colore del
controllo positivo, del calibratore e dei campioni positivi da
blu a giallo.
13. Misurare l’intensità del colore di ciascun pozzetto, come
descritto in sezione I.5, con filtro da 450nm (lettura) e
possibilmente con filtro da 620-630nm (azzeramento),
utilizzando per l’operazione di azzeramento il pozzetto A1.
Note importanti:
1. Se il secondo filtro non è disponibile, assicurarsi che
nessuna impronta sia presente sul fondo della micropiastra
prima della lettura a 450nm. La presenza di impronte può
generare in lettura falsi positivi.
2. Effettuare la lettura ottica appena dopo l’aggiunta dell’acido
e comunque non oltre 20 minuti dopo la sua
dispensazione. Si potrebbero osservare fenomeni di
autoidrolisi del cromogeno che porterebbero ad un fondo
elevato.
Date: 02/2003
O. CONTROLLO QUALITA’ INTERNO
Ogni qual volta si utilizzi il kit, eseguire una verifica su
controlli/calibratore per verificare se i valori attesi di OD450nm
o di S/Co sono raggiunti nell’analisi.
Assicurarsi che i valori riportati in tabella siano stati ottenuti:
Parametri
Pozzetto A1
Controllo Negativo (NC)
Calibratore (CAL)
Controllo Positivo (PC)
Se i requisiti descritti sono rispettati nell’analisi, procedere alla
sezione successiva.
In caso contrario, procedere alla seguente ulteriore verifica:
Problema
Pozzetto A1
> 0.050
OD450nm
Controllo
Negativo (NC)
> 0.150
OD450nm dopo
azzeramento
coefficiente di
variazione > 30%
N. SHEMA DI DOSAGGIO
Controlli & Calibratore
Campione diluito 1:101
1^ incubazione
Temperatura
Lavaggio
HAV & Coniugato
2^ incubazione
Temperatura
Lavaggio
TMB/H2O2 mix
3^ incubazione
Temperatura
Acido solforico
OD Lettura
100 ul
100 ul
60 min
+37°C
4-5 cicli
100 ul
60 min
+37°C
4-5 cicli
100 ul
20 min
Amb.
100 ul
450nm
Calibratore
S/Co < 1
Si riporta nella tabella seguente un esempio di schema di
dispensazione.
Micropiastra
A
B
C
D
E
F
G
H
1
BLK
NC
NC
NC
CAL
CAL
PC
S1
2
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Legenda: BLK = Blank
NC = Controllo Negativo
CAL = Calibratore PC = Controllo Positivo
S = Campione
Requisiti
< 0.050 OD450nm
< 0.150 OD450nm dopo
azzeramento
CV < 30%
S/Co > 1
> 0.750 OD450nm
Controllo
Positivo
< 0.750
OD450nm
Controllare che:
1. il Cromogeno/Sustrato non si sia
contaminato durante il dosaggio.
1. la procedura di lavaggio e le
impostazioni del lavatore ELISA siano
state convalidate nello studio di prequalificazione;
2. sia stata utilizzata per il saggio la
soluzione di lavaggio fornita con il kit e il
lavatore sia stato condizionato con esso
prima dell’uso;
3. non sia stato commesso alcun errore
nella
procedura
di
dosaggio
(dispensazione del controllo positivo
invece del negativo);
4.
non
sia
avvenuta
alcuna
contaminazione del controllo negativo o
del pozzetto in cui il controllo è stato
dispensato dovuta a schizzi di campione
positivo o di coniugato enzimatico;
5. le micropipette non siano contaminate
da campioni positivi o da coniugato
enzimatico;
6. gli aghi del lavatore non siano intasati
o parzialmente ostruiti.
1. la procedura sia stata correttamente
eseguita;
2. non si sia verificato alcun errore
durante la sua distribuzione (es.:
dispensazione del controllo negativo
invece del calibratore);
3. la procedura di lavaggio e le
impostazioni del lavatore siano state
convalidate
nello
studio
di
prequalificazione;
4.
non
sia
avvenuta
alcuna
contaminazione esterna del calibratore;
1. la procedura di dosaggio sia stata
eseguita correttamente;
2. non siano stati commessi errori
durante la distribuzione del controllo
(dispensazione del controllo negativo
invece del positivo);
3. la procedura di lavaggio e le
impostazioni del lavatore siano state
convalidate
nello
studio
di
prequalificazione;
4.
non
sia
avvenuta
alcuna
contaminazione esterna del controllo.
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Nel caso si sia verificato uno dei problemi sopra elencati,
informare il responsabile del laboratorio per intraprendere le
azioni opportune.
P. CALCOLO DEL CUT-OFF
I risultati del test sono calcolati utilizzando il valore medio di
assorbenza del Controllo Negativo a cui si applica un fattore
numero per definire il valore di cut-off seguente:
Cut-Off = NC + 0.250
Il valore trovato viene utilizzato per l’interpretazione dei risultati
come descritto nel la sezione successiva.
Nota Importante: Quando il calcolo dei risultati viene effettuato
dal sistema operativo di una stazione ELISA automatica,
assicurarsi che sia usata la giusta formulazione per calcolare il
valore di cut-off e quindi generare la corretta interpretazione dei
risultati.
Q. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
I risultati del test sono interpretati come rapporto di OD450nm
del campione ed il valore di cut-off (ovvero S/Co), secondo la
seguente tabella:
S/Co
< 0.8
0.8 – 1.2
> 1.2
Interpretazione
Negativo
Equivoco
Positivo
Un risultato negativo indica che il paziente non ha in corso
infezione da virus dell’Epatite A.
Ogni paziente che mostri un risultato equivoco dovrebbe
essere sottoposto ad ulteriore esame su di un secondo
campione prelevato dopo 1-2 settimane dal primo prelievo.
Un risultato positivo indica che il paziente in esame ha in corso
una infezione acuta da virus dell’Epatite A; tale paziente
dovrebbe quindi essere sottoposto a trattamento idoneo.
Si riporta di seguito un esempio di calcolo del risultato
Nota: I dati seguenti sono di esempio e non devono essere
utilizzati al posto dei risultati veri ottenuti dall’analisi.
Controllo Negativo: 0.050 – 0.060 – 0.070 OD450nm
Valore medio:
0.060 OD450nm
Inferiore a 0.150 – Accettato
Date: 02/2003
2. Ogni risultato positivo dovrebbe essere confermato con un
metodo alternativo (test di conferma) prima di confermare
una diagnosi di infezione da HAV.
3. Nel caso di trasmissione dati da un laboratorio ad una
seconda unità porre attenzione ad evitare errori di
trasferimento dati.
4. La diagnosi di infezione virale deve essere rilasciata al
paziente solo da un medico qualificato.
R. PRESTAZIONI METODOLOGICHE
1. Limite di rilevazione
In assenza di uno standard internazionale per HAV IgM, il limite
di rilevazione del aggio è stato calcolato per mezzo dei
seguenti campioni forniti dalla Boston Biomedica Inc., USA :
1. Accurun # 121
2. Accurun # 51
Questi campioni sono stati preparati come descritto nelle
istruzioni d’uso del fornitore, diluiti in Diluente campione (1:100)
e quindi ulteriormente diluiti in Diluente Campione per generare
una curva limite (Accurun # 121).
I risultati di Controllo Qualità sono riportati nella tabella
seguente:
Preparazione Diluizione S/Co
Accurun
1:100
5.4
# 121
1:200
4.1
1:400
2.8
1:800
1.9
1:1600
1.0
Accurun
# 51
1:100
4.2
2. Sensibilità Clinica:
La sensibilità clinica del saggio è stata verificata su campioni
classificati positivi da un kit approvato US-FDA.
I campioni positivi sono stati raccolti da pazienti sotto infezione
acuta da HAV, confermata dai sintomi clinici e altre analisi.
Un valore assoluto del 100% è stato rilevato nello studio
condotto su un numero totale di campioni maggiore di 100.
E’ stato anche esaminato un pannello di seroconversione,
fornito dalla Boston Biomedica Inc., USA, con i seguenti
risultati:
Pannello di Sieroconversione : PHT 902
Campione OD450nm S/Co DiaSorin Refer.
S/Co
Score
0,3
neg
Controllo Positivo: 2.189 OD450nm
Superiore a 1.000 – Accettato
CTRL (-)
0,048
0,2
Cut-Off = 0.060+0.250 = 0.310
CTRL (+)
1,736
5,8
1
0,037
0,1
2
0,042
0,1
0,3
neg
3
1,956
6,6
6,8
pos
4
1,988
6,7
6,7
pos
5
0,669
2,2
1,5
pos
Calibratore:
0.550 - 0.530 OD450nm
Valore medio:
0.540 OD450nm
S/Co = 1.7
S/Co maggiore di 1.0 – Accettato
Campione 1:
0.070 OD450nm
Campione 2:
1.690 OD450nm
Campione 1 S/Co < 0.8 = negativo
Campione 2 S/Co > 1.2 = positivo
Note Importanti:
1. L’interpretazione dei dati dovrebbe essere eseguita sotto la
supervisione del responsabile di laboratorio per ridurre il
rischio di giudizi errati e false diagnosi.
Member
3. Specificità Clinica:
La specificità clinica è stata determinata su di un pannello di
campioni, negativi con un kit di riferimento, derivati da individui
normali e da donatori di origine europea.
Doc.: INS AVM.CE/it
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Sono stati utilizzati per lo studio sia plasmi, preparati con
tecniche standard (quali citrato, EDTA ed Eparina), che sieri .
Non sono state osservate falsi risultati dovuti ai differenti
metodi di preparazione del campione.
Sono stati testati anche campioni congelati per controllare se
questa procedura interferisse con le prestazioni del saggio.
Non si sono osservate interferenze su campioni scongelati
limpidi, esenti da particelle.
Sono stati pure esaminati campioni derivanti da pazienti con
diverse infezioni virali a carico del fegato (HCV, HDV, HBV,
HEV) e con patologie epatiche non virali, potenzialmente
interferenti nel sistema. Non si sono osservate reazioni
crociate.
Lo studio di Valutazione delle Prestazioni del kit, condotto in
un centro esterno qualificato su più di 500 campioni, ha fornito
un valore > 98 %.
3. Precisione:
E’ stata calcolata su due campioni, uno negativo e l’altro basso
positivo, esaminati in 16 replicati in tre sedute analitiche
diverse. I risultati sono riportati nelle tabelle seguenti:
Test # 1
Campione Negativo Basso Pos
OD450nm
0.058
0.719
Dev.Std.
0.008
0.052
CV %
14.3
7.2
Date: 02/2003
BIBLIOGRAFIA
1. Dienstag J.L.. “Hepatitis A Virus : identification,
characterization and epidemiologic investigations”. Progress in
liver desease VI, Popper E., Schaffner F. (eds), pp 343-370,
New York, Gruner and Stratton, 1979.
2. Duermeyer W., Van der Veen J., Koster B. “ELISA in
Hepatitis A”. Lancet. I.: 823-824, 1978
3. Parry J.V., (1981) “Hepatitis A infection: guidelines for the
development of satisfactory assays for laboratory diagnosis”.
The Institute of Medical Laboratory Sciences, 38, 303-311.
4. Lindberg J., Frosner G., Hansson B.G. et al.
“Serologic markers of hepatitis A and B in chronic active
hepatitis”. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 13:525527, 1978.
5. Barbara J.A., Howell D.R., Briggs M., Parry J.V.. “Post
transfusion hepatitis A”. Lancet (1982), 1-738.
6. Zachoval R., Dienstag J.L., Purcell R.H. “Tests for hepatitis
A virus antigen and antibody” in “Hepatitis A”. Gerety R.J. (Ed),
pp 33-46, Orlando, Academic Press, Inc. 1984
Questo dispositivo è stato prodotto dalla Dia. Pro s.r.l.
sotto i controlli stabiliti da un sistema di qualità totale che
ottempera ai requisiti delle norme ISO 13485 come
verificato dall’Organismo Notificato Europeo n° 0318
Test # 2
Campione Negativo BassoPos
OD450nm
0.048
0.709
Dev.Std.
0.007
0.063
CV %
13.9
8.9
Doc.:
Test # 3
Campione Negativo Basso Pos
OD450nm
0.050
0.713
Dev.Std.
0.007
0.055
CV %
13.4
7.7
S. LIMITI DEL SAGGIO
Sono stati osservati risultati falsamente positivi in meno del 2%
della popolazione normale, prevalentemente dovuti ad alti titoli
di fattore reumatoide.
Campioni congelati contenenti particelle di fibrina o aggregati
possono generare false reattività.
Campioni con presenza di contaminazione batterica o inattivati
al calore possono presentare valori di assorbenza errati con
conseguente alterazione del risultato analitico.
Il dosaggio è idoneo solo per esaminare campioni singoli e non
pool di campioni.
La diagnosi di infezione virale non dovrebbe essere
unicamente basata sulla base di un singolo test. Considerare a
tale proposito anche la storia clinica del paziente, la
sintomatologia e gli altri dati diagnostici disponibili.
0
Prodotto da
Dia.Pro. Diagnostic Bioprobes Srl.
via Columella n° 31 – Milano - Italy
INS AVM.CE it
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