lezione 1

Tecniche di diagnostica genetica
• Metodi basati su ibridazione di oligonucleotidi
• Metodi enzimatici
• Metodi elettroforetici
• Metodi cromatografici
• Nuove metodiche (Real-time PCR,
Pyrosequencing, Microarrays)
• Metodi proteomici
Metodi basati su ibridazione di
oligonucleotidi
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•
•
•
PCR-ARMS
PCR-ASO
Oligopriming competitivo (COP)
OLA
PCR-ARMS
(amplification refractory mutation system)
2° mismatch
2° mismatch
1° mismatch
allele-specifico
Uno dei primers è allele-specifico. La Taq polimerasi manca
dell’attività 3’-5’ esonucleasi. Un secondo mismatch con
entrambi gli alleli aumenta la capacità di discriminare tra wt e
mutato.
Mutazione DHCR7
nella Sindrome di Smith-Lemli-Opitz
Non è possibile
distinguere tra omozigoti
ed eterozigoti
Controllo interno
HN
Multiplex PCR-ARMS
11 mutazioni di
DHCR7 sono
presenti nel’ 85%
dei casi di
sindrome di SmithLemli-Opitz.
Uso di multiple
coppie di primers
in una PCR.
Amplificazione
mutante su uno
strand e wt sull’altro
+ controllo positivo
Distinzione tra
eterozigoti ed
omozigoti
Determinazione genotipo normale e mutato
HFE C282Y è la mutazione più comune dell’emocromatosi
ereditaria
Vantaggi e Limiti della PCR-ARMS
• Adatto a un limitato numero di casi e
mutazioni
• Solo mutazioni note
• Semplice da realizzare
• Può essere usato per analisi aplotipi
• Può essere automatizzato con l’uso di
primers fluorescenti
Allele-Specific Oligonucleotide
Probes
• Usati per ibridazione in epoca pre-PCR come
sonde radioattive su DNA clonato o genomico
immobilizzato su membrana (Dot-blot, Southern)
• Diventati di largo uso come sonde su DNA
amplificato
• 15-17mers 30-50% G+C
• C-A mismatch è più facile da discriminare di G-T
• Problema polimorfismi
1. PCR-ASO
(Forward allele-specific oligonucleotide hybridization)
DNA genomico
amplificato sulla
membrana e ASO in
soluzione.
Sonde radioattive,
biotinilate o
fluorescenti
Mutazioni del gene Aril-solfatasi A (ARSA) nella
leucodistrofia metacromatica
2. REVERSE- ASO
REVERSE- ASO
Oligonucleotidi fissati su membrana e DNA
amplificato dai pazienti usato come probe
Vantaggi e Limiti della PCR-ASO
• Adatto all’analisi di molti casi e mutazioni
• Solo mutazioni note
• Realizzazione semplice, ma sviluppo
laborioso (non disponibile per mutazioni
rare)
OLIGO-PRIMING Competitivo
COP-PCR
Marcature allelespecifiche
wt/wt
Competizione
tra primers
mut e wt
mut/mut
3 primers in
una reazione
wt/mut
COP-PCR
Mutazioni Talassemia-beta
IVSI-110G>A
IVSI-6T>C
Test dei singoli primers
Controllo stringenza
Primers 12-18mers
Forte eccesso
primers/template
COP-PCR, purificazione con
Abs anti-dansylchloride e antiFITC e rilevamento con Ab antibiotina
Vantaggi e Limiti
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Sistema di rilevamento complesso
Solo mutazioni note
Ottimizzazione laboriosa
High-throughput mediante marcatori
fluorescenti e sequenziatore
APPLICAZIONI
Oligonucleotide-ligation Assay
OLA
Probes allele-specifici
Probe comune
template
Maggiore sensibilità se OLA preceduta da PCR
(PCR, denaturazione, ibridazione, ligasi)
Metodi di rilevamento
Rilevamento mediante ELISA
Elettroforesi e marcatori fluorescenti
Rilevamento mediante FRET
(Fluorescence resonance energy transfer)
probes
donor
acceptor
Real-time PCR
Vantaggi e Limiti
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Molto specifico
Solo mutazioni note
Ottimizzazione laboriosa
Vari metodi di rilevamento
Applicabile a multiplex-PCR