UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SASSARI DIPARTIMENTO DI

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SASSARI
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE
Sezione FISIOLOGIA
responsabile prof. Salvatore Naitana
V.Vienna 2, 07100 SASSARI Tel-079229430 – Fax-079229429 -Email: [email protected]
Sassari, li 26-05-2008
Relazione tecnica finale
PROGETTO MONITORAGGIO DEL MARANGONE DAL CIUFFO E DELL’AVIFAUNA
MARINA STANZIALE E MIGRATORIA
Qui di seguito vengono riportati i dati relativi al sessaggio genetico degli individui campionati
durante la campagna di inanellamento presso l’isola di Molarotto tenutasi il 29 Marzo 2008.
Da ciascun individuo sono stati prelevati da 100 a 300 µl di sangue venoso dalla vena
brachiale e 2 penne caudali, quando possibile, e i campioni sono stati conservati a -20°C fino
al momento dell’estrazione del DNA. L’estrazione del DNA dai campioni di sangue è stata
effettuata con la classica metodica del fenolo cloroformio (Sambrook et al, Molecular
Cloning, Springer-Verlag Eds, 1979) che è stato possibile utilizzare in quanto il campione di
partenza era di quantità sufficiente per poter effettuare questo tipo di estrazione. Per
l’applicazione di questa procedura sono stati utilizzati infatti 8-10 µl del campione ematico in
toto per l’estrazione con la metodica del fenolo cloroformio che hanno permesso di ottenere
sufficienti quantità di DNA grazie al fatto che i globuli rossi di tutte le specie avicole, al
contrario dei mammiferi, sono nucleati.
Sul DNA estratto è stata testata una coppia di oligonucleotidi descritti in letteratura per la
determinazione del sesso di numerose specie avicole mediante reazione di polimerizzazione a
catena del DNA (PCR) . La PCR si basa sulla capacità di alcune DNA polimerasi di resistere
ad elevate temperature per cui vengono utilizzate per l’amplificazione di corte sequenze di
DNA di cui si conoscono le porzioni fiancheggianti sulle quali vengono disegnati
oligonucleotidi di innesco per la polimerasi. Gli oligonucleotidi testati sono complementari a
una regione, altamente conservata tra le varie specie avicole, che permette di amplificare una
regione intronica del gene per la Cromo Helicase DNA Binding (CHD). Questo gene è
presente nei cromosomi sessuali W e Z, e in varie specie ha spesso polimorfismi di lunghezza
tra i due cromosomi (Griffits et al., A DNA test to sex most birds, Molecular Ecology 1998,
7:1071-1075).
2 μl del DNA estratto sono stati sottoposti a 30 cicli di PCR costituiti ciascuno dalla
denaturazione a 90°C per 30 sec, dall’anellamento dei primers a 51°C per 40 sec e
dall’estensione dei primers a 72°C per 40 sec. Il prodotto di amplificazione è stato poi
analizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio al 3%. I risultati hanno evidenziato che i
primers utilizzati non permettevano una differenziazione delle sequenze nucleotidiche sesso
specifiche in quanto era presente solamente una sola banda elettroforetica. In seguito abbiamo
provveduto a disegnare una nuova coppia di primers complementari a una nuova sequenza
degli stessi geni. Abbiamo quindi utilizzato queste sequenze oligonucleotidiche in reazioni di
amplificazione di campioni di DNA provenienti da
marangoni dal ciuffo con sesso
sicuramente determinato sui quali operare le necessarie prove di validazione della metodica
di analisi. Il DNA è stato sottoposto a reazione di polimerizzazione a catena (PCR) con i
primers studiati utilizzando 2 μl del DNA estratto che sono stati sottoposti a 33 cicli costituiti
ciascuno dalla denaturazione a 90°C per 30 sec, dall’anellamento dei primers a 51°C per 30
sec e dall’estensione dei primers a 72°C per 40 sec. e dopo 30 cicli di reazione il prodotto di
amplificazione è stato sottoposto ad analisi ad elevata risoluzione su gel di agarosio al 3% in
tampone Tris-Borato-EDTA a pH 8. Dall’elettroforesi è risultato che il sesso maschile,
eterogametico presentava due bande di amplificazione con differente peso molecolare, mentre
i campioni di sesso femminile, omogametico, presentavano una sola banda per cui l’utilizzo di
questi primers in una reazione di PCR permette di determinare il sesso dell’animale di
provenienza del campione. Abbiamo quindi utilizzato questa procedura per l’analisi genetica
del sesso dei pulli catturati e inanellati nell’isola di Molarotto durante la campagna di
inanellamento 2008. Abbiamo avuto un risultato positivo di amplificazione nel 100% dei casi.
Infatti dei 16 campioni analizzati il 62,5 % sono risultati di sesso maschile. Questi risultati
sono in linea con quanto viene osservato nella sex ratio in piccole popolazioni di animali e
come osservato dalle analisi effettuate sulla colonia di Corcelli.
Nella seguente tabella sono elencati i risultati della determinazione del sesso sui campioni
analizzati in relazione ai numeri degli anelli inseriti durante la campagna di inanellamento.
Nido
Prelievo
penne
prelievo
sangue
P12596
1
no
si
D56
P12597
1
no
si
D57
P12598
2
si
si
D58
P12599
3
no
si
D59
P12600
3
no
no
D60
P12601
4
no
si
PVC
METALLO
D55
Sesso
♀
♂
♂
♂
♀
D61
P12602
4
no
no
D62
P12603
4
no
no
D63
P12604
5
no
si
D64
P12605
5
no
si
D65
P12606
5
no
si
D66
P12607
6
no
si
D67
P12608
6
no
si
D68
P12609
7
no
si
D69
P12610
8
si
si
D70
P12611
8
si
si
D71
P12612
9
no
si
D72
P12613
9
no
si
D73
P12614
9
no
si
D74
P12615
10
no
no
D75
P12616
10
no
no
D76
P12617
11
no
no
D77
P12618
12
no
no
D78
P12619
12
no
no
D79
P12620
12
no
no
♀
♂
♀
♂
♂
♂
♀
♂
♂
♀
♂
Il Responsabile del progetto
(Prof. Salvatore Naitana)