Valorizzazione di specie vegetali eduli

Università degli studi di Cagliari
CORSO DI DOTTORATO IN SCIENZE E TECNOLOGIE DELLA TERRA E
DELL'AMBIENTE
INDIRIZZO BOTANICA AMBIENTALE E APPLICATA
Ciclo XXIX
TITOLO
Valorizzazione di specie vegetali eduli spontanee e coltivate attraverso
sistemi di caratterizzazione chimica e molecolare a garanzia di qualità
DOTTORANDA: Dott.ssa Marengo Arianna
COORDINATORE DOTTORATO: Prof. Lattanzi Pierfranco
TUTOR/RELATORE: Dott. Maxia Andrea, Università degli Studi di Cagliari
CO-TUTOR: Prof.ssa Rubiolo Patrizia, Università degli Studi di Torino
Prof.ssa Cinzia Bertea, Università degli Studi di Torino
1. Introduzione
Data la loro importanza in campo alimentare, le specie vegetali eduli, sia coltivate che spontanee, sono da
sempre studiate al fine di analizzare i composti che esse sintetizzano e ricercare marker che permettano una
loro rapida identificazione. Le piante sono fonte di numerose molecole, alcune delle quali possono avere
differenti proprietà che le rendono di notevole importanza in molteplici campi (industriale, farmaceutico,
nutraceutico) conferendo quindi alla pianta un valore economico. Alcuni lavori sono stati condotti da
differenti gruppi di ricerca al fine di valorizzare specie vegetali eduli, proprio verificando la presenza di
eventuali metaboliti secondari di interesse (Pinelli et al., 2007; Omar et al., 2012).
Oltre ad ampliare la conoscenza riguardo alle molecole che vengono prodotte e alle loro eventuali proprietà,
è altresì necessario trovare dei metodi efficaci e semplici di tracciabilità (Galimberti et al., 2013). Esistono
varie metodiche, sia chimiche sia biomolecolari, atte alla discriminazione delle diverse specie o varietà di
piante. In questo progetto ci concentreremo su analisi cromatografiche e biomolecolari (PCR-based), in
particolare utilizzando il cosiddetto “DNA barcoding”. Tale tecnica è basata sull’assunto che la variabilità
interspecifica eccede quella intraspecifica e si esplica nell’utilizzo di protocolli standardizzati per l’analisi di
sequenze variabili (Hebert et al., 2003).
Negli ultimi vent’anni molti metodi PCR-based sono stati testati su differenti cultivar, ad esempio di riso,
orzo e su molti altri generi vegetali di interesse alimentare, quali ad esempio il genere Mentha, Ocimum,
Origanum, Rosmarinus (De Mattia et al., 2011; Galimberti et al., 2013).
2. Attività - I° Anno
Il primo anno di ricerca si è incentrato principalmente nel selezionare, attraverso indagini etnobotaniche
basate sulla letteratura, un pool di specie di interesse alimentare, al fine di valorizzare le piante stesse e il
territorio in cui esse crescono spontaneamente. Le specie identificate sono state inquadrate
tassonomicamente per avere un quadro sinottico e di facile consultazione. In questa prima fase si è partiti
dalle Asteraceae e precisamente dalla tribù delle Cardueae che annovera una moltitudine di entità vegetali
eduli che la popolazione sarda comunemente distingue solo con il termine “Cardu” e/o “Cardu burdu”
(Atzei, A. D.,2003; Signorini et al., 2009). A queste specie spontanee eduli si affiancheranno alcune colture
di consolidato interesse economico, quali ad esempio il carciofo.
Mediante tecniche chimiche e biomolecolari si cercherà quindi di valorizzare le specie prese in esame,
indagando la presenza di metaboliti secondari di interesse e proponendo metodi semplici di tracciabilità.
Inoltre si sta valutando di ampliare gli studi al genere Pistacia, alle specie coltivate del genere Ocimum e ad
alcune specie non considerate eduli dalla tradizione sarda ma potenzialmente valorizzabili in quanto specie
utilizzate in altre tradizioni popolari. Inoltre ci si sta occupando di identificare alcune specie esotiche di
interesse economico importate da alcune comunità di migranti oramai stanziali nel territorio sardo (Maxia et
al., 2014).
Alcune delle specie selezionate presentano, ad ora, poco materiale in letteratura oltre che nessuna sequenza
genica depositata in banca dati. Il primo passo fondamentale, al fine di ottenere dati soddisfacenti, è quello di
ottimizzare i vari protocolli, chimici e biomolecolari, in base alla matrice utilizzata e ai risultati che si
vogliono ottenere. Al momento ci siamo concentrati sulle analisi di estrazione e amplificazione del DNA, gli
steps successivi prevedono l’analisi dei dati al fine di identificare markers discriminanti.
3. Materiali e metodi
3.1. Identificazione delle specie e raccolta del materiale vegetale
Tabella 1: Elenco delle specie considerate
Nome scientifico
Carduus argyroa Biv.
Carduus nutans subsp. macrocephalus (Desf.) Nyman
Carlina gummifera (L.) Less.
Galactites tomentosa Moench
Onopordum horridum Viv.
Ptilostemon casabonae (L.) Greuter
Silybum marianum (L.) Gaertn.
Nome scientifico
Pistacia lentiscus L.
Pistacia x saportae Burnat
Pistacia terebinthus L.
Tribù
Cardueae
Cardueae
Cardueae
Cardueae
Cardueae
Cardueae
Cardueae
Sito di racc.
Uta
Uta
Jerzu
Gennargentu
Gennargentu
Gennargentu
Gennargentu
Data di racc.
Maggio 2014
Maggio 2014
Settembre 2014
Giugno 2014
Giugno 2014
Giugno 2014
Giugno 2014
Genere
Pistacia
Pistacia
Pistacia
Sito di racc.
Baunei
Baunei
Baunei
Data di racc.
Giugno 2014
Giugno 2014
Giugno 2014
Mediante una ricerca bibliografica, concernente diverse tradizioni popolari, ivi inclusa quella sarda, è stato
selezionato un pool di piante di interesse etnobotanico. Le matrici vegetali, circa dieci individui per ogni
specie, sono state raccolte in diverse parti della Sardegna, nel tempo balsamico più opportuno, e inquadrate
tassonomicamente (Tabella 1). Le droghe vegetali sono state ripulite da residui, parti danneggiate da agenti
patogeni e/o estranei e essiccate per 24h/36h in stufa a 40°C, per impedire o ridurre i processi enzimatici che
potrebbero alterare le matrici durante la loro conservazione. Infine le droghe macinate sono state messe a
disposizione per le analisi chimiche e biomolecolari.
3.2 Estrazione e caratterizzazione qualitativa e quantitativa del fitocomplesso
L'estrazione del fitocomplesso viene fatta utilizzando diverse apparecchiature e/o solventi che possono
variare in base alla natura della matrice vegetale.
Per quanto riguarda ad esempio le specie appartenenti alla tribù delle Cardueae, viene effettuata
un’estrazione idroalcolica dei composti a peso molecolare elevato.
L’estratto così ottenuto è stato analizzato attraverso la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)
unita a uno spettrofotometro per l’identificazione dei composti presenti nella miscela. I composti vengono
separati mediante un gradiente di acetonitrile + TFA (Acido Trifluoroacetico) e acqua + TFA. I
cromatogrammi, ottenuti a due differenti lunghezze d’onda, permettono l’identificazione di alcune molecole
confrontando il tempo di ritenzione con quello di standard specifici (Acido Clorogenico e Cinaroside).
3.3 Estrazione ed analisi del DNA
Il DNA è stato estratto per mezzo di un apposito kit (EuroGold Plant DNA Mini Kit), utilizzando specifici
buffer e colonnine con affinità specifiche. La presenza del DNA genomico è stata verificata attraverso corsa
su gel di agarosio 0.7%, utilizzando un marker molecolare di 1kb. Le bande, colorate con Bromuro di Etidio,
sono state visualizzate mediante un transilluminatore UV. In seguito il DNA è stato amplificato attraverso
reazioni a catena della polimerasi (PCR). La reazione è stata preparata aggiungendo 2 µl di Dream TAQ
buffer 10X, 0.4 µl di dNTPs 10 mM, 0.5 µl primers 10 µM, 0.2 µl Dream TAQ Polymerase, 1 µl DNA
diluito e acqua per un volume finale di 20 µl. Sono state fatte differenti prove di PCR con diverse condizioni,
ad ora il programma che ha dato risultati migliori è stato il seguente: 95°C per 3 min, 40 cicli di 95°C per 30
sec, Ta per 50 s, 72°C per 1 min seguiti da 72°C per 7-10 min.
Tabella 2: Primers utilizzati
Primers
Sequenza primers
Tm [°C]
Bibliografia
ITS 1
ITS 2
ITS 3
ITS 4
5S_P1
5S_P2
PsbaF
TrnhF-05
MatK 390
MatK 1326
RbcL1F
Rbcl724R
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
GCTGCGTTCTTCATCGATGC
GCATCGATGAAGAACGCAGC
TCCTCCGCTTATTGATATGC
GTGCTTGGGCGAGAGTAGTA
TTAGTGCTGGTATGATCGCA
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
CGATCTATTCATTCAATATTTC
TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT
ATGTCACCACAAACAGAAAC
TCGCATGTACCTGCAGTAGC
61
59.4
59.4
55.3
59.4
55.3
56.5
64.2
50.9
58.4
53.2
59.4
(White et al., 1990)
(White et al., 1990)
(White et al., 1990)
(White et al., 1990)
(Rubiolo et al., 2009)
(Rubiolo et al., 2009)
(Sang et al., 1997)
(Tate et al., 2003)
(Cuenoud et al., 2002)
(Cuenoud et al., 2002)
(Fay et al., 1997)
(Fay et al., 1997)
Sono state amplificate differenti regioni del DNA, utilizzando primers universali specifici per geni
“barcoding”. In particolare, sono stati utilizzati i seguenti primers (Tabella 2):
 primers nucleari: ITS (Internal Transcribed Spacer) 1-2-3-4, 5s-rRNA-NTS (5s-rRNA non
transcribed spacer)
 primers plastidiali: RBCL (RuBisCo large subunit), MATK (Maturase K), PsbaTrnh
I campioni amplificati sono stati analizzati attraverso una corsa elettroforetica in gel di agarosio 1.5%,
utilizzando un marker molecolare di 100 bp. Effettuando un confronto tra le bande ottenute è possibile
verificare la presenza di regioni genomiche variabili.
4. Risultati preliminari e criticità
È stata condotta una ricerca bibliografica sugli usi etnobotanici relativi alle specie considerate in questo
primo anno di dottorato. Ci siamo in particolare concentrati su alcune specie appartenenti alla tribù delle
Cardueae e stiamo valutando di approfondire gli studi su tre taxa appartenenti al genere Pistacia (Tabella 1).
Tabella 3: Dati etnobotanici
Scientific name
Carduus argyroa
Biv.
Sardinian name
Cadru, Cardu
Area
Sardinia
Sicily
Carduus nutans
subsp.
macrocephalus
(Desf.) Nyman
Carlina gummifera
(L.) Less.
Bardu ispinosu,
Cardu spinosu
Bardu cabiddu,
Musciurida
Sardinia
Marche
Sardinia
Sicily, Spain,
Arabian peninsula
North Africa
Galactites tomentosa
Aldu pintu, Bardu
Sardinia
Food data
Edible parts
Edible forms
Stems
Raw (pickled in
oil, oil dip),
cooked (fried)
Tender stems
Cooked (boiled or
fried
Stems
Raw (pickled in
oil, oil dip),
cooked (fried)
Aerial part
Aromatic
Receptacles
Raw (pickled in
before blooming,
oil, oil dip),
aerial parts
cooked (boiled)
Inflorescences,
Raw, Cooked
aerial parts
(boiled)
Roots ashes
Cooked (bloiled,
dried and mixed
with semolina and
butter)
Young leaves,
Raw, cooked
Bibliography
(Atzei, A.
D.,2003)
(Lentini et al.,
2007)
(Atzei, A.
D.,2003)
(Guarrera, 2003)
(Atzei, A.
D.,2003; Lentini
et al., 2007)
(Lentini et al.,
2007)
(Lentini et al.,
2007)
(Atzei, A.
Moench
anzonìnu, Cardu
biancu
stems,
inflorescences,
shoots
(fried)
Young leaves,
stems
Leaves
Cooked (fried)
Sardinia
Flowers, fruits,
stems
Raw (salad),
cooked
Sicily
Tender stems
Cooked
Sardinia
Flowers, shoots
Cooked
Sardinia
Flowers, leaves,
shoots, stems
Raw (salad,
pickled in oil),
cooked (fried)
Sicily, Spain,
England
Aerial part
Lazio
Sardinia
Stems, leaves
Fruits
Raw (salad),
cooked (fried,
boiled)
Cooked
Oil
Cyprus
Fruits
Greece
Leaves
Spain
Braches, leaves
//
//
//
Accodro, Chessa
bera, Còdura, Sapòri
Cyprus
Stems, fruits
Basilicata
Liguria
Onopordum
horridum Viv.
Ptilostemon
casabonae (L.)
Greuter
Silybum marianum
(L.) Gaertn.
Pistacia lentiscus L.
Pistacia x saportae
Burnat
Pistacia terebinthus
L.
Aldu nieddu, Ardu
nieddu
Caldu drummitu,
Cardu de Casteddu,
Cima de cibirus
Ardu biancu, Cardu
tufu, Cima de cardu
Chessa, Astingùl,
Celsa, Listinchinu,
Lentiscu
Cooked (boiled)
D.,2003;
Ghirardini et al.,
2007; Signorini et
al., 2009)
(Ghirardini et al.,
2007)
(Cornara et al.,
2009)
(Atzei, A.
D.,2003; Lentini
et al., 2007)
(Lentini et al.,
2007)
(Atzei, A.
D.,2003)
Oil, pies with
flour, sausages
Raw (pickled in
vinegar)
For gardening
olives
//
(Atzei, A.
D.,2003; Lentini
et al., 2007;
Lancioni M.C. et
al., 2007;
Signorini et al.,
2009)
(Tardio et al.,
2006; Lentini et
al., 2007)
(Guarrera, 2003)
(Lancioni M.C. et
al., 2007;
Ghirardini et al.,
2007)
(Hadjichambis et
al., 2008)
(Hadjichambis et
al., 2008)
(Tardio et al.,
2006)
//
Raw, cooked
(fried), oil
(Hadjichambis et
al., 2008)
Si può evincere che la maggior parte delle specie considerate presentano un uso alimentare nella tradizione
popolare sarda, oltre che in altre tradizioni italiane o straniere (Tabella 3). Le varie parti della pianta (fusto,
foglie, infiorescenze ecc.) vengono preparate e consumate in diversi modi, sia cotte che crude.
Si è deciso di estendere lo studio a P. lentiscus specie ampiamente utilizzata nella tradizione popolare,
includendo P. terebinthus in quanto le foglie e le drupe sono utilizzate per sofisticare i derivati di P. lentiscus
(olio essenziale e olio fisso) e Pistacia x saportae, ibrido scoperto in tempi relativamente recenti (Werner et
al., 2001).
Gli estratti idroalcolici di alcune specie appartenenti alla tribù delle Cardueae sono stati analizzati mediante
HPLC. Al momento è stato possibile condurre solamente delle analisi preliminari, andando a valutare i titoli
(%) in “Acidi caffeoilchinici”, in “Flavonoidi” e in “Cinaropicrina” presenti negli estratti. Dai
cromatogrammi ottenuti è possibile evidenziare, tra i campioni analizzati, differenze quantitative delle
molecole considerate. Si è focalizzata l’attenzione su classi di composti potenzialmente con proprietà
“antiossidanti” e proprietà “amaricanti”.
Per quanto riguarda le analisi biomolecolari sono state condotte varie prove sperimentali, in diverse
condizioni, al fine di trovare un protocollo ottimale. Le prove di estrazione sono state effettuate utilizzando
campioni congelati o secchi, variando il metodo di omogeneizzazione (beads, mortaio, azoto liquido),
variando il quantitativo di materiale di partenza e il volume di eluizione. Gli estratti di migliore qualità si
sono ottenuti partendo da 15/20 mg di materiale secco omogeneizzato mediante azoto liquido e mortaio e
eluendo il DNA in 100 µl di eluente. In seguito sono state condotte diverse prove di amplificazione, variando
la concentrazione di DNA di partenza, la concentrazione dei primers e il programma di PCR. Al momento i
risultati migliori si sono ottenuti diluendo gli estratti, in particolare effettuando una diluizione 1:10 per i
campioni Pistacia e 1:50 per i campioni appartenenti alla tribù delle Cardueae. Gli estratti indiluiti, in
particolare quelli derivanti dalle Cardueae, si presentano ricchi in fenoli e altri metaboliti secondari che
inibiscono l’enzima TAQ Polymerase, responsabile dell’amplificazione dei geni d’interesse. Attraverso una
diluizione è quindi possibile ridurre la concentrazione di tali composti e quindi migliorare il processo di
amplificazione. Inoltre, poiché alte concentrazioni di primers determinano la loro dimerizzazione,con la
comparsa di bande aspecifiche, si è optato per un quantitativo di 0.25 µM di primers.
I campioni ottenuti sono stati analizzati mediante una corsa elettroforetica in agarosio 1.5%. Al momento i
geni amplificati con maggior successo sono ITS 1_2 e RbcL sia per i Pistacia che per le Cardueae, ITS 1_4
dà invece buoni risultati solo con i campioni del genere Pistacia e MatK amplifica bene alcuni DNA delle
Cardueae. Attraverso un’analisi preliminare dei campioni, analizzando solo le bande ottenute mediante
l’elettroforesi non è possibile trovare differenze evidenti. Le bande ottenute amplificando i geni RbcL e ITS
1_2 delle tre specie di Pistacia, ad esempio, sembrerebbero ad altezze leggermente diverse, ma questo
potrebbe essere dovuto a un effetto ottico o a una diversa concentrazione del DNA. Sarà necessario
proseguire con gli esperimenti e nello specifico sequenziare i geni amplificati.
6. Studi futuri
A partire dagli esperimenti condotti e dai risultati ottenuti si proseguirà con ulteriori analisi. Per quanto
riguarda la parte chimica, si continuerà con l’analisi degli estratti ottenuti dalle piante sotto studio, al fine di
identificare alcuni dei composti sintetizzati.
Dal punto di vista biomolecolare si proseguirà con l’estrazione di DNA e l’amplificazione dei geni
d’interesse. Una volta amplificati tutti i geni d’interesse si procederà con il sequenziamento, al fine di trovare
differenze discriminanti all’interno delle sequenze ottenute ed eventualmente siti di taglio enzimatici che
permettano un più rapido riconoscimento.
Oltre alle piante citate verranno analizzate altre specie vegetali eduli, facendo sempre riferimento alla cultura
etnobotanica sarda e in generale mondiale. Si effettueranno diversi tipi di estrazione del fitocomplesso, al
fine di analizzare sia le molecole a peso molecolare elevato sia la componente volatile, in base alla matrice
vegetale sotto studio.
Inoltre, un’idea per valorizzare ulteriormente le specie eduli vegetale è quella di testare gli estratti ottenuti
effettuando dei saggi biologici (antiossidanti, antibatterici, antivirali) cercando poi di capire, mediante analisi
cromatografiche e frazionamento, quali molecole o insieme di molecole, determinino l’attività biologica
osservata.
7. Attività integrativa – I° anno
Corso istituzionale
Attività
Periodo di ricerca presso Università
degli Studi di Torino (1 mese)
Corso per dottorandi: Doing
scientific research: context and
guidelines (Prof. Dessì, Cubeddu)
Seminario tenutosi ad Oristano
“Sbocchi professionali del corso di
laurea di Biotecnologie Industriali”
Corso di Laurea in Biologia: corso di
Botanica Sistematica (Prof.ssa Loi)
5° PhD. Summer School:
Data
AD HOC
Corsi di laurea
Marzo-Aprile 2014
7 Aprile-11 Aprile
2014
4 CFU
X
4 CFU
9 Aprile 2014
30 Aprile-5 Giugno
2014
16 Giugno-21
CFU (basati sulla
tabella dei crediti
del 18.03.14)
0.5 CFU
X
X
7 CFU
4 CFU
Agrobiodiversity of the mediterraean
area: a heritage to rediscover and
conserve – Università di Cagliari
Pubblicazione su rivista
Internazionale (censita ISI o Scopus):
Indian Journal of Traditional
Knowledge
109° Congresso SBI a Firenze
Presentazione Poster - 109°
Congresso SBI a Firenze
Tutor: Biologia Vegetale - 1°
semestre – Corso di Laurea in
Chimica e Tecnologie Farmaceutiche
Giugno 2014
Aprile 2014
25 CFU
2 Settembre-5
Settembre 2014
2 Settembre-5
Settembre 2014
2 CFU
2 CFU
Ott. 2014 – Genn.
2015 - 40 ore
5 CFU
References
Atzei AD (2003) Le piante della tradizione popolare della Sardegna, Carlo Delfino Editore.
Cornara L, La Rocca A, Marsili S, Mariotti MG. (2009) Traditional uses of plants in the Eastern Riviera (Liguria,
Italy), Journal of Ethnopharmacology, 125: 16-30.
Cuenoud P, Savolainen V, Chatrou LW, Powell M, Grayer RJ, Chase MW. (2002) Molecular phylogenetics of
Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA sequences, American Journal of
Botany, 89: 132-44.
De Mattia F, Bruni I, Galimberti A, Cattaneo F, Casiraghi M, Labra M. (2011) A comparative study of different DNA
barcoding markers for the identification of some members of Lamiacaea, Food Research International, 44: 693-702.
Fay MF, Swensen S.M., Chase M.W. (1997) Taxonomic Affinities of Medusagyne-oppositifollia (Medusagynaceae),
Kew Bulletin, 52(1): 111-20.
Galimberti A, De Mattia F, Losa A, Bruni I, Federici S et al. (2013) DNA barcoding as a new tool for food traceability,
Food Research International, 50: 55-63.
Ghirardini MP, Carli M, Del Vecchio N, Rovati A, Cova O et al. (2007) The importance of a taste: A comparative
study on wild food plants consumption in twenty-one local communities in Italy, Journal of Ethnobiology and
Ethnomedicine, 3: 22.
Guarrera PM. (2003) Food medicine and minor nourishment in the folk traditions of Central Italy (Marche, Abruzzo
and Latium), Fitoterapia, 74: 515-44.
Hadjichambis AC, Paraskeva-Hadjichambi D, Della A, Giusti ME, De Pasquale C et al. (2008) Wild and semidomesticated food plant consumption in seven circum-Mediterranean areas, International Journal of Food Sciences and
Nutrition, 59: 383-414.
Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, DeWaard JR. (2003) Biological identifications through DNA barcodes,
Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences, 270: 313-21.
Lancioni M.C., Ballero M., Mura L., Maxia A. (2007) Usi alimentari e terapeutici nella tradizione popolare del
Goceano (Sardegna centrale), Atti Soc. tosc. Sci nat. Mem.45-56.
Lentini F, Venza F. (2007) Wild food plants of popular use in Sicily, Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, 3:
15.
Maxia A, Demurtas A, Kasture S, Kasture V, Fadda V et al. (2014) Medical ethnobotany survey of the Senegalese
community living in Cagliari (Sardinia, Italy), Indian Journal of Traditional Knowledge, 13 (2): 275-82.
Omar AA, Hadad GM, Badr JM. (2012) First Detailed Quantification of Silymarin Components in the Leaves of
Silybum marianum Cultivated in Egypt during Different Growth Stages, Acta Chromatographica, 24: 463-74.
Pinelli P, Agostini F, Comino C, Lanteri S, Portis E, Romani A. (2007) Simultaneous quantification of caffeoyl esters
and flavonoids in wild and cultivated cardoon leaves, Food Chemistry, 105: 1695-701.
Rubiolo P, Matteodo M, Bicchi C, Appendino G, Gnavi G et al. (2009) Chemical and Biomolecular Characterization of
Artemisia umbelliformis Lam., an Important Ingredient of the Alpine Liqueur "Genepi", Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 57: 3436-43.
Sang T, Crawford DJ, Stuessy TF. (1997) Chloroplast DNA phylogeny, reticulate evolution, and biogeography of
Paeonia (Paeoniaceae), American Journal of Botany, 84: 1120-36.
Signorini MA, Piredda M, Bruschi P. (2009) Plants and traditional knowledge: An ethnobotanical investigation on
Monte Ortobene (Nuoro, Sardinia), 5.
Tardio J, Pardo-de-Santayana M, Morales R. (2006) Ethnobotanical review of wild edible plants in Spain, Botanical
Journal of the Linnean Society, 152: 27-71.
Tate JA, Simpson BB. (2003) Paraphyly of Tarasa (Malvaceae) and diverse origins of the polyploid species, Systematic
Botany, 28: 723-37.
Werner O, Sànchez-Gòmez P, Guerra J, Martìnez JF. (2001) Identification of Pistacia X saportae Burnat
(Anacardiaceae) by RAPD analysis and morphological characters, Scientia Horticulturae, 91: 179-86.
White TJ, Bruns S, Lee S, Taylor J. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for
phylogenetics, PCR protocols: A Guide to Methods and Applications315-22.