METODOLOGIE DI CONTROLLO LUNGO LA FILIERA

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PREVENZIONE E DETOSSIFICAZIONE - Stefania Iametti
Lodi, 12 aprile 2011
METODOLOGIE DI CONTROLLO LUNGO
LA FILIERA
PRESTAZIONI, SENSIBILITÀ E LIMITI DI
APPLICAZZIONE
Stefania Iametti
DISMA - Milano
DISMA - Dipartimento di Scienze Molecolari Agroalimentari
definizione di metodi
definizione limite
standard affidabili
metodi analitici appropriati
Regulatory status:
- since January 1, 1999, EU-wide uniform residue
limits for aflatoxins have been provided
- for aflatoxin B1 in feed:
0.5 µg/Kg (500 ppt) for dairy cattle
20 µg/Kg (2000 ppt) (directive 2002/32 EC)
- for aflatoxin M1 in milk
0.05 µg/l (50 ppt)
definizione limite
standard affidabili
European Commission’s Joint Research Centre/Institute for Reference Materials and Measurements
European Commission’s Joint Research Centre/Institute for Reference Materials and Measurements
definizione limite
standard affidabili
Pubblicazioni su procedure 2010-2011: M1 latte
Wang, JJ; Liu, BH; Hsu, YT; et al. FOOD CONTROL, 22 (6): 964-969 JUN 2011
Sensitive competitive direct enzyme-linked immunosorbent assay and gold nanoparticle immunochromatographic
strip for detecting aflatoxin M1 in milk
Beltran, E; Ibanez, M; Sancho, JV; et al. FOOD CHEMISTRY, 126 (2): 737-744 MAY 15 2011
UHPLC-MS/MS highly sensitive determination of aflatoxins, the aflatoxin metabolite M1 and ochratoxin A in
baby food and milk
Kanungo, L; Pal, S; Bhand, S BIOSENSORS & BIOELECTRONICS, 26 (5): 2601-2606 JAN 15 2011
Miniaturised hybrid immunoassay for high sensitivity analysis of aflatoxin M1 in milk
Aguilera-Luiz, MM; Plaza-Bolanos, P; Romero-Gonzalez, R; et al. ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY,
399 (8): 2863-2875 MAR 2011
Comparison of the efficiency of different extraction methods for the simultaneous determination of mycotoxins
and pesticides in milk samples by ultra high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Guan, D; Li, PW; Zhang, Q; et al. FOOD CHEMISTRY, 125 (4): 1359-1364 APR 14 2011
An ultra-sensitive monoclonal antibody-based competitive enzyme immunoassay for aflatoxin M-1 in milk and
infant milk products
Santini, A; Ferracane, R; Meca, G; et al. ANALYTICAL METHODS, 2 (7): 884-889 JUL 2010
Comparison and improvement of the existing methods for the determination of aflatoxins in human serum by LCMS/MS
Pubblicazioni su procedure 2010-2011: B aflatossine
Ye, Y; Wang, P; Zhou, YX; et al. FOOD CONTROL, 22 (7): 1072-1077 JUL 2011
Evaluation of latex agglutination inhibition reaction test for rapid detection of aflatoxin B-1
Anfossi, L; D'Arco, G; Calderara, M; et al. FOOD ADDITIVES AND CONTAMINANTS PART A-CHEMISTRY ANALYSIS CONTROL
EXPOSURE & RISK ASSESSMENT, 28 (2): 226-234 2011
Development of a quantitative lateral flow immunoassay for the detection of aflatoxins in maize
Rahmani, A; Jinap, S; Soleimany, F FOOD ADDITIVES AND CONTAMINANTS PART A-CHEMISTRY ANALYSIS CONTROL EXPOSURE &
RISK ASSESSMENT, 27 (12): 1683-1693 2010
Validation of the procedure for the simultaneous determination of aflatoxins ochratoxin A and zearalenone in
cereals using HPLC-FLD
Liao, JY; Li, H MICROCHIMICA ACTA, 171 (3-4): 289-295 DEC 2010
Lateral flow immunodipstick for visual detection of aflatoxin B-1 in food using immuno-nanoparticles composed
of a silver core and a gold shell
Yao, H; Hruska, Z; Kincaid, R; et al. FOOD ADDITIVES AND CONTAMINANTS PART A-CHEMISTRY ANALYSIS CONTROL EXPOSURE &
RISK ASSESSMENT, 27 (5): 701-709 2010
Correlation and classification of single kernel fluorescence hyperspectral data with aflatoxin concentration in
corn kernels inoculated with Aspergillus flavus spores
Lupo, A; Roebuck, C; Dutcher, M; et al. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL, 93 (2): 587-599 MAR-APR 2010
Validation Study of a Rapid ELISA for Detection of Aflatoxin in Corn
Tang, DP; Yu, YL; Niessner, R; et al. ANALYST, 135 (10): 2661-2667 2010
Magnetic bead-based fluorescence immunoassay for aflatoxin B-1 in food using biofunctionalized rhodamine Bdoped silica nanoparticles
Mahoney, N; Molyneux, RJ JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, 58 (7): 4065-4070 APR 14 2010
Rapid Analytical Method for the Determination of Aflatoxins in Plant-Derived Dietary Supplement and Cosmetic
Oils
Gallo, A; Masoero, F; Bertuzzi, T; et al. FOOD ADDITIVES AND CONTAMINANTS PART A-CHEMISTRY ANALYSIS CONTROL EXPOSURE
& RISK ASSESSMENT, 27 (1): 54-63 2010
Effect of the inclusion of adsorbents on aflatoxin B1 quantification in animal feedstuffs
Metodi analitici:
HPLC rivelazione spettroscopica
HPLC rivelazione spettrometria di massa
ELISA
Metodi analitici:
ricerca aflatossine “in animal feed”
ELISA
M. Pascale, Atti progetto SISPROLAT
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
10 g di campione macinato + 100 ml di acetone:acqua (80:20, v/v)
estrazione (blending, 2 min) e filtrazione dell’estratto
IMMUNOAFFINITY CLEAN – UP
• Diluire l’estratto con acqua (1:4) e filtrare su filtro a microfibra di
vetro
• caricare 20 ml su colonna ad immunoaffinità (Aflatest® WB, VICAM,
USA)
• Lavare con acqua distillata (2 × 5 ml)
• Eluire con metanolo (2 × 1 ml)
• Portare a secco (con N2) e riprendere con 250 µL di
acqua:metanolo:acetonitrile (60:20:20, v/v/v)
• Filtrare su filtro di nylon (0.45 µm), se necessario
M. Pascale, atti progetto SISPROLAT
ANALISI HPLC
• Quantità iniettata: 50 µL (equivalente
a 0.08 g di matrice)
• Colonna: Synergi
 4 µm MAX-RP - C12
(150 × 4.6 mm, Phenomenex)
• Temperatura: 40°C
• Fase mobile: H2O : CH3CN : CH3OH
(64:23:13) + 119 mg di KBr + 100 µl
HNO3 (65%) per litro di soluzione
• Flusso: 0.8 ml/min
• Derivatizzazione: post-colonna con Br2 (Kobra Cell®,
R-Biopharm Rhone LTD, UK)
• Detector: a fluorescenza (λ
λex. = 365 nm, λem. = 435 nm)
KOBRA® CELL
Cella elettrochimica per la derivatizzazione delle aflatossine B1 e G1
Il KOBRA® CELL è una cella elettrochimica che genera
l’agente derivatizzante, il bromo, dal KBr presente nella
fase mobile. La reazione di derivatizzazione delle
aflatossine avviene in tempi brevi (il tempo di reazione è di
circa 4 secondi) a temperatura ambiente.
I metodi classici per la derivatizzazione delle aflatossine
prevedono l’uso di sostanze chimiche come l’acido
trifluoroacetico (TFA), il PBPB (C5H5N · HBr · Br2) o lo
iodio. Con l’utilizzo del KOBRA® CELL non è necessaria la
derivatizzazione manuale (come avviene quando si usa TFA),
la preparazione quotidiana dei reagenti (come avviene con
PBPB e iodio) e strumentazione addizionale (pompa) o
manutenzione del sistema.
Il KOBRA® CELL è collegato “on-line” tra la colonna HPLC e
il rivelatore.
Insilato di mais e di foraggi contaminati artificialmente con AFB1 (10 ng/g), AFG1 (6 ng/g),
AFB2 (2 ng/g) e AFG2 (2 ng/g) (M. Pascale, atti progetto SISPROLAT)
B1
B1
G1
G1
B2
G2
insilato di mais
graminacee
G2
B1
B1
G1
G1
B2
G2
B2
B2
G2
leguminose
erba medica
RECUPERI DI AFBs DA INSILATI DI MAIS
(M. Pascale, atti progetto SISPROLAT)
AFB1
AFG1
AFB2
AFG2
Cont.
(ng/g)
Rec.
(%)
Cont.
(ng/g)
Rec.
(%)
Cont.
(ng/g)
Rec.
(%)
Cont.
(ng/g)
Rec.
(%)
5
89
3
90
1
78
1
38
10
85
6
77
2
85
2
26
20
86
12
80
4
79
4
23
50
85
30
77
10
72
10
18
Deviazioni standard relative (n=3):
AFB1 <4%
AFG1 <7%
AFB2 <8%
AFG2 <14%
Limite di rivelabilità:
0.1 ng/g (AFB1, AFG1, AFB2, AFG2)
Metodi analitici:
ricerca aflatossine “in animal feed”
ELISA
METODO ELISA
Preparazione dei campioni
I campioni devono essere conservati in luogo fresco, al riparo dalla luce.
Cereali e mangimi
Triturare e miscelare accuratamente una quantità rappresentativa di
campione.
× in una provetta di vetro con tappo a vite pesare 2 grammi di campione
triturato
× aggiungere 10 ml di soluzione metanolo/acqua distillata (70/30) e
agitare per
10 minuti a temperatura ambiente (20-25 C / 68-77 F) con un agitatore
× filtrare l’intero estratto con un foglio di carta da filtro
× diluire 100 l di filtrato con 600 l di buffer di diluizione
× nel saggio utilizzare 50 l per ogni pozzetto
RIDASCREEN® Aflatoxin Total is a competitive enzyme immunoassay for the
quantitative analysis of aflatoxin residues in cereals and feed.
Format:
Microtiter plate with 96 wells (12 strips with 8
wells each)
Standards:
0 ppb (zero standard), 0.05 ppb, 0.15 ppb, 0.45
ppb, 1.35 ppb, 4.05 ppb
Sample
preparation:
cereals and feed: extraction, filtration and
dilution
Incubation time:
45 min
Detection limit:
cereals and feed: approx. 1.75 ppb
Cross-reactions:
Aflatoxin B1: 100 %
Aflatoxin B2: approx. 48 %
Aflatoxin G1: approx. 75%
Aflatoxin G2: approx. 18 %
RIDASCREEN® Aflatoxin B1 30/15 is a competitive enzyme immunoassay for the
quantitative analysis of aflatoxin B1 in cereals and feed.
Format:
Microtiter plate (12 strips with 8 removable wells
each)
Standards:
0 ppb (zero standard), 1 ppb, 5 ppb, 10 ppb, 20 ppb,
50 ppb
Sample
preparation:
grinding, extraction, filtration and dilution
Incubation time:
45 min
Detection limit:
1 ppb
Cross-reactions:
Aflatoxin B1: 100 %
Aflatoxin G1: approx. 29 %
Aflatoxin B2: approx. 13 %
Aflatoxin G2: approx. 3.2 %
Aflatoxin M1: approx. 1.5 %
Metodi analitici:
ricerca aflatossina M1 “in milk”
ELISA
Determinazione M1
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Centrifugare 100 ml di latte a temperatura ambiente
(10’ a 2500 rpm)
Eliminare lo strato di grasso e filtrare su Whatman N. 4
HPLC
ELISA
METODO HPLC PER IL DOSAGGIO DI AFM1
•Tecnica cromatografica HPLC
-Preparazione campione
-Separazione e dosaggio
IMMUNOAFFINITY CLEAN UP
METODO HPLC
IMMUNOAFFINITY CLEAN – UP
• Caricare 50 ml di latte su colonna ad immunoaffinità
(Afla M1
, VICAM, USA)
• Lavare la colonna ad immunoaffinità con 20 ml di acqua
(2 × 10 ml)
• Eluire con 2 ml di metanolo (2 × 1 ml)
• Portare a secco (con N2) e riprendere con 500 µL di
fase mobile (CH3CN:H2O, 25:75 v/v)
• Filtrare su filtro di nylon (0.45 µm), se necessario
• Colonna
C18 Symmetry (150 × 4.6
mm, 5µm)
• Fase mobile
acetonitrile:acqua (25:75)
Lavaggio colonna con CH3CN
• Flusso
1.0 mL/min
• Rivelatore
a fluorescenza (λ
λex.= 365
nm, λem.= 435 nm)
• Limite di rivelabilità
0.002 ng/mL
Norm.
100
FLD1 A, Ex=365, Em=435 (D:\HPLC\DATA\GIUSEPPE\AFLA\LATTE\CAMPISAS\27BM03.D)
PMP1, Solvent B
80
AFM1
60
13’
13’
10’
AFM1 10’
40
6.629
• Quantità iniettata:
100 µL (equivalente a 10
mL di latte)
1.194
ANALISI HPLC
20
0
0
0’
2.5
5
7.5
8’
10
12.5
15
17.5
20
22.5
15’
15’
Cromatogramma di un campione di latte di pecora
contaminato artificialmente con AFM1 (0.1 ng/ml)
min
25’
25’
METODI IMMUNOCHIMICI ELISA PER IL
DOSAGGIO DI AFM1
Anticorpi
policlonali
Std: 0-5-10-25-50-100-250 ppt
Range di rilevabilità: 5-250 ppt
Anticorpi
monoclonali
Std: 0-5-20-30-50-100 ppt
Range di rilevabilità: 5-100 ppt
RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15 is a competitive enzyme immunoassay for
the quantitative analysis of aflatoxin M1 in milk, milk powder and cheese.
Format:
Microtiter plate with 96 wells (12 strips with 8 wells
each)
Standards:
0 ppt, (zero standard), 5 ppt, 10 ppt, 20 ppt, 40 ppt,
80 ppt
Sample
preparation:
milk: degreasing
milk powder: reconstitution and degreasing
cheese: extraction and centrifugation
Incubation time:
approx. 1 h
Detection limit:
milk: 5 ppt
milk powder (refering to reconstituted milk): 5 ppt
milk powder (refering to g-weight): 50 ppt
cheese: 50 ppt
Cross-reactions:
Aflatoxin M1: 100 %
Aflatoxin M2: 30 %
esempio di protocollo ELISA
• Aggiungere 100 µl/pozzetto del campione di latte
• Incubare 60 min a temperatura ambiente
• Eliminare il liquido dai pozzetti e lavare con washing buffer (3x)
• Aggiungere 100 µl di coniugato
• Incubare 60 min a temperatura ambiente
• Eliminare il liquido dai pozzetti e lavare con washing buffer (3x)
• Aggiungere 50 µl di substrato e 50 µl di cromogeno e incubare
per 30 min
• Aggiungere 100 µl di stop solution
• Effettuare la misura a 450 nm
Curva di taratura
ELISA
(range 5-80 ppt)
Intervallo di linearità:
10-40 ppt
r= 0.9968
Cattaneo, Iametti, Atti progetto SISPROLAT
CONFRONTO ELISA-HPLC
LATTE BOVINO
250
y = 1,0892x + 0,2401
2
R = 0,9631
•I kit ELISA utilizzati, entrambi
rispondenti ai requisiti della norma UNI
EN ISO 14675, hanno fornito risultati
comparabili con i dati HPLC.
HPLC (ppt)
200
150
100
50
0
•Entrambi i test ELISA hanno dato esiti
soddisfacenti nel caso di matrici
liquide; migliori risultati sono stati
ottenuti con kit monoclonale
(maggiore selettività).
0
50
100
200
250
ELISA (ppt)
Osservazioni
Predizioni
Conf. sulla pred. (95.00%)
Conf. sulla media (95.00%)
Lineare (Osservazioni)
Laura Marinoni, tesi di Laurea Magistrale in Scienze e Tecnologie Alimentari, Università degli Studi di Milano 2008
150
Correlazione HPLC vs ELISA
(n=15 positivi)
LATTE OVINO
140
HPLC - AFM1 (ppt)
120
y = 0,8906x - 1,1557
r = 0,9937
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
ELISA - AFM1 (ppt)
Cattaneo, Iametti, Atti progetto SISPROLAT
100
120
140
Performances dei metodi HPLC ed ELISA
LATTE OVINO
HPLC
Limite di
quantificazione:
Recuperi
HPLC 25-500 ppt
ELISA 15-60 ppt
Tempo/40 analisi
Cattaneo, Iametti, Pascale Atti progetto SISPROLAT
ELISA
3 ppt
10 ppt
>84%
>88%
(CV <6%)
(CV <16%)
2-3 giorni
4-5 ore
FATTORI CHE INFLUISCONO SULLA PRECISIONE E
SULL’ACCURATEZZA DEI RISULTATI:
-criticità delle procedure di estrazione e purificazione
-ampiezza dell’intervallo di linearità
- selettività del test, in funzione del tipo di anticorpi
utilizzati
Un metodo rapido potrebbe essere
utile…
…almeno per individuare quali campioni
debbano essere sottoposti ad un’analisi
quantitativa (costosa e time consuming)
DEFINIZIONE
Un Naso Elettronico è “uno strumento che comprende una
serie di sensori chimici non specifici e un sistema di pattern
recognition in grado di riconoscere odori semplici e
complessi” (Gardner and Bartlett, 1994. Sensors and Actuators B, 18,
221).
Applied Sensor’s 3320 Analyser
http://www.appliedsensor.com
Il naso elettronico è in grado di “sentire” AFM1?
- tests preliminari: YES
Il naso elettronico è in grado di sentire “real” AFM1 o il prodotto (i)
derivanti dal metabolismo dell’animale connesso con la presenza di
aflatossine?
-il naso
-il naso
-il naso
mangimi
“sente” AFM1-aggiunta in una soluzione tampone
“sente” AFM1-aggiunta nel latte
“sente” AFM1-presente in latte da animali alimentati con
contaminati
AFM1-spiked milk
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Milk
Milk+5ppt
Milk+10ppt
Milk+20ppt
S. Benedetti, S. Iametti, F. Bonomi, S. Mannino. J. Food. Protection (2005) 68, 1089–1092.
Milk+40ppt
Milk+80ppt
PCA score plot for the “nose” data obtained from
ewe’s milk
S. Benedetti, S. Iametti, F. Bonomi, S. Mannino. J. Food. Protection (2005) 68, 1089–1092.
7
6
6
2
5
PC2 (35.5%)
4
1
3
27 25
12
9
1
17
8
10
13
18 1916
23
24
15
11
21
20
22
28
14
29
-4
-2
3
PC1 (45.0%)
26
30
8
Linear Discriminant Analysis
of the “nose” data
Assigned group
AFM1Group
AFM1Actual Group
contaminated
size
free milk
milk
AFM124
24
0
contaminated
(100%)
(0%)
AFM1-free
6
0
6
(0%)
(100%)
Predicted group
AFM124
24
0
contaminated
(100%)
(0%)
AFM1-free
6
0
6
(0%)
(100%)
Latte ovino e derivati
Barbiroli, Bonomi, Benedetti, Mannino,
Monti, Cattaneo, Iametti 2007, J.
Dairy Sci. 90, 532-540
LATTE OVINO E DERIVATI
Barbiroli, Bonomi, Benedetti, Mannino, Monti, Cattaneo, Iametti
2007, J. Dairy Sci. 90, 532-540
PREVENZIONE E DETOSSIFICAZIONE - Stefania Iametti
Lodi, 12 aprile 2011

METODOLOGIE DI CONTROLLO LUNGO LA FILIERA

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