Presentazione di PowerPoint - Laboratorio di Microbiologia e

Antibiogramma e nuovi criteri
interpretativi EUCAST
Lettura interpretativa
dell’Antibiogramma: Esercitazioni
Paolina Cavalcanti
Il ruolo del laboratorio di Microbiologia
DIAGNOSI MICROBIOLOGICA
 identificazione agente eziologico e ATB
 tempestività dei risultati
PROGRAMMI DI CONTROLLO DELLE INFEZIONI
 epidemiologia locale
 sorveglianza: “alert organisms”
ANTIBIOGRAMMA
ANTIBIOGRAMMA
L'antibiogramma è un test “in vitro” che si esegue
esponendo una concentrazione standard
dell’agente etiologico in esame ad una serie di
concentrazioni scalari e definite di farmaci
impostazione di un’antibioticoterapia
mirata
Antibiogramma: Metodi

APPROCCI FENOTIPICI
basati su attività antimicrobica e breakpoint
• Determinazione della MIC (brodo, agar, Etest, MICE)
• Altre determinazioni quantitative (MBC, MPC)
• Diffusione da dischetto (EUCAST, CLSI, BSAC, CA-SFM, ...)
• Sistemi automatici (Vitek, Phoenix, MicroScan, Wider, ...)

APPROCCI GENOTIPICI
basati sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto
•
•
•
•
•
•

mecA
blaZ
vanA
vanB,
PBP2a
β-lattamasi
APPROCCI DEDUTTIVI
lettura interpretativa (expert rules)
• Se mecA-positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Stafilococchi)
• Se ESBL- positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Enterobacteriaceae)
• Se eritromicino resistente, riportare come resistente anche a claritromicina e azitromicina ( Streptococchi)
CAMPIONE BIOLOGICO
SEMINA
IDENTIFICAZIONE MACROSCOPICA
PRESUNTIVA DELL’ AGENTE ETIOLOGICO
E SUO ISOLAMENTO
Esame della purezza delle colonie
Luce Riflessa
Luce trasmessa
TEST DI DISCO DIFFUSIONE SU AGAR
Seleziona le colonie
Prepara l’inoculo
Vortex
Standardizza l’inoculo
Striscia sulla piastra
Immergi il tampone
Incuba overnight
Addiziona i dischi antibiotati
Misura gli aloni
Luce trasmessa
Luce riflessa
Modifica del terreno –
germi fastidious
CONCENTRAZIONE MINIMA INIBENTE (MIC)
La più bassa concentrazione di antibiotico capace di inibire la crescita
microbica dopo 18-24 h
diluizione in brodo
0.012
0.5
1
2
4
8
16
32
64
g/ml
Microdiluizione
Prepara l’inoculo
Standardizza l’inoculo e mescola
Disponi la sospensione
nel supporto e inocula
Incuba overnight
Lettura MICs
Lettura MICs
MIC su striscie
blottate (gradiente
di concentrazione)
Sistemi automatici
vitek2
phoenix
MIC
Il cardine di tutti i saggi di sensibilità
Endpoint
 Valore determinato in laboratorio
 Valore assoluto riferito a quel particolare microrganismo
 Standardizzazione : adempimenti tecnici e procedurali
 Alla base della determinazione dei breakpoint
Breakpoint
 Valori prestabiliti, stabiliti cioè da appositi comitati
nazionali o sovranazionali
 Valori soglia di riferimento che danno un significato
all’endpoint
 Standardizzazione : criteri interpretativi
EUCAST
EUCAST: basi per la determinazione dei breakpoint
Il processo che porta a fissare i breakpoint è un
compromesso
tra aspetti clinici, epidemiologici e metodologici
EUCAST
breakpoint clinici e cut-off epidemiologici
EUCAST riconosce e distingue due tipi di breakpoint:
 breakpoint clinici
Per prevedere un esito migliore (sensibile) o peggiore (resistente)
del trattamento di una data infezione con un dato antibiotico.
Usati nell’attività quotidiana del laboratorio di microbiologia clinica per fornire
informazioni utili ai fini della terapia.
 cut-off epidemiologici
per riconoscere precocemente lo sviluppo di una resistenza.
Devono essere usati come la misura più sensibile dello sviluppo di una resistenza.
Epidemiologic cut-off = ECOFF
EUCAST : categorie in base ai breakpoint clinici
Sensibile (S)
Il livello di attività dell’antibiotico nei confronti del microrganismo
è associato ad un’elevata probabilità di successo terapeutico
Intermedio (I)
Il livello di attività dell’antibiotico nei confronti del microrganismo è
associato ad un effetto terapeutico incerto
Non
è
escluso
che
l’infezione
possa
essere
trattata
appropriatamente in distretti corporei in cui il farmaco è
attivamente concentrato o utilizzando alti dosaggi
La categoria intermedia rappresenta anche una zona cuscinetto che
potrebbe evitare che modesti ma difficilmente controllabili fattori
tecnici possano causare importanti discrepanze interpretative
Resistente (R)
Il livello di attività dell’antibiotico nei confronti del microrganismo
è associato ad un’elevata probabilità di fallimento terapeutico
EUCAST : categorie in base ai cut-off epidemiologici
Wild-type (WT)
Un microrganismo che non ha acquisito meccanismi di
resistenza all’antibiotico in questione.
Un microrganismo wild-type può rispondere clinicamente oppure
no al trattamento con quell’antibiotico
Non-wild-type (NWT)
(Resistenza microbiologica)
Un microrganismo che ha acquisito meccanismi di
resistenza all’antibiotico in questione.
Un microrganismo non-wild-type può rispondere clinicamente
oppure no al trattamento con quell’antibiotico.
EUCAST : 2 breakpoint clinici, 1 cut-off epidemiologico
breakpoint clinici (sistema SIR):
Breakpoint della sensibilità
divide i ceppi sensibili (S) da quelli intermedi (I)
Breakpoint della resistenza
divide i ceppi intermedi (I) da quelli resistenti (R)
cut-off epidemiologico:
divide i ceppi wild-type (WT) da quelli non-wild-type (NWT)
Cut-off epidemiologici e breakpoint clinici,
sensibilità e resistenza
Numero
di isolati
Cut-off
epidemiologico
Breakpoint
clinici
S
R
WT
NWT
MIC
S
Concentrazioni di antibiotico
raggiungibili nei tessuti
I
R
REGOLA BASE IN CHEMIOTERAPIA
CONCENTRAZIONE PLASMATICA
> MIC
Successo quasi certo
= MIC
Risultato incerto
< MIC
Probabile fallimento
COFATTORI DI EFFICACIA DI
UNA TERAPIA ANTIBATTERICA
MICROBIOLOGICI
Sensibilita’
Intermedio
FARMACOLOGICI
Resistenza
Adeguati
Probabilmente adeguati
Inadeguati
IMMUNOCOMPETENZA
Normale
Parzialmente compromessa
Compromessa
Il “puzzle” della (appropriata) terapia antibiotica
Pea & Viale Clin Infect Dis 2006; 42: 1764-71.
Un poster della seconda guerra mondiale
Classificazione degli antibiotici sulla base della solubilità e
delle proprietà farmacocinetiche / farmacodinamiche
Antibiotici idrofili
Antibiotici lipofili
 Macrolidi
 Fluorochinoloni
 Tetracicline
 Caf
 Rifampicina
 Linezolid
 Beta lattamici
 Glicopeptidi
 Aminoglicosidi
Limitato volume di distribuzione
Incapacità a diffondere passivamente attraverso
la membrana cellulare delle cellule eucariotiche
Inattivi sui patogeni intracellulari
Eliminazione renale come farmaco non modificato
Largo volume di distribuzione
Diffondono liberamente attraverso
la membrana cellulare delle cellule eucariotiche
Attivi sui patogeni intracellulari
 Spesso eliminati mediante metabolismo epatico
mod. Pea & Viale Clin Infect Dis 2006; 42: 1764-71.
Attività degli antibiotici
Tempo dipendenti
Concentrazione-dipendenti
Correlazione PK/PD
T > MIC
AUC / MIC
Cmax / MIC
Mazzei T., 2004
T>MIC – Il tempo durante il
quale le concentrazioni
plasmatiche si mantengono
al di sopra della MIC del
patogeno
AUC/MIC – Progressivo
incremento di attività
antibatterica all’aumentare
della concentrazione
dell’antibiotico
POSOLOGIA ANTIMICROBICI
EFFETTO
TEMPO - DIPENDENTE
(es. beta LATTAMICI)
SOMMINISTRAZIONE CONTINUA
O A BREVI INTERVALLI
EFFETTO
CONCENTRAZIONE - DIPENDENTE
(es. AMINOGLICOSIDI)
ALTE DOSI
A LUNGHI INTERVALLI
Penetration of different β-lactam antibiotics into
Epithelial lining fluid (ELF)
Reference
Protein
binding (%)
Cefepime
30
20
Ceftazidime
31
20
20
Ertapenem
32
90
30
Ceftobiprole
33
18
15–26
Piperacillin
36
20
∼57
Tazobactam
36
25
∼91
Agent
Penetration
(%)
104
2013 British Society for Antimicrobial Chemotherapy
ARBITRARY INTERPRETIVE CRITERIA
FOR ANTIBIOTIC COMBINATIONS
Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC Index)
FIC Index= MICAB/MICA + MICBA/ MICB
FIC Index
Interpretation
≤ 0.5
Synergy
> 0.5 and ≤ 1.0
Additative
> 1 and ≤ 4.0
Indifference
> 4.0
Antagonism
Pseudomonas aeruginosa
FIC Index = 0.28
Amikacina R
128 µg/ml
Cefepime R
16 µg/ml
Amikacina +
Cefepime 4µg/ml
SVILUPPO DELLA RESISTENZA
La pressione selettiva
DEVELOPMENT OF RESISTANCE:
Food
Food is also a source of infection that could affect the development of resistance.
- More meals are prepared outside the home.
- Contamination goes unnoticed until infection has
started.
Outbreaks of Escherichia coli O157 in spinach and
lettuce in the US.
- As the number of foodborne infections increases,
so does the use of antibiotics.
USO APPROPRIATO DI ANTIBIOTICI
NELLA PRODUZIONE DEL CIBO PER
ANIMALI
Antibiotic resistance can pass from animals
to humans (CDC 2006)
Antibiotic resistance is increasing in human
and veterinary medicine
Antibiotic Resistance
A Global Problem
PRP
VISA
VRE
MRSA
ESBL
1961
1967
1983
All β-lactams
Penicillin
3rd gen.
Cephalosporin
MBL
1986
1988
Vancomycin
Carbapenem
VRSA
1996
2002
Vancomycin
and teicoplanin
Vancomycin
and Teicoplanin
Gram-negativi
Evoluzione dell’antibioticoresistenza
Enterobacteriaceae ESBL
caratteristiche
alto grado di Resistenza
Amoxicillina
Ampicillina
Piperacillina
Azlocillina
Ticarcillina
Cefalotina (Cefalosporine I-II gen.)
Clavulanato
Sulbactam
Tazobactam
Sensibilità
inibiscono le ESBL
Cefotaxime
Ceftriaxone
Ceftazidime
Cefepime
Aztreonam
Ridotta Sensibilità
CEFAMICINE: Cefoxitina, Cefotetan e
Moxalactam
CARBAPENEMI: Imipenem, Meropenem
Sensibilità
Non sono idrolizzati da ESBL
Β lattamasi
classificazione
CARBAPENEMASI (CPE)
resistenza
Penicilline
Cefalosporine
Inibitori β lattamasi
Carbapenemi
Il 2010: il problema “emergente” si complica
Klebsiella pneumoniae NDM-I
(New Dehli Metallo B-lattamasi tipo I)
 Enzima capace di trasferirsi con estrema facilità ad diversi generi di microorganismi
 l plasmide NDM-I è stato isolato in E.coli e K.pneumoniae in USA, Canada, Europa,
India e Pakistan
 Efficaci solo Colistina e Tigeciclina
Lancet Infect Dis. 2009 Apr;9(4):228-36.
The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria.
Nordmann P, Cuzon G, Naas T.
J Infect Dev Ctries. 2012 May 14;6(5):457-61.
Detection of carbapenem-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
producing NDM-1 in Lebanon.
El-Herte RI, Araj GF, Matar GM, Baroud M, Kanafani ZA, Kanj SS.
Gram-positivi
Evoluzione dell’antibioticoresistenza
Cocchi Gram-positivi
Evoluzione dell’antibioticoresistenza
Penicillina
S. aureus
[1940s]
Meticillina
S. aureus
penicillino-resistente
[1960s]
S. aureus (MRSA)
meticillino-resistente
Vancomicina
[1960s]
S. aureus (VRSA)
resistente
alla vancomicina
2002
S. aureus (VISA/GISA)
intermedio o resistente
a vancomicina/glicopeptidi
1997
CDC, Prevent Antimicrobial Resistance, Aprile 2002
Enterococco (VRE)
resistente
alla vancomicina
1986
Come si identificano?
K.pneumoniae, E.coli, P.mirabilis, K.oxytoca ESBL +
Test di screening e di conferma ai fini epidemiologici per la valutazione della presenza di ESBL
K.pneumoniae, E.coli, P.mirabilis, K.oxitoca
Ceftazidime
e/o
Cefotaxime
MIC
≥ 2mg/L
no
si
Screening positivo
per la produzione di
ESBL
test di conferma
ESBL -
Produzione di Carbapenemasi nelle Enterobacteriaceae
Test di screening e di conferma ai fini epidemiologici della presenza di
carbapenemasi
AMCLI, Marzo 2012
Indicazioni per la conferma fenotipica della produzione di carbapenemasi
nelle Enterobacteriaceae
Screening positivo
Meropenem ≥ 0.5 mg/L o diametro alone di inibizione ≤ 25 mm
test di conferma
test di conferma
Test di sinergia con EDTA
Test di sinergia con Ac Boronico
EDTA –
Ac.BOR +
K. pneumoniae KPC+
K.pneumoniae MBL+
Test di Hodge
E.coli ATCC 25922
Alone di
inibizione
Alone di inibizione
modificato evidenzia solo la
presenza di attivita’ carbapenemasica
(es. OXA-48)
Staphyococcus aureus hVISA e VISA
VSSA
VISA
hVISA
VSSA
VSSA
VISA
Esempi di cambiamento nella morfologia delle colonie che si ha nei ceppi
hVISA , VISA , VSSA
Nota A:
• breakpoint per vancomicina è stato portato a 2 mg/L
• il test di diffusione da disco non è raccomandato
Cosa si nasconde dietro una MIC
compresa tra 1 e 2 mg/L?
hVISA
Etest vancomicina
Antibiogramma: Metodi

APPROCCI FENOTIPICI
basati su attività antimicrobica e breakpoint
• Determinazione della MIC (brodo, agar, Etest, MICE)
• Altre determinazioni quantitative (MBC, MPC)
• Diffusione da dischetto (EUCAST, CLSI, BSAC, CA-SFM, ...)
• Sistemi automatici (Vitek, Phoenix, MicroScan, Wider, ...)

APPROCCI GENOTIPICI
basati sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto
•
•
•
•
•
•

mecA
blaZ
vanA
vanB,
PBP2a
β-lattamasi
APPROCCI DEDUTTIVI
lettura interpretativa (expert rules)
• Se mecA-positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Stafilococchi)
• Se ESBL- positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Enterobacteriaceae)
• Se eritromicino resistente, riportare come resistente anche a claritromicina e azitromicina ( Streptococchi)
EUCAST
Expert rules
Sono una raccolta di conoscenze di esperti su:
 resistenze intrinseche
 fenotipi eccezionali di resistenza
 regole interpretative
che possono essere applicate ai tests antimicrobici per ridurre gli errori
e seguire appropriate raccomandazioni per refertare particolari tipi di
resistenza.
Resistenza intrinseca
è una resistenza connaturata, non acquisita, di
tutti o quasi tutti i rappresentanti della specie
Resistenza intrinseca
Numero
di isolati
Specie intrinsecamente resistenti
(tutti i ceppi della specie sono
resistenti agll’antibiotico)
MIC
Concentrazioni di antibiotico
raggiungibili nei tessuti
Enterobacteriaceae: resistenza intrinseca
Resistenze intrinseche nei batteri Gram-positivi
Nota bene:
i batteri Gram-positivi sono intrinsecamente resistenti ad aztreonam, temocillina,
polimixina B/colistina ed acido nalidixico
Gli stafilococchi sono intrinsecamente resistenti al ceftazidime
Fenotipi eccezionali di resistenza
Potrebbero indicare un errore nella identificazione o nella esecuzione
dei test di chemiosensibilità.
Se entrambi sono confermati, bisognerebbe inviare l’isolato ad un
laboratorio di riferimento.
Tali fenotipi di resistenza possono cambiare con il tempo e variano in
relazione a differenze geografiche
Fenotipi eccezionali di resistenza
REGOLE INTERPRETATIVE
Sulla base della resistenza ad un particolare antibiotico e alla
identificazione di un isolato è possibile dedurre un meccanismo di
resistenza e predire la resistenza ad un altro antibiotico.
L’evidenza e il significato clinico di queste regole hanno gradi diversi:
A. Esistono evidenze cliniche che correlano la interpretazione di
sensibilità al fallimento clinico.
B. Evidenza debole e basata su pochi casi o su modelli sperimentali.
C. Evidenza clinica inesistente, ma i dati microbiologici suggeriscono
che l’uso clinico del farmaco deve essere sconsigliato.
REGOLE INTERPRETATIVE
EUCAST rule 13.6 (Salmonella spp.)
IF ciprofloxacin MIC is >0.06 mg/L,
THEN
report as resistant to all fluoroquinolones
Evidence for clinical failure of fluoroquinolones in cases of resistance
caused by the acquisition of at least one target mutation in gyrA
Evidence for this rule is A only for S.Typhi (B for other salmonella)
REGOLE INTERPRETATIVE
EUCAST rule 11.3 (Streptococcus spp.)
IF resistant to erythromycin but susceptible to clindamycin,
THEN
Test for inducible MLSB resistance.
If positive, report as susceptible to clindamycin with a warning that
resistance may develop during treatment
Evidence for this rule is C
Conoscendo l’agente etiologico
Dalla valutazione
delle resistenze intrinseche, dei fenotipi eccezionali e
con l’ausilio delle regole interpretative
è possibile
intraprendere una terapia antibiotica razionale
AZIENDA OSPEDALIERA DI COSENZA
U.O.C. di Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare
Direttore Dr. Cristina Giraldi
Paziente XXXXXXXXXXX
data di nascita XXXXXXXXX
Richiesta n° XXXXXXXXXXX
del XXXXXXXXXXXXXXXXXX
URINOCOLTURA
Urine da mitto intermedio
Ricerca di:
germi non esigenti
-1- Escherichia coli
MIC
100.000 UFC /mL
Antibiogramma
RSI
Break Point MIC (SENS)
ESBL
-
AMPICILLINA
R
>32
8
AMOXIC/AC. CLAV
S
8
8
PIPERACILLINA
R
>64
8
CEFOTAXIME
S
<=1
1
GENTAMICINA
S
<=1
2
NITROFURANTOINA
S
4
NORFOLXACINA
S
<=0,5
0,5
CIPROFOLXACINA
S
<=0,5
0,5
AMIKACINA
S
<=2
8
CEFTAZIDIME
S
1
2
IMIPENEM
S
0,5
2
CEFEPIME
S
<=1
1
TRIMETHO/SULFAM
R
>320
40
64
Legenda
RSI= Resistente Sensibile Intermedio
MIC= Concentrazione Minima Inibente (g/ml)
Break-point MIC SENS = Limite di sensibilità (g/ml)
Dal 3 ottobre 2011 l’interpretazione dell’antibiogramma segue I criteri dell’European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)
Conseguenze dell’antibiotico-resistenza
Gli antibiotici sono essenziali per la medicina moderna …
Chirurgia
Trapianti d’organo
Chemioterapia oncologica
Terapia intensiva
Cura dei neonati pretermine
Fonte: Prof. Otto Cars, Director of Strama (The Swedish Strategic Programme Against Antibiotic Resistance)
82
grazie
Grazie