D.Daffonchio

- GRIFA - Dottorato in Chimica, Biochimica ed Ecologia dei Fitofarmaci - Marie Curie Training Site - PEACE - Università Politecnica delle Marche - Facoltà di Agraria - Università Cattolica del Sacro Cuore - Formazione Permanente -
SCUOLA ESTIVA - FITOFARMACI E AMBIENTE 2003
Valutazione del rischio delle piante GM: effetti sulla
biodiversità microbica e valutazione del trasferimento
genico orizzontale ai microrganismi
Daniele Daffonchio
DISTAM, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche
via Celoria 2, 20133, Milano
e-mail: [email protected]
Nel 1986 sono stati effettuati i primi trial sperimentali in ambienti aperti con
piante modificate geneticamente (GMP)
Da allora sono stati condotti più di 15000 esperimenti in campo con diverse GMP
tra cui:
•GMP resistenti ad erbicidi
•GMP autoprotette da insetti parassiti
VANTAGGI
•GMP resistenti a batteri patogeni
•GMP resistenti a virus
•maggiori rese
•meno micotossine
•miglior prodotto •meno antiparassitari
Quale è l’impatto delle GMP sull’uomo e sull’ambiente?
RISCHI
•allergie
•Resistenza insetti
•impatto biodiversità •HGT
•Tipologie di GMP resistenti ad erbicidi ed autoprotette
•Le GMP influenzano la
struttura e la funzionalità delle
comunità microbiche
nell’ambiente?
•I transgeni possono essere
trasferiti dalle GMP ai
microrganismi nei sistemi
ambientali complessi?
QUALI SONO I RISCHI DI
IMPATTO AMBIENTALE?
• Case studies: mais, colza, erba
medica, patata
• Considerazioni ambientali
• Metodi di studio HGT
• Case studies: barbabietola nptII,
tabacco transplastomico aadA
• Considerazioni ambientali
CONSIDERAZIONI FINALI
GMP RESISTENTI AD ERBICIDI
ED AUTOPROTETTE
COSTRUZIONE E TIPI DI GMP
DNA donatore: Costrutto transgenico in E. coli
-Transgene; -Promotore eucariota; -Terminatore eucariota; -Enhancers, ecc.;
-Marcatori di selezione; -Sistemi di autoexcisione markers
Tessuto vegetale
ricevente
Trasformazione mediante:
•Agrobacterium tumefaciens
•Particle gun
GMP “nucleari”
Trasformazione mediante:
•Particle gun
•Iniezioni con femtosiringhe
GMP “transplastomiche”
SOIA RESISTENTE AL
GLYPHOSATE
Considerata la
possibilità di HGT
di geni di
resistenza ad
antibiotici, la
tendenza è di
eliminarli dai
costrutti. Ad
esempio nel caso
della soia
resistente al
glyphosate
prodotta dalla
Monsanto il gene
nptII per la
resistenza alla
kanamicina non è
presente nel
costrutto finale.
nptII
Plasmide
PV-GMGT04
Transgene nella linea
40-3-2 di soia
DNA soia
MAIS Bt AUTOPROTETTO CONTRO Ostrinia nubilalis
B. thuringiensis subsp. thuringiensis berliner 1715
Il mais Bt è autoprotetto da
Ostrinia nubilalis grazie al
clonaggio nel suo genoma
del gene cry1Ab del batterio
Bacillus thuringiensis
Spora
Cristallo insetticida
Membrana
Recettore
B. thuringiensis forma un
cristallo parasporale proteico
la tossina Cry tossica per
molte specie di insetti.
L’attività
insetticida
è
principalmente dovuta al
cristallo parasporale proteico
che si accumula fino al 25%
del peso secco della cellula.
MAIS Bt AUTOPROTETTO
CONTRO Ostrinia nubilalis
Rilevamento
mediante PCR dei
transgeni del mais
Bt 176 autoprotetto
da Ostrinia
nubilalis
MAIS Bt AUTOPROTETTO CONTRO Ostrinia nubilalis
Ragione
bassa
espressione:
instabilità mRNA a causa di:
•molti poliA e segnali di taglio
mRNA.
•segnali
prematuri
di
terminazione di trascrizione.
•Strutture secondarie
•sequenze di splicing
•i geni cry ricchi in A/T
•differenze di ‘codon usage’
Modifica della sequenza per
mutagenesi o sintesi chimica ha
aumentato di circa 100 volte i
livelli di espressione (250-2000
ng/mg proteine).
Ulteriori miglioramenti attraverso
clonaggio dei geni cry nei plastidi
senza significative modifiche
della sequenza (espressione fino a
50000 ng/mg di proteina).
+ bla (amp)
PATATA T4
La patata T4 rilascia nella rizosfera il lisozima del fago T4 e quindi migliora il
controllo di batteri fitopatogeni come Erwinia carotovora
Promotore
Cassetta NptII
(KanR)
Peptide segnale αamilasi di orzo:
35S CaMV
Terminatore
Lisozima T4
Nos 3’
secrezione apoplasto
E’ stato messo a punto un metodo
per misurare il tasso di morte dei
batteri esposti alle radici della patata
T4
Il saggio si basa sulla colorazione
differenziale tra cellule vive e morte
PATATA T4
Il numero di cellule batteriche morte sulla
superficie radicale della patata T4 è molto
maggiore di quello sulla Patata wild type
Tale differenza si manifesta in tutte le fasi
della crescita della pianta
INDUZIONE DI RESISTENZE?
INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING
Molti microrganismi attivano alcune vie metaboliche inclusi alcuni meccanismi di
patogenesi solo quando sono in concentrazione elevata nel sistema e superano un
certo numero di cellule per unità di volume o superficie
Questo meccanismo denominato “Quorum sensing” è mediato nei batteri gram- da
alcune molecole segnale sintetizzate in piccole concentrazioni da ciascuna cellula
della popolazione: gli acyl-homoserin lattoni (AHL)
N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone
AHL
Ad es. in Erwinia carotovora pv.
carotovora l’espressione delle
pectinasi che iniziano il processo
di patogenesi è mediato dagli
AHL
INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING
Alcuni microrganismi
come molti Bacillus
thuringiensis sono in
grado di produrre
enzimi le AHLlattonasi che
inattivano gli AHL
permettendo la
distruzione dei segnali
chimici che mediano
la patogenesi
Test con
Chromobacterium
violaceum
INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING
Ceppi di Erwinia carotovora clonati
Biosaggio per misurare l’attività di
con un’AHL-lattonasi perdono la
degradazione degli AHL in E.coli
virulenza rispetto ai ceppi wild type
ricombinante clonato con un’AHL-lattonasi
INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING
Sono state costruite GMP
(tabacco e patata) clonate
con AHL-lattonasi per essere
autoprotette nei confronti di
patogeni batterici.
L’espressione di aiiA
veniva rilevata in tutti i
costrutti soprattutto in
quelli con il peptide
segnale
INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSING
Le GMP (tabacco e patata) clonate con AHL-lattonasi sono molto resistenti ad
Erwinia carotovora anche quando inoculata a livelli massicci.
Tabacco aiiA
iiA
Pat
ate
a
Wi
ld T
ype
Wild Type
La strategia di inibizione dei meccanismi di “Quorum sensing” dovrebbe
stimolare in maniera minore lo sviluppo di resistenti in quanto il patogeno non è
eliminato ma solo inibito in una sua attività
•Le GMP influenzano la
struttura e la funzionalità delle
comunità microbiche
nell’ambiente?
•I transgeni possono essere
trasferiti dalle GMP ai
microrganismi nei sistemi
ambientali complessi?
QUALI SONO I RISCHI DI
IMPATTO AMBIENTALE?
• Case studies: mais, colza, erba
medica, patata
• Metodi di studio HGT
• Case studies: barbabietola nptII,
tabacco transplastomico aadA
GMP E BIODIVERSITA’
MICRORGANISMI
MAIS BT
Transgeni nel mais Bt:
•Cry1Ab: attività insetticida
•Bar: resistenza gluphosinate
• blaTEM1: resistenza ampicillina
Cry1Ab è espressa nei tessuti verdi fino a 4.000 ng/mg di proteine
Koziel et al., 1993 Bio/Technology, 11:194-200
?
Cry1Ab è rilasciata negli essudati radicali e può persistere nel suolo
Saxena et al., 1999 Nature, 402:480;
Saxena and Stotzky 2000, FEMS Microbiol. Ecol. 33:35-39
Il mais Bt ha un maggiore contenuto di lignina rispetto all’isogenico non Bt
Saxena and Stotzky 2001, Am. J. Bot. 88:1704-1706
I residui di mais Bt sono meno degradabili in suolo
Stotzky 2003 ESF-AIGM 30
MAIS BT E DIVERSITA’ MICROBICA
INSECT GUT
PHYTOSPHERE
ENSILED
CORN
MAIZE SILAGE
FERMENTED FLOUR
RHIZOSPHERE
COW RUMEN
La diversa composizione dei tessuti e degli essudati può influenzare la
struttura della comunità microbica?
RIZOSFERA
RIZOSFERA MAIS BT
•Cariche batteriche
•Profili catabolici comunità
•Tipizzazione molecolare batteri isolati
Suolo
NO DIFFERENZE SIGNIFICATIVE
Bt
Par
PC3 = 5.6%
•Analisi
struttura della comunità
microbica
totale
mediante
ARISA
PC1 = 42.6%
PC2 = 9.4%
DIFFERENZE SIGNIFICATIVE
La comunità batterica rizosferica del mais Bt è diversa da quella della controparte non transgenica
Le differenze sembrano essere in parte imputabili al pattern di essudazione
MAIS INSILATO
INSILATO MAIS BT
•Cariche batteriche
•Tipizzazione molecolare LAB isolati
NO DIFFERENZE SIGNIFICATIVE
•ARISA ed LH-PCR evidenziano comunità batteriche differenti tra insilati
preparati con mais Bt e il parentale
Bt
Par
•ARISA fingerprinting
•LH-PCR fingerprinting
B7
I7
I20
B0
B20
PC3 = 9.0 %
I13
B30
B2B7
B13
B20
I13
I30 I20
I7
I2 Iso I0
Bt
I30
PC3
(5.3 %)
I0
I2
PC2 (3
4.7 %)
B0
(47
1
PC
.
)
6%
B30
B2
PC1 = B13
36.7 %
=1
PC2
4. 8 %
MAIS INSILATO: LH-PCR DELLA COMUNITA’ BATTERICA
250
2000
275
300
325
350
375
400
425
0d
1000
0
2000
2d
LH-PCR della comunità
batterica totale e
sovrapposizione con i
LABisolati
Par mais
Bt mais
Enterobacter sp.
1000
Bacillus megaterium
0
2000
7d
Bacillus coagulans
Lactobacillus brevis
W. confusa or P. acidilactici
1000
W. confusa or P. pentosaceus
0
2000
13 d
W. confusa or L. fermentum
Enterococcus faecium
1000
0
2000
20 d
1000
0
2000
1000
0
30 d
L’LH-PCR mostra
la successione dei
LAB
Seguiti da
Enterobacter e
Bacillus
RUMINE BOVINO
RISA DELLE POPOLAZIONI BATTERICHE RUMINALI
At0
At1 At2
At2 Bt0 Bt1 Bt2
Ct0 Ct1
Bt2 Ct0 Ct2 Dt0
Dt0 Dt1 Dt2
•Quattro bovine di razza frisona in asciutta alimetate con mais
insilato Bt e Parentale non transgenico
•Contenuto ruminale analizzato mediante RISA
DIFFERENZE TRA LE DIETE DIETE E TRA GLI ANIMALI
DIETE
Campioni
dall’animale che ha
subito dislocazione
dell’abomaso
ANIMALI
A
B
C
No differenze tra
le diete
Bt
Iso
Differenze tra gli
animali
•L’analisi statistica dei profili RISA della microflora adesa
all’alimento digerito differenzia la microflora batterica nei diversi
animali ma non differenzia le diete
D
POPOLAZIONE BATTERICA IN OGNI ANIMALE
Mais
Bt
Iso
L’analisi cluster dei profili RISA della microflora adesa all’alimento digerito in
ciascun animale differenzia le popolazioni selezionate dalle due diete
In tutti gli ambienti analizzati il mais transgenico Bt
seleziona popolazioni batteriche diverse rispetto alla
controparte non transgenica
Risultati simili sono stati osservati con altre GMP come
colza resistemte al glufosinate e erba medica che produce
una lignino perossidasi Mn-dipendente fungina
Di Giovanni et al., 2000 Microb.Ecol. 37:129-139
Profili DGGE rRNA 16S rizosfera COLZA
Profili catabolici isolati rizosfera ERBA MEDICA
Rimane comunque da stabilire se queste differenze sono determinate
dall’”effetto transgene” piuttosto che dall’”effetto cultivar”
I fattori ambientali (cultivar, suolo,
stagione, ecc.) influenzano la
composizione della comunità batterica
rizosferica della patata più del lisozima del
fago T4 prodotto dalle varianti
transgeniche
Heuer et al., 2002 AEM 68:1325-1335
HGT GMP-MICRORGANISMI
INTERAZIONI GMP E MICRORGANISMI
RILEVANZA HGT
•Antibiotico resistenza
• Resistenza erbicidi
•Modello di studio speciazione e
barriere evolutive
PRESUNTI HGT INTERDOMINIO
•Es. Glutamina sintetasi II di
Bradirhizobium japonicum sembra
derivare da un eucariota
(Carlson e Chelm 1986. Nature 322:568-570)
COME SI STUDIA?
Il processo più probabile di HGT tra GMP
e batteri è la trasformazione naturale
HGT tra GMP e batteri dimostrato per i
geni nptII (KanR) e aadA (SpeR)
MARKER RESCUE TRANSFORMATION
(Gebhard and Smalla, 1998; De Vries and Wackernagel, 1998; Nielsen et al., 2000)
GMP
Trasformazione naturale e
ricombinazione omologa
La ricombinazione omologa tra un
gene selezionabile presente nella
GMP e una sequenza ricevente
inattiva presente nel microrganismo
permette di rilevare l’evento di HGT
e stabilirne le frequenze
BATTERI
NATURALMENTE
COMPETENTI
•Acinetobacter naturalmente competente
• npt II gene
• ∆npt II
HGT da GMP
“nucleari”
HGT da GMP
“transplastomiche”
HGT da GMP
“transplastomiche”
in residuosfera
COSTRUTTO
BARBABIETOLA
+
Oltre ai frammenti
attesi possono essere
trasferiti altre
sequenze di DNA
(Gebhard and Smalla, 1998)
=
TRASFORMANTI
COSTRUTTO RICEVENTE
(Acinetobacter sp. BD413)
CEPPI REPORTER DI Acinetobacter sp. BD413/ADP1
Progetto EU
TRANSBAC QLK3-CT-2001-02242
Gene Flow from Transgenic Plants: Evaluation and Biotechnology
Φ
#$
$
%&
#$
$
%&
Φ
!
!"
"
#
"
!
'
' (( ( )
*+ )
!"
#
"
"
LOCALIZZAZIONE HGT IN SITU
#$
$
%&
TRASFORMANTI?
ANALISI IN SITU
MARKER RESCUE
TRANSFORMATION
N
N
linker
aminoacidico
DOMINIO
ANTIBIOTICO
RESISTENZA
AadA
linker
aminoacidico
LOCALIZZAZIONE
DOMINIO
FLUORESCENTE
Gfp
DOMINIO
FLUORESCENTE
Gfp
C
DOMINIO
ANTIBIOTICO
RESISTENZA
AadA
C
Gage 2002 J.Bacteriol. 184:7042-7046
HGT GMP-MICRORGANISMI
L’HGT GMP-MICRORGANISMI
PUO’ AVVENIRE
MA QUALI SONO I RISCHI REALI?
PROBLEMA
D’INDAGINE
SPERIMENTALE
FITNESS
E
SELEZIONE
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