progetto di ricerca Caterina Giancotta-Liceo

PhD Student Dr.ssa Caterina Giancotta
Dottorato di Ricerca in Scienze della Vita – XXX Ciclo
Dipartimento di Scienze della Salute - Università “Magna Græcia” di Catanzaro
et
C.Spadafora; C .Lia; F. De Fazio ; A. Faragò; S. Timpani – Liceo Scientifico Enrico Fermi
Sersale
TITOLO DEL PROGETTO
Nuove strategie terapeutiche, gli antiossidanti di origine naturale: Una nuova frontiera nel
trattamento della’aterosclerosi.
OBIETTIVO FINALE DEL PROGETTO
Il presente progetto di ricerca ha l’obiettivo di:
1) Caratterizzare, in vivo, il danno endoteliale mediato dall’insorgenza di stress ossidativo
indotto a livello vascolare da elevati livelli di lipidi;
2) Identificare e studiare le vie di trasduzione del segnale attivate dall’incremento dei radicali
liberi nel processo aterosclerotico e l’eventuale attivazione di meccanismi di difesa endogeni
della cellula endoteliale;
3) Valutare l’efficacia di trattamenti farmacologici innovativi sul processo di infiammazione,
proliferazione neo-intimale e sulla conseguente disfunzione endoteliale;
BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA NAZIONALE O INTERNAZIONALE
(RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ESSENZIALI, SITI WEB, EVENTUALI RICERCHE IN
CORSO
Le malattie cardiovascolari, quali l’infarto, l’ictus e l’insufficienza cardiaca, rappresentano una
delle principali cause di morte nel mondo sviluppato, e sono destinate a diventare uno dei problemi
più significativi per la salute. In tale contesto, l’aterosclerosi rappresenta la causa principale delle
malattie cardiovascolari. Le lesioni aterosclerotiche interessano principalmente le grandi e medie
arterie elastiche e muscolari ed i principali fattori di rischio coinvolti nel suo sviluppo sono: diabete
mellito, ipertensione, ipercolesterolemia, obesità e stile di vita (fumo, inattività fisica, abitudini
alimentari) che determinano la così definita disfunzione endoteliale.
La disfunzione endoteliale, che segue l’iperproduzione di ox-LDL, rappresenta l’evento chiave
dello sviluppo di aterosclerosi. Gli effetti fisiopatologici che caratterizzano la disfunzione
endoteliale sono: rilascio di citochine proinfiammatorie; aumentata espressione di molecole di
adesione e di citochine chemiotattiche; proliferazione di SMCs e loro migrazione dalla tonaca
media alla tonaca intima. Tali eventi provocano la formazione di neo-intima, che a sua volta può
condurre ad occlusione vascolare e restenosi.
L’aumentata produzione di radicali liberi è coinvolta nell’induzione della crescita e della
migrazione delle SMCs vascolari, nella modulazione della funzione delle cellule endoteliali,
nell’espressione di un fenotipo pro-infiammatorio e nel rimodellamento/alterazione della matrice
extracellulare.
Recentemente è stato inoltre dimostrato che lo stress ossidativo è capace di accelerare le
modificazioni ossidative delle lipoproteine a bassa densità (LDL). L’aumento di concentrazione
delle LDL ossidate esacerba quindi il rilascio di citochine pro-infiammatorie; l’aumentata
espressione di molecole della classe delle immunoglobuline; l’attivazione di citochine
chemiotattiche; la proliferazione e la migrazione delle cellule muscolari lisce ed infine la
compromissione della vasodilatazione endotelio-dipendente.
Recentemente, in presenza di disfunzione endoteliale indotta da ox-LDL, è stata descritta una
ridotta disponibilità di ossido nitrico (NO) e questa è stata associata ad inibizione dell’attività
dell’isoforma endoteliale della NO-sintetasi (eNOS).
L’insieme di questi eventi è modulato dall’iper-espressione del principale recettore per le ox-LDL
denominato Lectin like ox-LDL receptor-1 (LOX-1), responsabile del legame,
dell’internalizzazione e della degradazione delle ox-LDL nelle cellule endoteliali.
Tutti questi eventi giocano ruoli importanti nella patologia dell’aterosclerosi, suggerendo che le vie
di trasduzione del segnale attivate dall’incremento dei radicali liberi possano rappresentare
importanti target terapeutici. Numerosi studi sperimentali ed epidemiologici, suggeriscono che i
polifenoli di origine vegetale ed in particolare i flavonoidi, potrebbero svolgere un ruolo preventivo
nel processo aterosclerotico. Tali effetti sembrano essere correlati alle loro attività pleiotropiche ,
quali l’attività antinfiammatoria ed antiossidante, ma sono rari gli studi scientifici ben documentati.
Riferimenti Bibliografici
1. Zeadin MG, Petlura CI, Werstuck GH. Molecular Mechanisms Linking Diabetes to the Accelerated
Development of Atherosclerosis. Can J Diabetes. 2013 Oct;37(5):345-50.
2. Steinberg D. The Cholesterol Wars: The Skeptics vs. the Preponderance of Evidence. San Diego: Elsevier
Academic Press, 2007.
3. Orekhov AN, Andreeva ER, Andrianova IV, Bobryshev YV. Peculiarities of cell composition and cell
proliferation in different type atherosclerotic lesions in carotid and coronary arteries. Atherosclerosis. 2010
Oct;212(2):436-43.
4. Muscoli C, Sacco I, Alecce V, Palma E, Nistico` R, Costa N, Clementi F, Rotiroti D, Francesco Romeo,
Daniela Salvemini, Jawahar L. Mehta, and Vincenzo Mollace. The Protective Effect of Superoxide Dismutase
Mimetic M40401 on Balloon Injury-Related Neointima Formation: Role of the Lectin-Like Oxidized LowDensity Lipoprotein Receptor-1. J Pharmacol Exp Ther. 2004 Oct;311(1):44-50.
5. Mollace V, Ragusa S, Sacco I, Muscoli C, Sculco F, Visalli V, Palma E, Muscoli S, Mondello L, Dugo P,
Rotiroti D and Romeo F. The protective effect of bergamot oil extract on lecitine-like OxyLDL Receptor-1
expression in balloon injury related neointima formation. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2008 June 13: 120129.
6. Kozlov S, Balachonova T, Machmudova H, Tripoten M, Andreevskaya M, Rogoza A, Kuharchuk V. Carotid
atherosclerosis, endothelial disfunction, and arterial stiffness in young and middle-aged men with coronary
artery disease. Int J Vasc Med. 2012;2012:950130.
7. Li D, Mehta JL. Oxidized LDL upregulates angiotensin II type 1receptor expression in cultured human
coronary artery endothelial cells: the potential role of transcription factor NF-kappaB. Circulation.
2000;102:1970–6.
8. Szmitko PE, Wang CH, Weisel RD, Jeffries GA, Anderson TJ, Verma S. Biomarkers of vascular disease
linking inflammation to endothelial activation: Part II. Circulation. 2003 Oct 28;108(17):2041-8.
9. Li D, Mehta JL. 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors protect against oxidized lowdensity lipoprotein-induced endothelial dysfunction. Endothelium. 2003;10(1):17-21.
10. Sawamura T, Kume N, Aoyama T, Moriwaki H, Hoshikawa H, Aiba Y, et al. An endothelial receptor for
oxidized low-density lipoprotein. Nature. 1997;386(6620):73–7.
METODOLOGIA
(Descrizione dettagliata della metodologia che si prevede di utilizzare, incluse le modalita’ di validazione)
Ratti Wistar maschi, con peso di 300-350 gr, verranno anestetizzati tramite iniezione
intraperitoneale di 0,08 ml/kg p.v. di Zoletil/Domitor. Il grado di anestesia verrà verificato mediante
risposta motoria degli animali agli stimoli dolorosi. Si procederà ad esposizione chirurgica della
carotide comune di destra e della rispettiva carotide esterna. Si effettuerà la legatura della carotide
esterna con filo di seta nero 5-0. Si procederà quindi all’esecuzione di un arteriotomia longitudinale
con bisturi 11 a livello della carotide esterna, in prossimità della legatura. Si procederà dunque
all’inserimento di un catetere per endoembolectomia arteriosa Fogarty 2F attraverso la carotide
esterna, entrando quindi nella carotide comune. In carotide comune il palloncino sarà gonfiato ad
una pressione di 1,5 ATM e fatto passare per 3 volte all’interno dell’arteria, producendo una deendotelizzazione del vaso. Al termine della procedura, si legherà la carotide esterna a monte
dell’arteriotomia, verranno rimossi i fili per l’emostasi e sarà suturata la cute.
Gli animali inclusi nei gruppi in trattamento saranno sottoposti, per i 14 giorni consecutivi, ad
iniezione sottocutanea o a gavage per consentire la veicolazione dei farmaci in sperimentazione.
Inoltre, tutti gli animali inclusi nel protocollo sperimentale saranno sottoposti, al giorno 0, 7 e 14 ad
esame ecografico dei tronchi carotidei, tramite utilizzo del VevoLAZR 2100. Questo tipo di analisi
permetterà di valutare nel tempo ed in modo non invasivo la formazione di iperplasia neointimale
della carotide sottoposta a balloon injury, rispetto alla controlaterale sana, e calcolare il rapporto
neointima/media grazie all’alta risoluzione ed all’ausilio di uno specifico software proprio dello
strumento in uso. Allo stesso modo sarà condotto su tutti gli animali esame tramite MRI 7-Tesla e
micro-CT (Bruker Corporation) che consentiranno di valutare l’anatomia e le dimensioni di cuore e
carotidi ed esame ecocardiografico (VevoLAZR 2100), che consentirà di calcolare i parametri
specifici di funzionalità cardiaca.
A distanza di 14 giorni saranno effettuati gli espianti dell’arteria carotide comune sottoposta a
danno, della controlaterale sana e del cuore per le successive valutazioni istologiche,
immunoistochimiche e biochimiche.
I ratti Wistar oggetto del protocollo di ricerca saranno suddivisi nei seguenti gruppi:
- Ratti di Controllo: non sottoposti a nessun trattamento;
- Ratti Sham Operated: sottoposti a procedura chirurgica di esposizione della carotide comune
ma non sottoposti a danno vascolare ;
- Ratti con Balloon Injury: sottoposti alla procedura chirurgica di danno vascolare mediante
catetere a palloncino;
- Ratti con Balloon Injury e trattamento: sottoposti a procedura chirurgica descritta nel protocollo
e candidati a ricevere eventuali trattamenti volti a ridurre il grado di restenosi vascolare , previa
sperimentazione delle diverse concentrazioni di farmaci in vitro.
- Ratti con Balloon Injury e trattamento: sottoposti a procedura chirurgica descritta nel protocollo
e candidati a ricevere eventuali trattamenti volti a ridurre il grado di restenosi vascolare , previa
sperimentazione delle diverse concentrazioni di nutraceutici in vitro.
ARTICOLAZIONE DEL PROGRAMMA DI RICERCA
L’iperplasia intimale, è una classica risposta della parete vascolare in seguito a lesione meccanica
ed è una delle principali cause di restenosi dopo Angioplastica Percutanea Transluminale
Coronarica (PTCA). L’iperplasia intimale rientra tra le Sindromi Coronariche Acute (SCA), la
quale definizione è ampia ed articolata e comprende pazienti con sintomi riconducibili ad
un’ischemia miocardica che hanno un infarto miocardico acuto o sono ad elevato rischio di necrosi
cardiaca. L’occlusione parziale o completa del vaso coronarico dovuto alla rottura di una placca
vulnerabile è il meccanismo fisiopatologico che sta alla base dell’evento coronarico acuto. La
conseguenza è la riduzione della perfusione coronarica e quindi il danno miocardico. Gli eventi
coronarici acuti condividono un meccanismo fisiopatologico comune: l’aterotrombosi, un processo
che nasce dalla rottura di una placca aterosclerotica, attivazione delle piastrine e sovrapposizione di
un trombo, parzialmente o totalmente occludente il vaso coronarico. La PTCA è una tecnica di
rivascolarizzazione miocardica in pazienti con cardiopatia ischemica sintomatica, che secondo le
linee guida può essere effettuata nella fase acuta di una sindrome coronarica (angina instabile,
NSTEMI, STEMI) per ricanalizzare l’arteria coronarica responsabile della sindrome stessa, o in
alternativa, in un paziente con angina instabile che presenta un restringimento coronarico
significativo. La terapia riperfusiva è la componente principale dell’approccio terapeutico in quanto
permette la completa ricanalizzazione del vaso ostruito e blocca quindi la progressione del danno
miocardico. Per essere efficace deve essere effettuata nel modo più rapido e precoce possibile e si
basa sulla PTCA primaria o la trombolisi. Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) giocano un ruolo
fondamentale nella mediazione del danno tissutale. Le ROS, quali il superossido (O2-), il perossido
di idrogeno (H2O2) e i radicali idrossilici (.OH) possono causare direttamente un danno cellulare,
attraverso l’espressione di geni pro-infiammatori, aumentando il catabolismo dell’ossido nitrico
(NO) verso la formazione di perossinitrito (ONOO-) ed accelerare l’ossidazione delle lipoproteine a
bassa densità ( LDL). Sia le cellule endoteliali sia quelle muscolari lisce sono in grado di produrre
ROS e conseguente danno ossidativo. Durante il processo di restenosi in seguito ad angioplastica,
sia la perdita dell’endotelio, sia la trasformazione delle cellule muscolari lisce sembrano contribuire
alla formazione neointimale. Pertanto probabile che due delle più importante cause di restenosi
siano la perdita di fattori inibitori della crescita derivanti da endotelio e trasformazioni delle cellule
muscolari lisce in un fenotipo capace di rispondere a fattori piastrinici e fattori derivanti
dall’endotelio con la conseguente proliferazione. Si pensa che i ROS non siano solo coinvolti nella
patogenesi dell’aterosclerosi, ma siano anche importanti mediatori delle risposte proliferative,
ipertrofiche e fibrotiche che frequentemente si verificano nelle arterie dopo angioplastica
percutanea coronarica transluminale che provocano un restringimento o una restenosi del lume.
Come discusso precedentemente i pathway pro-infiammatori, che facilitano il rimodellamento
vascolare, comprendono meccanismi di controllo redox-sensibili e quindi confermano il ruolo dello
stress ossidativo come principale meccanismo coinvolto nella proliferazione neointimale. Un
importante marcatore stabile utilizzato per osservare lo stress ossidativo è la formazione di
nitrotirosina. In quanto, ONOO-, il più tossico dei derivati, è in grado di nitrare i residui di tirosina
delle proteine. Dunque l’aumentata formazione di nitrotirosina è considerata un importante
indicatore dell’aumentato stress ossidativo. Questo ha spinto gli studiosi all’utilizzo in via
sperimentale di composti con elevata attività antiossidante nell’inibire la restenosi dopo PTCA. In
associazione ai fattori di rischio cardiovascolari “classici”, i fenomeni infettivi ed infiammatori
potrebbero svolgere un ruolo importante nello sviluppo del processo aterosclerotico coronarico e
contribuire, in particolare, alla formazione neointimale dopo danno endoteliale. In vari modelli
animali di aterosclerosi, i segni dell’infiammazione sono concomitanti con l’accumulo lipidico nella
parete delle arterie. Per esempio, mediatori sia delle difese dell’ospite, sia dell’infiammazione, sono
localizzati nelle lesioni aterosclerotiche più precoci, non solo nei modelli animali da esperimento,
ma anche nell’uomo. Le basi biologiche dell’infiammazione in seguito a PTCA hanno fornito una
nuova chiave di lettura dei meccanismi fisiopatologici, sottolineando il ruolo del reclutamento
leucocitario. In condizioni normali le cellule vascolari non aderiscono all’endotelio vascolare.
Tuttavia, abbastanza precocemente dopo l’inizio di una dieta aterogenica, le cellule endoteliali delle
arterie iniziano ad esprimere sulla superficie molecole di adesione specifiche per varie classi di
leucociti. In particolare la vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) che lega precisamente i
tipi di leucociti trovati precocemente negli ateromi umani e sperimentalii. Recentemente , sono stati
riconosciuti dei mediatori importanti nell’iniziazione e progressione delle malattie cardiovascolari
come malattie periferiche vascolari, l’aterosclerosi e l’insufficienza cardiaca. Questa relazione si
basa sull’evidenza dell’attivazione di fattori di trascrizione nucleare redox-sensibili (NF-κb) upregolate ,citochine, chemochine e molecole di adesione che a loro volta mediano la patofisiologia di
queste malattie. Citochine
proinfiammatorie come il tumor necrosis factor (TNF-α) e
l’interleuchina (IL-1) attivano il segnale a cascata, mentre la funzione delle chemochine è quella di
reclutare leucociti e monociti, neutrofili ed altre cellule circolanti effettrici sul sito del danno e di
infiammazione.
Infatti l’obiettivo di questo progetto è proprio quello di testare l’efficacia terapeutica di prodotti
nutraceutici con attività antiossidante. Lo scopo non è quello di sostituire il farmaco utilizzato in
terapia classica, ma cercare di coadiuvare quest’ultimo con uno scavenger dei radicali liberi in
modo da diminuire la dose con conseguente riduzione degli effetti collaterali. Diversi sono i dati in
letteratura che mostrano spiccate capacità antiossidanti di composti ricchi di polifenoli di origine
naturale capaci di poter contrastare la crescita sub-intimale post angioplastica. Numerose evidenze
sperimentali e cliniche hanno dimostrato che polifenoli di origine vegetale comunemente assunte
con la dieta possono prevenire l’insorgenza di diversi tii di patologie in cui lo stress ossidativo
ricopre un ruolo chiave. Studi epidemiologici hanno documentato il valore nutraceutico di composti
ad azione antiossidante presenti in larga misuri in cibi tipici della dieta mediterranea. I composti
fenolici e polifenolici sono largamente distribuiti nel mondo vegetale , ed è stata ampiamente
documentata l’attività “scavenger” di radicali liberi in diversi sistemi sperimentali. Studi
sperimentali ed epidemiologici suggeriscono che una dieta ricca ricca di polifenoli ed in particolare
di flavonoidi, potrebbe svolgere un ruolo preventivo nel processo aterosclerotico. Tali effetti
sembrano essere correlate alle loro proprietà pleiotropiche , quali l’attività antinfiammatoria ed
antiossidante. Dati sperimentali dimostrano, infatti, che alcuni flavonoidi del genere Citrus
riducono l’espressione dei recettori scavenger macrofagici e di iNOS, eNOS, COX-2, TNF-alpha ed
IL-6 in linee cellulari macrofagiche . perciò I meccanismi alla basa dell’azione anti-aterogenica dei
flavonoidi, potrebbero andare oltre le loro proprietà anti-ossidative, soprattutto se si considera che
le molecole con un maggiore potere antiossidante , come per esempio la vitamina A, si sono rilevate
inefficaci in molti studi clinici. Citrus Bergamia Risso and Poiteau (bergamotto) è una pianta
appartenente alla famiglia delle Rutaceae, laragmente coltivata lungo la costa Jonica della Calabria.
Il succo del bergamotto viene principalmente utilizzato per l’estrazione dell’olio essenziale che
trova largo impiego nell’industria cosmetica, farmaceuica ed alimentare. Il succo di bergamotto
presenta, rispetto ad altri succhi di Citrus , un elevato contenuto di flavonoidi, i quali possono
prevenire l’insorgenza dell’aterosclerosi. Il succo di bergamotto , presenta rispetto ad altri succhi di
Citrus , un elevato contenuto di flavonoidi; inoltre esibisce un peculiare profilo flavonoidico
(neoeriocitrina,neohesperidina, naringina,poncirina, rutina, neodesmina, rhoifolina) caratterizzato
da una elevata percentuale di poncirina. Studi condotti in vivo hanno documentato che naringina
può rallentare l’aterogenesi e questa azione biologica sembra essere correlata con l’inibizione
dell’espressione delle molecole di adesione intracellulare-1 ( ICAM-1). Inoltre è stato dimostrato
che neoeriocitrina e rutina sono in grado di inibire l’ossidazione delle LDL in vivo. Nonostante ciò
nessun dato in lettaratura riporta gli effetti della frazione flavonoica del succo di bergamotto sul
metabolismo lipidico e sull’aterogenesi.
OUTPUT DEL PROGRAMMA
(DESCRIZIONE DEI POSSIBILI RISULTATI DELLA RICERCA PROPOSTA)
È ormai stato ampiamente dimostrato che, dopo un angioplastica transluminale, spesso si verifica
una restenosi che determina una riocclusione della lesione iniziale. Il ruolo predominante dei
processi redox nei tessuti lesi e nelle cellule vascolari, suggerisce il loro coinvolgimento nella
reazione di riparazione della parete danneggiata, quindi determinante nella restenosi postangioplastica. La rimozione dell’endotelio non solo altera il normale ambiente paracrino ormonale
in cui si trovano le cellule muscolari lisce, ma mostra anche una superficie trombogenica cui
possono aderire piastrine ed altri fattori circolanti, portando così alla formazione di un trombo.
L’iperplasia consiste in un aumento del numero di cellule, generalmente risultante in un
accrescimento di volume. L’iperplasia è dovuta ad un’eccessiva stimolazione ormonale o
all’azione di fattori di crescita sulle cellule bersaglio. Durante la risposta riparativa, le cellule
muscolari lisce, subiscono modificazioni che assomigliano ad un processo di de-differenziazione.
La ricostruzione della parete vascolare danneggiata è una risposta riparativa fisiologica che
comporta la formazione di una neointima. Il processo infiammatorio é essenziale nella formazione
neointimale dopo angioplastica sperimentale e nel processo di restenosi intra-stent dopo
angioplastica coronaria translumilale percutanea. Diversi studi sperimentali mostrano capacità
antinfiammatorie ed antiossidanti dei polifenoli di origine vegetale, con attività inibitorie sul
processo aterosclerotico. Sulla base di queste considerazioni l’obiettivo del nostro programma di
ricerca sarà quello di valutare il potenziale farmacologico ed i meccanismi d’azione della frazione
flavonoica del succo di Citrus Bergamia (bergamotto) nella prevenzione e nel trattamento
dell’aterosclerosi. L’idea di puntare l’attenzione sul succo di bergamotto deriva alle osservazioni
riportate nelle recenti pubblicazioni, le quali mostrano le proprietà anti-iperlipidemiche del succo e
di altri derivati del bergamotto. La capacità della frazione non volatile dell’olio di inibire
l’espressione del recettore LOX-1 , uno dei recettori maggiormente coinvolti nel processo di
aterogenesi, suggerisce un potenziale farmacologico di questi composti nel trattamento di
aterosclerosi.
Da tale evidenze deriva una possibilità di impiego di farmaci antiossidanti selettivi in senso
antiproliferativo ed anti-infiammatorio in quelle condizioni di alterazione della parete vasale che si
associano ad aumentata formazione di specie radicaliche ed ad un aumento dell’infiammazione.
L’utilizzo di molecole antiossidanti di origine naturale, privi di tossicità, rappresenta una possibile
strategia terapeutica nella cura dei disordini vascolari in cui l’infiammazione ricopre un ruolo
cruciale.