calorimetria differenziale a scansione

Cenni su
DSC
e
CD
CALORIMETRIA
Il calore è una forma di energia che fluisce da o verso il sistema in
presenza di un gradiente di temperatura T
Q  f (T )
dove
T 

T  

 x 
  T
i 
y,z


 y 
 
  T
j 
x, z


 z 

k
x, y
La maggior parte dei fenomeni che si verificano in seno ad un
sistema è accompagnata da un effetto termico, Q,
rilevabile
sperimentalmente.
Lo scopo della calorimetria è la determinazione della quantità di
calore, Q, ceduto o assorbito dal sistema.
Eventi che comportano scambi di calore (ad una data T e p) tra
sistema e ambiente calorimetrico:
 Reazioni chimiche
 Cambiamenti di stato fisico di sostanze pure (fusione,
evaporazione, sublimazione)
 Ripartizione tra due solventi (es. acqua/etere)
 Adsorbimento di liquidi (acqua) da parte di sostanze solide
 Denaturazione delle proteine
 Formazione di fasi "gel"
 Processi di polimerizzazione
 Processi metabolici di organismi viventi
Se si vuole conoscere sia Q che la T alla quale un certo fenomeno
si manifesta (ad una data p, cioè in condizioni isoterme e isobare),
si deve operare imponendo un gradiente di T prossimo allo zero.
Naturalmente questa condizione comporta che il flusso di calore
sia prossimo allo zero
Per questo motivo, i calorimetri sono apparecchiature in cui
l‘ambiente che scambia calore col campione è un corpo di elevata
capacità termica, la cui temperatura, TA, differisce sempre di pochi
centesimi di grado da quella, TS, del campione collocato al suo
interno e in equilibrio termico con esso.
Il calorimetro è isolato dal mondo esterno.
AMBIENTE ESTERNO
superficie adiabatica
Ambiente
Q0
Sistema
Q0
calorimetrico
AMBIENTE ESTERNO
Condizioni ideali:
TS = TA  dT
Condizioni reali:
TS = TA  D T
Il calore scambiato tra ambiente calorimetrico e sistema è funzione
della differenza (TA - TS).
Nei calorimetri detti ADIABATICI si mantiene (con un dispositivo di
riscaldamento elettrico) TA = TS, in modo che non vi sia flusso di
calore tra i due scomparti e si registra la variazione nel tempo di TS.
La differenza T = (TS,finale - TS,iniziale) = (TA,finale - TA,iniziale) dipende solo
dalla quantità di calore prodotta in “S" e si ha:
QS = CA DT
dove CA è la capacità termica dell'ambiente calorimetrico,
determinata a priori con esperimenti ad hoc per i quali è nota QS.
Per esigenze pratiche sono così nate, nella scia della calorimetria
tradizionale, nuove metodiche tra cui la:
CALORIMETRIA DIFFERENZIALE A SCANSIONE (DSC).
La DSC consente di rilevare le variazioni di entalpia del sistema come
quantità di calore, Q, emesse o assorbite dal sistema stesso, o come
variazioni della derivata dQ/dt, nel corso della scansione di temperatura.
Si tratta quindi di INDAGINI DINAMICHE.
La DSC è una tecnica "DIFFERENZIALE", cioè rivolta alla
determinazione della differenza tra il calore (svolto o assorbito)
dal sistema in esame, "s", e da un sistema di riferimento, "r",
costituito da materiale "termicamente inerte" nell'intervallo di
temperatura considerato.
Lo strumento rileva la differenza di temperatura (Ts - Tr) nel corso
della scansione, come differenza di potenziale agli estremi di due
termocoppie, in contatto rispettivamente con "s" e con "r".
Nella DSC, la differenza di T attiva un dispositivo che scalda "s" o
"r", in modo da mantenere (Ts - Tr) = 0.
La quantità di calore necessaria a questa compensazione è prodotta per
effetto joule con una corrente elettrica che percorre un filamento di
resistenza R, prossimo a "s" o a "r".
L'intensità, i, di questa corrente è il segnale dello strumento DSC,
che viene espresso come
(i 2R) = dQ/dt = potenza erogata.
Abitualmente, la differenza (Ts - Tr), o il segnale dQ/dt, viene riportato in
funzione del tempo t, o della temperatura del sistema di riferimento, Tr =
Tr(t).
La registrazione
"TRACCIATO".
di
una
scansione
prende
il
nome
di
Tipologia di segnali in un Tracciato DSC
Picco
esotermico
Picco
endotermico
T(t)
Il segnale DSC in assenza di fenomeni, cioè quando l’evento in
corso è il semplice riscaldamento del campione e del materiale di
riferimento, é descritto dalla espressione:
 dQ   dQ 
D



 dt 
dt



s
m C
s
p,s
 dQ

dT

 


 


 dt 
 dT s
r
 dQ 


 dt 
 mr C p , r
 dQ   


 dT  
r

dove i suffissi “s” e “r” indicano “campione” e “riferimento”; Cp e
 indicano calore specifico e velocità di scansione della
temperatura, dT/dt.
dQ
dt
La linea di base cambia
nell’intervallo (To, Te)
To
Te
T
Se si sottrae il tracciato ottenuto quando la cella “campione” é vuota,
cioè il contributo uguale a:
 dQ 
D
 -   mr C p , r

 dt bianco
si ottiene la cosidetta linea di base, cioé
 dQ 


 dt 
  ms C p , s
baseline
che può essere facilmente convertita nelle coordinate (Cp,s , T ) se
sono note la massa del campione, ms, e la velocità di sansione, .
Se il campione nell’intervallo di temperatura indagato subisce una
trasformazione con variazione di entalpia, DH, l’espressione analitica del
tracciato DSC include questo nuovo contributo,
 dQ 

D
 dt 
H
d

 ms 
 D
dt

H
d 
 ms 

dT 
dove  indica il grado di avanzamento del processo e d/dt é la
velocità del processo.
Il processo ha inizio ad una temperatura To dove il fenomeno
diventa spontaneo (DG ≤ 0); a questa temperatura esso ha velocità
piuttosto piccola.
Alla fine del processo, cioè alla temperature Te, la velocità è
ugualmente piccola, poichè il fenomeno si esaurisce.
Per questo motivo il segnale DSC ha la forma di picco (verso il
basso, o verso l’alto, a seconda del segno del corrispondente DH),
sovrapposto alla linea di base.
La trasformazione comporta anche un cambiamento di Cp,s . Questo
significa che la linea di base si modifica nel corso del processo,
cioè nella regione sottostante il picco. Essa ha una forma sigmoide,
compresa tra un valore iniziale Cp,s,o e un valore finale Cp,s,e,
C
p,s
  C p , s ,e  (1   ) C p , s ,o
Cpapp
Tracciato DSC dopo elaborasione:
(Segnale - linea di base)/(massa × velocità di scansione
Area = Q = mSDH
T
Se il processo in corso all'interno di "s" è una reazione chimica, il
profilo del picco DSC corrisponde dunque al suo svolgimento e dà
direttamente informazioni sulla velocità dell'evento.
t
( t ) 
 ( dQ / dt )dt
0

 ( dQ / dt )dt
Area Parziale

Area Totale
0
Un'analisi del profilo del picco DSC permette di risalire a tutti i
parametri cinetici del processo.
d
 K ( T ) 1 n
dt
dove K(T) è la costante cinetica e n è l'ordine di reazione.
I sistemi costituiti da più componenti, come quelli di interesse
biologico e farmacologico, possono dare tracciati DSC con più picchi
parzialmente sovrapposti.
In questi casi la scelta della linea di base deve necessariamente
essere approssimata: in genere ci si limita ad identificarla con la retta
che congiunge il punto di inizio e quello di fine del segnale.
Il tracciato viene quindi scomposto con procedure di calcolo iterativo
in componenti semplici ai quali si attribuisce per semplicità una
forma gaussiana:
2

A
exp(

Cp
T / B)
ciascuno dei picchi gaussiani può essere trattato separatamente,
secondo le modalità viste
Heat Flux / (mW g-1)
conalbumin
Lysozyme + ovoalbumin
Intemediate
ovoalbumin
T/°C
Stable
ovoalbumin
Nel caso di scansioni isoterme, la variabile indipendente del
tracciato DSC è il tempo.
In questo caso la forma del tracciato dipende dal tipo di processo
che ha luogo nel calorimetro e dalle modalità con cui esso viene
studiato.
L'area sottesa al tracciato corrisponde direttamente al calore che
accompagna il processo e il profilo del segnale corrisponde
direttamente alla legge cinetica seguita dal processo alla
temperatura considerata.
La velocità con la quale la trasformazione in corso interessa via via
tutta la massa, ms, del campione è:
d ms
d
v
 ms ,totale
dt
dt
Cenni sul Dicroismo Circolare
Dicroismo circolare (CD)
Cromofori nelle proteine
Il legame peptidico
(210 nm)
Ponte disolfuro
(250 nm)
Centrato a 280 nm
Geometria di un esperimento di assorbimento
Spettroscopia di dicroismo circolare
Il fenomeno del Dicroismo Circolare (CD) si osserva
quando un campione otticamente attivo assorbe in
maniera differente la luce circolarmente polarizzata
destra da quella circolarmente polarizzata sinistra. La
differenza di assorbimento è piccola (generalmente
0.0001) che corrisponde ad una ellitticità di pochi
centesimi di grado. Spettri CD relativi a strutture
secondarie diverse di peptidi, acidi nucleici e
polisaccaridi sono diversi e quindi questa tecnica dà
informazioni
sulla
struttura
secondaria
di
macromolecole biologiche.
Cromofori in ambienti asimmetrici assorbono in
modo diverso radiazioni polarizzate circolarmente
in senso opposto
l
I0(n)
Legge di Lambert-Beer:
I(n)
C =concentrazione
I 0 (n 


A(n   log

(

I
n


A(n    (n lC
Ellitticità in relazione alla legge di Lambert-Beer
DA = Al - Ar = llc - rlc = D lc
• Legame peptidico (180 - 250 nm)
[] = 3298 ∆
Curve di denaturazione termica di proteine