Dalla fisiologia dell`ultrafiltrazione alla proteinuria

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Dalla fisiologia
dell’ultrafiltrazione
alla proteinuria
Come il laboratorio aiuta la pratica clinica.
I·
n questo articolo verranno descritti ed analizzati i seguenti argomenti:
le strutture anatomiche del rene coinvolte nell’ultrafiltrazione delle macromolecole proteiche e la
relativa modalità di funzione;
le caratteristiche morfologiche, funzionali e di carica elettrica delle proteine che ne condizionano
l’ultrafiltrazione a livello del glomerulo renale. L’ultrafiltrazione selettiva delle proteine plasmatiche
avviene a livello della barriera di filtrazione del
glomerulo renale;
la composizione delle proteine urinarie in condizioni di normalità e la sua analisi con tecniche che
consentono la caratterizzazione in termini di dimensione e di carica non solo delle proteine quantitativamente prevalenti, ma anche delle molecole
proteiche a bassa espressione nelle urine;
la caratterizzazione della composizione delle proteine urinarie in corso di proteinuria come modello
di alterata ultrafiltrazione. Come la condizione patologica modifica la selettività dell’ultrafiltrazione
e influenza quindi il passaggio delle proteine nelle
urine;
la possibilità di identificare, attraverso l’analisi
urinaria con tecniche in grado di evidenziare le
proteine a bassa concentrazione, potenziali marcatori di gravità del danno renale e le strutture
anatomo-funzionali interessate.
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L’ultrafiltrazione renale delle macromolecole.
Strutture implicate e loro funzione
I
l glomerulo renale è la struttura deputata
alla filtrazione delle molecole. Tale funzione, essenzia-
i
Ved e
an.c.h
.
.
pag
10
Enrico Verrina1
Maurizio Bruschi3
Laura Santucci3
Enrico Giardina3
Rossella Cannavò1
Giovanni Candiano2
1
U.O. di Nefrologia,
Dialisi e Trapianto Renale
2
Laboratorio di Fisiopatologia
dell’Uremia
3
Fondazione Malattie Renali
del Bambino
IRCCS Giannina Gaslini, Genova
email: enricoverrina@
ospedale-gaslini.ge.it
le per la vita, permette la filtrazione e successiva manipolazione da parte del tubulo renale di piccole molecole (da
aminoacidi a peptidi e proteine fino a 40 kDa) che spesso
rappresentano prodotti terminali di vie metaboliche e
vanno incontro ad eliminazione. Secondo una precisa
gerarchia, piccole molecole del sangue indispensabili alla
vita vengono prima filtrate e poi riassorbite attraverso
meccanismi attivi e selettivi che rendono ragione della
complessa architettura strutturale e funzionale del rene.
Per contro, il filtro glomerulare è programmato a ritenere
1
2
3
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5
L’ultrafiltrazione
delle proteine
plasmatiche avviene a
livello della barriera di
filtrazione
del glomerulo renale.
La selettività
dell’ultrafiltrazione
è influenzata
da dimensione,
conformazione
e carica elettrica
delle proteine.
In corso di proteinuria
la condizione patologica
sottostante modifica
solo parzialmente
la selettività renale
interessando il passaggio
di tutte le proteine.
L’aumentata
presenza
di proteine ad alto
peso molecolare
(immunoglobuline,
proteine acide)
è stata correlata
alla gravità
del danno renale.
L’identificazione di
marcatori urinari
di sede è attesa da
tecniche analitiche
capaci di evidenziare
proteine a bassa
concentrazione di
derivazione podocitaria,
tubulare o interstiziale.
molecole di dimensioni maggiori, che spesso rappresentano proteine a funzione essenziale. La struttura dell’unità
del glomerulo renale deputata all’ultrafiltrazione selettiva
rende ragione della funzione ma non ne spiega completamente la dinamica rendendo necessaria un’ulteriore
discussione dei meccanismi implicati. Infatti, è chiara la
struttura a filtro poroso dell’unità di ultrafiltrazione glomerulare (Figura 1) che è composta da un primo livello
poco selettivo e rappresentato dall’endotelio fenestrato,
cui fa seguito una membrana basale ricca in collagene e
strutture caricate elettricamente (eparansolfati, glicoproteine). Alla membrana basale è appoggiata, con rapporti
di contiguità, la vera struttura filtrante del glomerulo che
è rappresentata dai podociti. Queste cellule sono strutture
epiteliali specializzate e come tali con corredo strutturale
unico che presentano alla microscopia elettronica una
forma che ricorda un piede (Figura 1) con prolungamenti
cellulari che aderiscono tramite integrine alla membrana
basale. La sottile membrana tesa fra adiacenti prolungamenti cellulari (slit diaphragm) è costituita essenzialmen-
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Punti
chiave
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Caso clinico Titolo articolo anche lungo
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Piccole molecole vengono prima filtrate e poi riassorbite
attraverso meccanismi attivi e selettivi che rendono ragione
della complessa architettura strutturale e funzionale del rene.
te da molecole specializzate, principalmente nefrina ed
omologhi, che formano il vero filtro della struttura glomerulare. In realtà è l’interazione fra lo slit diaphragm ed
il citoscheletro podocitario che mantiene l’integrità della
struttura filtrante in quanto la funzionalità del podocita
è legata al mantenimento della conformazione e della
plasticità in cui il citoscheletro ha un ruolo essenziale1.
macromolecole a struttura rigida, quali sono le proteine,
vengono ultrafiltrate secondo dimensione, carica elettrica
e conformazione2,3. Classicamente l’analisi della selettività
renale riportata viene condotta utilizzando polimeri a
struttura ripetitiva con peso molecolare variabile (da 10
a 200 kDa) e di cui è possibile una valutazione urinaria.
Molecole di peso molecolare <40 kDa vengono liberamente filtrate dal filtro poroso, mentre per molecole a più
alta dimensione è definita una correlazione con la carica
e la conformazione per cui a parità di dimensioni, molecole a carica elettrica cationica presentano una filtrazione
renale aumentata.
Oltre che per l’analisi di selettività i modelli animali
sono stati utilizzati per verificare la tossicità renale di
molecole a carica variabile. Seguendo tale metodologia è
stato possibile ipotizzare e poi
Figura 1. Rappresentazione
dimostrare che proteine endoschematica del glomerulo regene cationiche determinano
nale (a), con dettaglio dell’analterazioni strutturali renali. sa capillare (b) e della barriera
di filtrazione (c), vista anche
Questo è vero sia in modelli
al microscopio elettronico (d),
sperimentali, in genere ratti, ai
che è formata da endotelio
quali vengono somministrate
fenestrato, membrana basale
glomerulare e processi pediproteine endogene modificate
Carica elettrica e conformazione
delle proteine determinano la selettività
L’
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analisi della selettività renale verso macromolecole ha rappresentato un importante campo
di ricerca negli anni fra 1970 e 1990 quando la struttura
dettagliata del podocita renale è stata chiarificata con
l’utilizzo della microscopia elettronica (Figura 1d). Alla
definizione morfologica ha fatto seguito la caratterizzazione funzionale, principalmente basata su modelli animali nei quali si potevano iniettare molecole a dimensione
variabile con carica manipolata chimicamente. Sulla base
degli studi sperimentali prese forma una teoria generale
sull’ultrafiltrazione delle macromolecole secondo la quale
a
Matrice
mesangiale
Cellule
mesangiali
Cellule
parietali
epiteliali
Arteriola
efferente
Ansa capillare
cellari dei podociti collegati
tra loro dallo slit diaphragm.
Membrana
basale
glomerulare
Polo
vascolare
b
Spazio
urinario
Filtrazione
Polo
urinario
Sangue
Tubulo
prossimale
Arteriola
afferente
Spazio urinario
(Bowman)
Cellula
mesangiale
Endotelio
fenestrato
Podocita
Membrana
basale
di Bowman
Capsula di Bowman
Podociti
(cellule viscerali
epiteliali)
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S
eguendo la logica dei modelli sperimentali
si può prevedere che a dimensione data ma a carica
variabile differenti proteine abbiano un’escrezione diversa,
essendo privilegiata l’escrezione di proteine a carica cationica. Esistono numerosi esempi di proteine a carica variabile che spesso trovano origine da polimorfismi genetici,
ma che non rivestono sempre interesse in patologia. Una
possibilità alternativa è che variazioni della carica elettrica
siano determinate da modifiche post-traslazionali che
spesso interessano proteine seriche ad alta concentrazione
e significato funzionale, quali l’albumina e le immunoglobuline6,7. È da tempo noto come variazioni della ca-
c
·
·
d
Pedicelli
podocitari
Spazio
urinario
Filtrazione
Slit
diaphragm
Sangue
Membrana
basale
glomerulare
Endotelio
fenestrato
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L’escrezione urinaria di proteine
in condizioni di normalità
rica e della conformazione dell’albumina serica derivino
da glicosilazioni non enzimatiche che intervengono in
corso di picchi glicemici o come effetto del trasporto di
acidi grassi che determinano l’aumento dell’idrofobicità
della molecola. Studi ormai decennali sulla carica e sulla
conformazione dell’albumina endogena hanno dimostrato che l’albumina urinaria è più glicosilata rispetto alla
proteina serica ed è nello stesso più ricca in acidi grassi.
Entrambe le trasformazioni sono in grado di modificare
la carica della proteina e nel caso degli acidi grassi ne
è modificata anche la conformazione. Pertanto gli studi sulla caratterizzazione di singole molecole proteiche
confermano la teoria della filtrazione renale e pongono le
basi a considerare l’influenza che tale meccanismo possa
determinare in condizioni di patologia.
Guardando, più in generale, alla composizione delle
proteine urinarie si possono formulare diverse conclusioni. L’analisi delle proteine urinarie con tecniche che
permettono la caratterizzazione della dimensione e della
carica (quali l’elettroforesi bidimensionale) può di fatto
chiarire quali proteine sono presenti nelle urine normali e
quali loro caratteristiche ne influenzano l’escrezione8. Alle
analisi tradizionali con le tecniche citate si sono recentemente affiancati approcci che vertono a pre-purificare
proteine a bassa escrezione in maniera che da un approccio completo è possibile stabilire:
quali sono per quantità le maggiori proteine urinarie e quali caratteristiche molecolari di carica e
conformazione esse hanno;
qual è per qualità la composizione delle proteine
urinarie includendo anche le proteine a bassa e
bassissima espressione.
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chimicamente quali l’albumina serica, che in patologia
umana come nel caso della malattia da catene leggere in
cui è stata documentata una correlazione fra carica della
catena leggera escreta e danno renale4,5.
L’idea che a dimensione data, la carica elettrica di
una macromolecola ne determina l’ultrafiltrazione ha
posto le basi per studi applicativi in patologia umana
che vertevano a definire variazioni di carica di proteine
circolanti quali fattori patogenetici6,7. In realtà, tali studi
non hanno portato ad evoluzioni significative, almeno nel
campo delle patologie renali caratterizzate da importante
proteinuria, mentre sono ancora in corso studi nelle forme
di microproteinuria stabile, come ad esempio nel caso del
diabete mellito, o sulla tossicità renale indotta da catene
leggere ad aumentata carica elettrica.
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NON LINEAR pH
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NON LINEAR pH
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Mr
KDa
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Figura 2. Composizione proteica di urine di un soggetto
normale valutata mediante
elettroforesi bidimensionale
su campione standard (a) e su
campione sottoposto a prepurificazione (b).
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Il risultato dell’approccio
citato è presentato nella Figura 2 in cui appare chiaramente
che sia guardando alla composizione globale (non pre-purificata) sia al pannello di proteine a bassa concentrazione,
le urine normali contemplano la presenza di quasi tutte le
proteine plasmatiche e con la stessa concentrazione. Sono
incluse proteine di grossa dimensione (immunoglobuline)
e proteine a carica anionica (albumina). Tale osservazione
confermerebbe che in condizioni di normalità, l’escrezione
delle proteine avviene per ultrafiltrazione del plasma seguendo una regola di non selettività. Una lettura parallela
suggerisce che la selettività non si esplica per quantità
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J Clin Invest 1993; 92:2274-82.
ridotte di proteine, ovvero non trova applicazione nella
normalità, ma ha un ruolo in presenza di proteinuria
importante. Questo concetto verrà in dettaglio definito
nel paragrafo successivo.
La proteinuria come modello
di alterata filtrazione. Dal poco al tanto
in assenza di lesioni renali
L
a caratterizzazione della composizione delle proteine urinarie in corso di proteinuria permette
di verificare e validare i modelli di ultrafiltrazione renale in caso di chiara alterazione del sovraccarico. Anche
4. Clyne DH, Pesce AJ, Thompson RE.
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Predizione e terapia
R
isulta chiaro da quanto detto che la proteinuria altro non è che un’anomala e quantitativamente rilevante attivazione di un meccanismo fisiologico e che non presenta di per sé significati attrattivi per
spiegare le lesioni renali. È possibile tuttavia delineare
alcune note patologiche che hanno correlazione con la
gravità della malattia10,11 e vertono principalmente ad
identificare nelle urine proteine ad alto peso molecolare
in eccesso (immunoglobuline, proteine acide) come indice
di impegno renale rilevante. In passato, tale approccio
ha avuto riscontri clinici ed è stato utilizzato per predire
l’outcome renale. Gli studi non hanno creato tuttavia una
solida base clinica e non hanno ad oggi più riscontro nella
pratica clinica.
Le evoluzioni sulla presenza nelle urine di marcatori
di gravità verranno invece dagli sviluppi dell’analisi urinaria con tecniche che evidenziano le proteine a bassa
concentrazione che in alcuni casi sono di derivazione
renale (podocitaria, tubulare, interstiziale) e che possono
più direttamente indicare danni localizzati delle relative
strutture renali
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in questo caso la tecnica di
elettroforesi bidimensionale
permette la simultanea analisi
della dimensione e della carica
delle proteine presenti a livello urinario. La composizione delle proteine urinarie in
una situazione di aperta proteinuria per glomerulonefrite
(Figura 3) presenta alcune caratteristiche che richiamano
e stressano le conclusioni raggiunte dalla situazione di
normalità. Infatti, è evidente in primo luogo la presenza
di proteine a peso molecolare intermedio e a carica acida
quali l’albumina che sono escrete in maniera equimolare
rispetto al plasma. Sono inoltre presenti alcune proteine
a peso molecolare intermedio e carica significativamente
acida quali leucin-rich a2-glycoprotein, a1-acid glycoprotein,
a1B-glycoprotein e zinc a2-glycoprotein, che sono presenti
in maniera più massiccia rispetto al plasma suggerendo
che in questa situazione la selettività verso molecole a
carica acida è fortemente alterata9.
Se si fa eccezione per le quantità e per la più marcata presenza di proteine acide, la situazione in corso
di proteinuria non si discosta in maniera rilevante dalla
normalità. Sembra pertanto evidente che la condizione patologica modifica solo parzialmente la selettività
renale interessando in maniera globale il passaggio di
tutte le proteine.
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Figura 3. Composizione proteica di urine di un paziente con
glomerulonefrite valutata mediante elettroforesi bidimensionale su campione standard
(a) e su campione sottoposto
a pre-purificazione (b).