proteine terapeutiche in oncologia

PROTEINE
TERAPEUTICHE
IN
ONCOLOGIA
ANTICORPI TERAPEUTICI
GENERAZIONE DI UN
ANTICORPO MONOCLONALE
MEDIUM HAT:
contiene ipoxantina, aminopterina, timidina.
La cellula di mieloma non possiede l’enzima HGPRT (ipoxantina-guaninafosforibosil-transferasi) quindi solo le cellule fuse riescono a
sopravvivere nel medium HAT.
PROBLEMI PRINCIPALI ASSOCIATI ALL’USO
DI ANTICORPI MURINI:
1. La maggioranza dei pazienti (fino all’80%)
sviluppa anticorpi contro gli Ab murini
(HAMA, Human Anti-Mouse Antibody)
2. L’Fc murino è poco efficiente nel reclutare effettori cellulari
umani
3. Il t1/2 degli Ab murini è molto breve
(< 24 ore; umani: t1/2 di alcune settimane)
EVOLUZIONE GRADUALE DELL’UMANIZZAZIONE
DEGLI ANTICORPI:
1. Produzione di anticorpi chimerici
(70% sequenze umane)
2. Produzione di anticorpi umanizzati
(95% sequenze umane)
3. Produzione di anticorpi completamente umani
attraverso il
“phage display”
Struttura base degli anticorpi IgG
-tetrameri di 150 kDa, formati da due
catene H di 50-70 kDa
e 2 catene L di 25 kDa
-ogni L si associa con una H tramite S-S
-le due H sia associano tramite S-S
(regione cerniera o “hinge”)
-ogni IgG è bivalente
-gli N terminali sono altamente variabili (V)
mentre gli C terminali sono costanti (C)
-nell’ambito di VH e VL ci sono 3 regioni
ipervariabili e si chiamano “regioni
determinanti la complementarietà” (CDR)
-i domini CH2 e CH3 formano l’Fc
(porzione effettrice)
Anticorpo chimerico:
fusione dei domini V murini con domini C umani
Anticorpo
umanizzato:
trasferimento
dall’Ab
murino a quello
umano
solo dei residui
responsabili del
legame all’
antigene
Produzione di anticorpi umani tramite “phage display”
Il phage display permette di creare
delle genoteche con un repertorio
di variabilità simile a quello dei
mammiferi
La genoteca è costituita da geni
VH e VL presenti in un singolo vettore
Tramite mutagenesi casuale e rimescolamento delle varie catene si puo’
aumentare enormemente la diversità
anticorpale
Aumento dell’AFFINITA’
Anticorpi ingegnerizzati
FUNZIONE
DI LEGAME
FUNZIONE
EFFETTRICE
Anticorpi ingegnerizzati
Funzioni principali dei domini anticorpali
Fab:
LEGAME
DELL’ANTIGENE
neutralizzazione, inattivazione,
antagonismo
agonismo, signaling
Fc:
LEGAME
DEL FcR
CDC, opsonizzazione
ADCC
CDC, complement-dependent cytotoxicity
ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
Possibili meccanismi citotossici mediati da anticorpi
FAGOCITI:
MACROFAGI
E NEUTROFILI
FcRn (recettore Fc neonatale): un recettore per Fc fondamentale
nella farmacocinetica degli anticorpi monoclonali
FcRn ha una struttura simile all’MHC di classe I e risulta espresso a livello della
placenta, dove media il trasporto degli Ab dalla madre al feto, e delle cellule
endoteliali.
FcRn media l’uptake delle IgG all’
interno delle cellule e permette anche
l’attraversamento delle cellule stesse.
In questo modo le IgG sono protette
dalla degradazione. Le IgG che non
legano l’FcRn non possono raggiungere
il feto e hanno un’emivita molto breve.
Le IgG murine non legano l’FcRn
umano: questo spiega la loro rapida
eliminazione nell’uomo.
(A) Struttura della regione Fc dell’IgG1 umana
con l’indicazione dei residui coinvolti nel legame
all’FcRn murino, di ratto o umano; (B) struttura
dell’FcRn di ratto con i residui coinvolti nella
formazione del complesso di ratto FcRn-Fc
Le IgG possono essere
ingegnerizzate per modulare
a piacere la persistenza a
livello plasmatico.
Ingegnerizzazione degli anticorpi terapeutici:
aspetti fondamentali
1. Diminuzione dell’immunogenicità
specie, dimensione, glicosilazione, PEG
2. Ottimizzazione delle caratteristiche farmacocinetiche
t1/2 (natura dell’Fc; glicosilazione; dimensione; PEG)
3. Ottimizzazione delle caratteristiche farmacodinamiche
legame all’antigene (mono-, bi-, tri-valente)
affinità (phage display)
anticorpi neutralizzanti, inattivanti o antagonisti: meglio no Fc
anticorpi attivanti il segnale: l’Fc può favorire il cross-linking
modulazione della funzione dell’Fc
doppia specificità (anticorpi bispecifici)
-coniugazione a tossine, radioisotopi
Proteine terapeutiche in oncologia
Anticorpi monoclonali
nudi (“naked”)
coniugati
bispecifici
terapia genica
(“intrabodies”)
Citochine
native
modificate
coniugate
Tossine
modificate
coniugate
Enzimi
modificati
Gli anticorpi terapeutici approvati in campo oncologico
Bexxar
CD20(I131)
Mouse
NHL
2003
Oncolym
HLA-Dr10
(I131)
Mouse
NHL
Phase III
Rituximab (Rituxan): il primo anticorpo terapeutico anti-tumorale
E’ un mAb anti-CD20 chimerico murino/umano.
E’ stato approvato per l’uso in pazienti affetti da NHL e da patologie autoimmunitarie.
“NAKED ANTIBODY”
Il CD20 come target terapeutico anti-tumorale
Il CD20 e’ una proteina espressa sulla superficie di cellule pre-B, cellule B mature
e per piu’ del 95% da cellule B di NHL.
Non e’ espressa da precursori staminali e plasmacellule.
Il meccanismo d’azione di rituximab non e’ stato ancora ben chiarito.
L’interazione di CD20 con questo anticorpo non porta ad internalizzazione ma all’attivazione
della trasduzione di un segnale i cui effetti finali sono inibizione
della crescita cellulare ed apoptosi.
L’Fc dell’anticorpo sembra inoltre contribuire
all’effetto reclutando gli effettori naturali per l’ADCC ed attivando la CDC.
Il rituximab e’ efficace in circa il 50% dei pazienti affetti da NHL di basso grado.
La sua tossicità e’ ridotta e limitata agli effetti collaterali tipici di in infusione, quali
febbre, brividi, nausea, dispnea,eritema,tosse, broncospasmo.
Puo’ essere associato
con successo ai chemioterapici tradizionali.
Herceptin (trastuzumab):
il primo anticorpo terapeutico per i tumori solidi
E’ un IgG1 umanizzata diretta contro Her-2 o ErbB2.
E’ approvato per l’uso
nel cancro metastatico della mammella.
“NAKED ANTIBODY”
Her-2 (ErbB2): un proto-oncogene come target antitumorale
Her-2 appartiene alla famiglia degli EGFR. Gli EGFR sono dei
receptor tyrosine kinases
(RTK) che controllano la differenziazione e proliferazione cellulare.
In cellule normali, la attività degli RTK è sotto stretto controllo.
L’espressione aumentata degli RTK oppure alterazioni funzionali dovute a mutazioni
oppure ad un’abnorme stimolazione da parte di fattori di crescita autocrini puo’
portare ad un’attivazione costitutiva di tali recettori.
Her-2 e’ espresso 100 volte di più
in cellule tumorali rispetto alle cellule non neoplastiche del 30% di pazienti affette
da cancro invasivo della mammella .
Il trastuzumab è solitamente associato a paclitaxel (tassolo)o
doxorubicina.
Campath 1H (alemtuzumab):
un anticorpo terapeutico per la leucemia linfocitica cronica (CLL)
E’ una IgG1 umanizzata diretta contro CD52.
“NAKED ANTIBODY”
La funzione di CD52 e’ ignota.
E’ espresso su linfociti T e B normali,
monociti , macrofagi e
nella maggior parte dei linfomi B e T,
ma non nei precursori staminali.
Alemtuzumab lega CD52 e attiva la
CDC e
l’ADCC.
Zevalin (90Y-ibritumomab tiuxetan):
il primo anticorpo terapeutico coniugato ad una molecola radioattiva
E’ una IgG intera murina diretta contro CD20. E’ approvato per l’uso nel NHL.
“CONJUGATED ANTIBODY”
90y
= ITTRIO 90, emette radiazioni molto potenti ed ha un’emivita di 2.5 giorni.
IL razionale della coniugazione a radioisotopi consiste nella possibilità di
aumentare il potenziale citotossico dei mAb terapeutici.
Inoltre, l’anticorpo radioattivo
può uccidere tramite la radioattività anche cellule tumorali negative per
l’antigene verso cui e’ diretto l’anticorpo.
Il fatto che il mAb sia di topo in questo caso e’ positivo, perché una lunga
permanenza in circolo potrebbe aumentare la possibilità di tossicità mediata dal
radioisotopo in organi quali il fegato e il rene.
La % di pazienti responsivi allo zevalin è significativamente superiore rispetto al
Rituximab. La tossicità, soprattutto ematologica,
è significativamente superiore per lo zevalin, anche se tali effetti sono
generalmente reversibili.
Mylotarg (Gemtuzumab Ozogamicin)
un nuovo farmaco per la leucemia mieloide acuta
(AML)
“CONJUGATED ANTIBODY”
(RITIRATO DAL MERCATO NEL 2010)
Il CD33 come target del
Mylotarg
Il CD33 come target terapeutico anti-tumorale
Il CD33 e’ una proteina di adesione di 67 kDa capace di legare
molecole contenenti acidi sialici. E’ espressa sia su cellule normali
che tumorali, ma non sulle cellule staminali. Piu’ dell’80% dei
pazienti affetti da AML esprime CD33 nei blasti leucemici.
Il trattamento con anti-CD33 può determinare neutropenia e
trombocitopenia, che sono tuttavia spesso seguite da recupero
ematologico dovuto al fatto che CD33 non e’ espresso sui
precursori staminali.
L’interazione di CD33 con l’anticorpo specifico non attiva un segnale
nella cellula (e pertanto l’anti-CD33 da solo non ha valore
terapeutico) ma determina la rapida internalizzazione del complesso
in vescicole lisosomiali a pH acido.
Calicheamicine
Sono una famiglia di potenti agenti citotossici appartenenti
alla classe delle enedine. Tali composti sono prodotti da un
microrganismo presente nel suolo, il Micromonospora echinospora.
La -calicheamicina è la molecola più rappresentativa di tale classe.
Il Mylotarg contiene un derivato della -calicheamicina,
l’N-acetil --calicheamicina dimetil idrazide.
Tale molecola e’ in realta’ un profarmaco che
viene liberato dall’anticorpo solo in ambiente acido.
Somministrate da sole, presentano un basso IT ed alta tossicità.
Il meccanismo di citotossicità è mediato dal legame di tali
molecole al “minor groove” del DNA in maniera abbastanza
sequenza-specifica con conseguente rottura in più punti
della doppia catena del DNA causando morte, sia per apoptosi
che non per apoptosi.
Gli anticorpi terapeutici approvati in campo oncologico
Bexxar
CD20(I131)
Mouse
NHL
2003
Oncolym
HLA-Dr10
(I131)
Mouse
NHL
Phase III
Anticorpi bispecifici in oncologia
Caratteristiche ideali:
1. Elevata selettività ed affinità per il
target tumorale
2. Legame monovalente al “triggering
receptor”; cross-linking solo quando si
è legata anche la controparte al target
3. Non deve avere porzioni Fc
4. Deve essere di origine umana
5. Deve essere sufficientemente piccolo
per penetrare nel tumore se questo è
solido
Anticorpi bispecifici in oncologia
Triggering receptors:
FcRI
FcRII
FcRIII
FcRI
(TCR)
Tumor surface molecules:
Folate-binding protein (ovarian cancer cells)
Her-2
CD20
RISULTATI DEGLI STUDI CLINICI:
-Tossicità negli studi iniziali
-Scarsa efficacia
-(Costi ancora proibitivi)
Intrabodies
Anticorpi terapeutici in oncologia: prospettive future
1. Identificare target sempre piu’ selettivi
2. Approfondire le conoscenze del rapporto tra la struttura,
la farmacodinamica e la farmacocinetica degli Abs
3. Ottimizzare gli anticorpi bispecifici
3. Rendere praticabile la “gene therapy” con gli anticorpi
4. Potenziare lo sviluppo dei “piccoli” anticorpi per i tumori
solidi
5. Abbassare i costi sfruttando la produzione nei batteri
Proleukin (aldesleukin):
la prima citochina ingegnerizzata in oncologia
Modello del complesso IL-2/IL-2R
Proleukin (aldesleukin):
la prima citochina ingegnerizzata in oncologia
Gli effetti di IL-2
Proleukin (rIL-2, aldesleukin):
la prima citochina ingegnerizzata in oncologia
E’ una forma ricombinante dell’IL-2 umana (15 kDa) prodotta nell’E. coli.
Si distingue dall’IL-2 nativa perche’ non è glicosilata, manca del residuo
di Ala iniziale, ed ha una Ser al posto di una Cys in posizione 125.
Tali modifiche comportano un diminuita tendenza all’aggregazione ed
un’aumentata biodisponibilità.
E’ indicata per l’uso nel carcinoma renale metastatico e nel melanoma.
I dosaggi utilizzati sono molto elevati (6 x 105U/Kg in 15 min). In alcuni
pazienti un unico ciclo di trattamento risulta efficace.
La sua somministrazione è associata a grave tossicità cardiovascolare
associata ad aumento della permeabilità capillare (sindrome di perdita
capillare) con conseguente perdita del tono vascolare e fuoriuscita di di
fluido e proteine plasmatiche nello spazio extravascolare. Tale tossicità
può tradursi in ipotensione, ridotta perfusione degli organi e morte.
Inoltre, la proleukin puo’ indurre infezioni disseminate dovute
a compromissione della funzione dei neutrofili.
Ontak (denileukin diftitox, DAB 389 IL-2)
E’ una proteina di fusione
costituita da una forma
troncata di DT e da IL-2
umana.
E’ citotossica per cellule
che esprimono il recettore
ad alta o intermedia affinità
per IL-2.
E’ indicato per forme
avanzate
di linfoma cutaneo T cellulare
(CTCL).
La responsività è pari a 36%
ad alti dosaggi.
La tossicità è ridotta
rispetto
a proleukin anche se in alcuni
pazienti compare la sindrome
da perdita capillare.
Struttura schematica delle immunotossine
Tossine vegetali:
olotossine, costituite
da una catena A catalitica
e una catena B di legame,
oppure emitossine, costituite
dalla sola catena A
Tossine batteriche:
Sono costituite da catene
singole che contengono sia
il sito catalitico che di
legame
Meccanismi di intossicazione cellulare da parte di tossine
Proteine di fusione per tumori cerebrali
Il recettore per la transferrina è espresso su cellule
cerebrali neoplastiche ma non normali.
454A12-rRA:
proteina di fusione costituita da un anticorpo anti -recettore
per la transferrina e la catena A della ricina.
50% responsività (terapia intraventricolare)
Tf-CRM107:
proteina di fusione costituita dalla transferrina umana e
una forma troncata della DT.
50% responsività
Oncaspar (pegaspargase):
un enzima per la leucemia linfoblastica acuta
Nel 1953 fu dimostrato che il siero di cavia possiede attività antileucemica grazie
alla L-asparaginasi. La L-asparaginasi converte la L-asparagina in acido aspartico e
ammoniaca.
Cellule normali producono L-asparagina in quantità sufficienti per la sintesi
proteica.
Cellule tumorali quali quelle leucemiche linfoblastiche acute richiedono invece
spesso sorgenti esogene di tale amino acido.
La somministrazione di L-asparaginasi depriva tali cellule da L-asparagina causando
apoptosi.
L’asparaginasi (Elspar) è prodotta in E. coli ed ha un t1/2 di 30 ore.
Induce ipersensitività con alta frequenza (fino al 20%, puo’ essere anche fatale).
La pegilazione dell’asparaginasi di E. coli ha permesso sia di aumentare
significativamente
il t1/2 (t1/2 pegaspargase = 15 giorni) sia di diminuire l’incidenza di ipersensitività
(<5%).
La pegaspargase viene somministrata in associazione ad altri farmaci antitumorali.
Tossicità: epatotossicità, inibizione della sintesi di fattori della coagulazione
(emorragie),
neurotossicità, tossicità pancreatica.