Apri Abstract - Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte

PROGETTO DI RICERCA REGIONALE
Titolo del progetto:
Progetto di indagine per la presenza di fumonisine in alimenti ad uso zootecnico e lo sviluppo
di metodi analitici per l’identificazione di additivi e sostanze vietate negli alimenti
Responsabile Scientifico: Dott.ssa Maria Cesarina Abete
Ricerca finanziata da: Regione Piemonte
Sintesi
1) Ricerca di Fumonisine nei mangimi: screening con metodo ELISA.
Obiettivi: Le varie categorie di micotossine a tutt'oggi identificate, un crescente rilievo vanno assumendo
le fumonisine. Si tratta di sostanze altamente tossiche per gli animali ed in grado altresì di esplicare una
consistente azione lesiva nei confronti dell'uomo, secondo quanto evidenziato dagli svariati studi
recentemente condotti al riguardo. Le fumonisine risultano essere sintetizzate da miceti in massima parte
riferibili al genere Fusarium. Regione Piemonte nell’ambito del piano di sorveglianza ha finanziato il
laboratorio chimico del C.Re.A.A per eseguire un’indagine di screening sulla presenza delle fumonisine
B1 e B2 in alimenti zootecnici. I dati forniti da questo studio sono espressi come somma di entrambe le
molecole.
Metodologia: Il metodo utilizzato per eseguire le analisi sui mangimi segue le indicazioni del kit
immunoenzimatico della ditta Tecna, “Fumonisine ELISA”.
Sono stati valutati quattro kit
immunoenzimatici ed è stato scelto quello commercializzato dalla ditta Tecna poiché permettendo
un’intervallo di quantificazione più ampio non richiede ulteriori diluizioni e ripetizioni di analisi sui
campioni. Il saggio immunoenzimatico utilizzato è di tipo quantitativo e i risultati vengono acquisiti per
mezzo di un lettore colorimetrico per micropiastre .
Risultati e Conclusioni: Dai dati ottenuti si evince l’importanza di tenere sotto controllo le specie
animali più sensibili alle fumonisine, (suini ed equini), prevedendo un piano di monitoraggio regionale
intensificato rispetto alla programmazione del PNAA 2006 che prevedeva il prelievo e l’analisi di solo
20 campioni per regione.Inoltre, anche se solo un campione su 64 è risultato al di sotto del limite di
quantificazione del kit (0.42 mg/kg), sarebbe opportuno nell’ottica di soddisfare la Raccomandazione
2006/576/CE del 17 agosto 2006, ( in vigore dal 1° ottobre 2007), prevedere la messa a punto e la
validazione di una metodica strumentale di conferma.
2) Sviluppo e validazione di un metodo di prova per la determinazione di Amprolium negli
alimenti ad uso zootecnico: conferma con LC-MSI.
Obiettivi. La coccidiosi è una malattia parassitaria largamente diffusa, sia negli allevamenti zootecnici
che negli animali da affezione, ed è anche una delle molte malattie che i polli possono contrarre. È
causata da un protozoo, un parassita del genere Eimeria, e causa la disgregazione delle cellule intestinali
dando luogo ad una perdita di peso. Le coccidiosi vengono contrastate tramite sistemi di profilassi, allo
scopo di evitare che gli animali contraggano, seppure in forma lieve, l’infestazione. Si utilizzano quindi
dei coccidiostatici che vengono addizionati ai mangimi. L’Amprolium, cloroidrato del cloruro di 1-[(4ammino-2-propil-5- pirimidinil)metil]-2-plicolinio, è un coccidiostatico ad ampio spettro d’azione
ancora oggi in uso. La molecola presenta una struttura simile a quella della Tiamina (vitamina B1). Lo
scopo della ricerca è stato quello di sviluppare un metodo di conferma più sensibile di quello in uso, che
permettesse di identificare e quantificare questa molecola, affiancando all’HPLC uno spettrometro di
massa, e di validare il metodo sviluppato.
Metodologia: è stato sviluppato e validato un metodo HPLC MS/MS
Risultati e Conclusioni: Il metodo sviluppato è utile sia per lo screening che per la conferma nella
PROGETTO DI RICERCA REGIONALE
determinazione di Amprolium nei mangimi Il protocollo descritto è vantaggioso per la sua semplicità, la
rapidità e per i costi economici dell'analisi. Risponde ai requisiti dell'ISO 17025 ed è appropriato per
l'analisi ufficiale quantitativa. L'assenza di passaggi intermedi di purificazione permette un recupero
eccellente senza l’aumentodel rumore di fondo, e di conseguenza, del valore di LOQ. In seguito a questi
risultati si può presumere di sviluppare un metodo di multiresiduo per determinarecontemporaneamente
l’Amprolium e gli altri coccidiostatici proibiti, come nicarbazina, metilclorpindolo e dimetridazolo, in
mangimi per polli.
Obiettivi: Le tossine T-2 ed HT-2 fanno parte della famiglia dei Tricoteceni del gruppo A. La
produzione di tali tossine è dovuta a Fusarium sporotrichioides, una specie fungina dotata di una debole
attività parassitaria con scarso sviluppo in campo, infatti i tricotecenidi gruppo A sono molto meno
diffusi nelle derrate alimentari rispetto a quelli di gruppo B e rappresentano un problema solo per le
granaglie umide lasciate in campo in autunno o per le varietà invernali. Sono comunemente riscontrate
nel frumento, nel mais, nell’orzo, nell’avena, nella segale e nei prodotti come birra e pane. I tricoteceni
del gruppo B sono prodotti da funghi del genere Fusarium graminearum e culmorum. Si sviluppano in
campo con un clima temperato fresco, piovoso e umidità superiore al 20%, mentre l’umidità inferiore al
18% ne blocca la sintesi. Colpiscono soprattutto il frumento. La tossina T-2 è molto tossica per suini,
polli e ruminanti in cui provoca astenia, riduzione della performance, lesioni orali, rallentamento della
velocità di crescita, rifiuto del cibo, leucopenia, depressione, diarrea, enteriti, coagulopatie, atassia,
ulcerazioni non specifiche del tratto gastrointestinale, riduzione dell’immunità umorale e sindromi
emorragiche. il CReAA ha formulato un progetto pilota, da svolgersi nell’ambito della Regione
Piemonte, per eseguire un’indagine di screening sulla presenza delle micotossine T2 e HT2 (tricoteceni)
negli alimenti zootecnici, che possa servire da traccia per successive indagini, da svolgersi sull’intero
territorio nazionale. Lo scopo della ricerca è stato quello di condurre un’indagine sul campo degli
alimenti ad uso zootecnico in modo da fornire un quadro indicativo della contaminazione delle tossine
T-2 ed HT-2 in Piemonte, in particolare nelle province di Torino e Cuneo. Il campionamento ha previsto
l’analisi mediante test ELISA di mangimi completi prelevati da allevamenti di polli del territorio di
Torino e Cuneo. Sono pervenuti presso i nostri laboratori 173 campioni così distribuiti: 125 dalla
provincia di Cuneo e 48 dalla provincia di Torino.
Metodologia: Il metodo analitico utilizzato per eseguire le analisi sui mangimi segue le indicazioni del
kit immunoenzimatico della ditta Tecna, “T2 toxin plate kit, per tossine T-2 HT-2, quantitativo, ELISA,
96 det.”
Risultati e Conclusioni: Il kit immunoenzimatico ELISA della Tecna, utilizzato per questo lavoro, come
campo di applicazione, ha fornito risultati soddisfacenti e pertanto può essere impiegato per le analisi di
screening. Dai dati ottenuti si evince che la contaminazione da tossine T-2 ed HT-2 è dell’ordine dei ppb
(µg/Kg) con una media di 56 µg/Kg sul territorio della regione Piemonte e di 35 µg/Kg in Valle d’Aosta.
Dalle informazioni disponibili sembra che la presenza di queste tossine nei prodotti destinati
all’alimentazione animale potrebbe destare preoccupazione. Quindi è di primaria importanza raccogliere
ulteriori dati effettuando ricerche supplementari estese a tutte le regioni d’Italia, considerando che la
crescita delle micotossine è dettata dalle diverse condizioni climatiche.
Parole chiave: Fumonisine, ELISA; Amprolium, LC-MSI, mangimi, validazione