istruzioni operative

BProbeTec ET
Confezione di reagenti per l’identificazione diretta del
complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB)
Italiano
USO PREVISTO
Il pacco reagenti BD ProbeTec ET per l’identificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB), per
uso con il sistema BD ProbeTec ET, utilizza una tecnica di Strand Displacement Amplification (SDA) per
l’identificazione qualitativa diretta del DNA del complesso Mycobacterium tuberculosis da campioni di clinici
decontaminati e digeriti delle vie respiratorie, come l’espettorato, l’espettorato indotto, i liquidi di lavaggio
bronchiale ed altri campioni delle vie respiratorie.
Il dosaggio BD ProbeTec ET per l’identificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) trova
impiego come analisi diretta per la valutazione di campioni prelevati da pazienti con sospetta infezione da
tubercolosi. Vengono considerati non trattati i pazienti che (1) non hanno mai ricevuto una terapia anti-tubercolare;
(2) non hanno ricevuto detta terapia negli ultimi 12 mesi oppure; (3) hanno ricevuto meno di 7 giorni di terapia.
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
Circa un terzo della popolazione mondiale è infettata da Mycobacterium tuberculosis e presenta un rischio del 10%
di sviluppare la malattia durante il corso della vita.1,2 La tubercolosi uccide circa 3 milioni di persone all’anno in tutto
il mondo, è quindi la causa principale di morte da malattie infettive.1,3 La crescita lenta dell’organismo M. tuberculosis
ritarda la diagnosi clinica e il trattamento della malattia e ne favorisce la diffusione. Secondo le raccomandazioni dei
Centers for Disease Control and Prevention degli USA, occorre adoperarsi affinché i laboratori adottino i metodi più
rapidi a disposizione per le analisi micobatteriche diagnostiche.3 L’impiego di tecnologie di amplificazione del DNA,
come la tecnica di Strand displacement amplification (SDA) consente l’individuazione rapida e l’identificazione del
DNA del complesso M. tuberculosis in campioni clinici, agevolando di conseguenza interventi terapeutici tempestivi.
Il pacco reagenti per il complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) viene usato con il sistema BD ProbeTec ET. Il
sistema di analisi utilizza una tecnologia SDA omogenea come metodo di amplificazione e un trasferimento di
energia fluorescente (ET) come metodo di rilevamento della presenza del complesso Mycobacterium tuberculosis
direttamente da campioni decontaminati e digeriti delle vie respiratorie (sedimenti NALC-NaOH). Il complesso
M. tuberculosis comprende M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti.4,5
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il dosaggio del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) BD ProbeTec ET si basa sulla simultanea amplificazione e
determinazione del DNA target mediante un primer di amplificazione e una sonda marcata con indicatore
fluorescente.6-8 I reagenti SDA sono essiccati in due micropozzetti monouso separati. Il sedimento NALC-NaOH
preparato viene aggiunto alla striscia di micropozzetti di priming che contiene i primer di amplificazione, le sonde
marcate con indicatore fluorescente e gli altri reagenti. Dopo l’incubazione, la miscela reattiva viene trasferita nella
striscia di micropozzetti di amplificazione che contiene due enzimi (una DNA polimerasi e una endonucleasi di
restrizione) necessari per l’SDA. I micropozzetti di amplificazione vengono sigillati per evitare la contaminazione e
incubati in un lettore fluorescente termocontrollato che esegue il monitoraggio della reazione per la formazione di
prodotti amplificati.
Ciascuna reazione include la co-amplificazione e il riconoscimento di un controllo interno di amplificazione (Internal
Amplification Control - IAC). La funzione di questo controllo è di confermare la validità della reazione di
amplificazione e di identificare una possibile inibizione da parte del campione analizzato. I risultati vengono riportati
mediante un algoritmo come positivi, negativi o indeterminati.
REAGENTI E MATERIALI
Ogni pacco reagenti BD ProbeTec ET per l’identificazione del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) include
quanto segue.
Micropozzetti di priming per DTB, 3 x 32;
4 oligonucleotidi ≥ 7,6 pmol; DNA umano ≥ 6 µg; dNTP ≥ 37,6 nmol; sonde indicatrici ≥ 30 pmol; oligonucleotide
sintetico ≥ 10.500 copie.
Micropozzetti di amplificazione per DTB, 3 x 32;
Enzima di restrizione ≥ 25,5 unità; DNA polimerasi ≥ 8 unità; dNTPS ≥ 10 nmol.
Accessori: 10 coperchi, 8 buste per rifiuti, 16 sigillanti.
Ogni kit BD ProbeTec ET per la preparazione dei campioni per l’identificazione diretta del complesso Mycobacterium
tuberculosis (DTB) include quanto segue.
Tampone di lavaggio per DTB 1 - 225 mL di soluzione contenente urea, tampone CAPS, dimetilsolfossido, glicerolo e
idrossido di sodio.
Tampone di lisi per DTB 2 - 50 mL di soluzione contenente idrossido di potassio.
Tampone di neutralizzazione per DTB 3 - 150 mL di soluzione contenente bicina, idrossido di potassio,
dimetilsolfossido, glicerolo e 0,03% di Proclin (conservante).
Ogni set di controlli BD ProbeTec ET per l’identificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB)
include quanto segue.
Controllo positivo per DTB - DNA di scroto essiccato di salmone ≥ 5 µg e ≥ 750 copie di oligonucleotide sintetico per
reazione ≥ 5250 copie in tutto.
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Controllo negativo per DTB - DNA di scroto di salmone ≥ 5 µg.
Strumenti, attrezzatura e materiali d’uso e consumo - Strumento BD ProbeTec ET e relativa piastra, incubatore per
riscaldamento e priming BD ProbeTec ET, forno BD ProbeTec ET, bagno ad ultrasuoni BD ProbeTec ET e relativo
inserto, pipettatore e alimentatore BD ProbeTec ET, cestello di provette portacampioni da 2 mL, supporto trasparente
per pipettaggio, provette portacampioni da 2 mL e relativi tappi, tappi da 2 mL e kit di accessori BD ProbeTec ET,
tamponi CultureSwab EZ.
Materiali richiesti ma non forniti - Microcentrifuga, con rotori standard a tenuta di aerosol, in grado di raggiungere
12.200 x g (come la microcentrifuga Eppendorf Modello 5417C) vortex, guanti monouso, pipette con puntali antiaerosol in grado di dispensare volumi da 100 µL, 500 µL, 600 µL e 1 mL, ipoclorito di sodio all’1% (v/v) con Alconox*,
recipienti sterili adatti per contenere le aliquote dei 3 tamponi per DTB, cronometro, disinfettante tubercolicida,
garza/compresse assorbenti.
*Mescolare 200 mL di candeggina con 800 mL di acqua tiepida. Aggiungere 7,5 g di Alconox e mescolare. Preparare
una miscela fresca ogni giorno.
Requisiti di preparazione e conservazione - I pacchi reagenti per DTB possono essere conservati a 2–33 °C. Non usare
dopo la data di scadenza i pacchi reagenti non aperti. Una volta aperta la busta, i micropozzetti sono stabili per
4 settimane, se opportunamente sigillati, o fino alla data di scadenza, a seconda di quale delle due si verifica prima.
Non congelare.
I reagenti di preparazione per DTB possono essere conservati a 2–33 °C. Non usare i reagenti dopo la data di
scadenza. Non congelare.
I controlli per DTB possono essere conservati a 2–33 °C. Non usare i controlli dopo la data di scadenza. Non
congelare.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Per uso diagnostico in vitro.
1. Non sono state dimostrate le prestazioni di questo test per l’identificazione del complesso M. tuberculosis da
campioni non delle vie respiratore, tra cui il sangue, il liquido cerebrospinale, le feci o le urine. Le prestazione
del dosaggio BD ProbeTec ET per DTB non sono state valutate su campioni preparati con metodi diversi da quelli
descritti in questo foglio illustrativo.
2. Le fasi di manipolazione e preparazione dei campioni durante il processo di inattivazione termica devono essere
eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II. La centrifugazione dei campioni prima
dell’inattivazione termica deve essere eseguita esclusivamente con il rotore a tenuta di aerosol. Questo rotore
deve essere aperto esclusivamente nell’armadio di sicurezza biologica. Usare esclusivamente il rotore standard
per la centrifugazione dei campioni dopo l’inattivazione termica fuori dell’armadio di sicurezza biologica.
3. Il DNA di placenta umana è uno dei componenti dei micropozzetti di priming. Questi reagenti devono essere
maneggiati come sostanze infettanti, in osservanza delle procedure di laboratorio stabilite9,10,11 e/o delle
direttive del presidio di utilizzo.
4. Sottoporre a coltura tutti i campioni preparati per determinare l’eventuale presenza di micobatteri diversi da
quello della tubercolosi (MOTT), eseguire un test di suscettibilità antimicobatterica, determinare le sottospecie
del complesso M. tuberculosis e/o valutarne la vitalità.
5. I campioni possono contenere microrganismi patogeni, inclusi il virus dell’epatite B e il virus dell’immunodeficienza umana (HIV). Di conseguenza, i reagenti devono essere maneggiati come sostanze infettanti, in
osservanza delle procedure di laboratorio stabilite9,10,11 e/o delle direttive del presidio di utilizzo.
6. Il tampone di lavaggio per DTB 1 e il tampone di neutralizzazione per DTB 3 contengono dimetilsolfossido
(DMSO), una sostanza dannosa che comporta il rischio di effetti irreversibili per inalazione, contatto con la pelle
o ingestione. Evitare il contatto con gli occhi. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e
abbondantemente con acqua e consultare un medico. In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente e
abbondantemente con acqua.
7. Il tampone di lavaggio per DTB 1 e il tampone di lisi per DTB 2 sono fortemente alcalini. Evitare il contatto con
la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua. Se
non viene trattata, l’area esposta al contatto è soggetta ad ustione.
8. Non scambiare o mescolare i micropozzetti, i controlli o i tamponi di preparazione provenienti da kit con numeri
di lotto diversi.
9. Per eliminare i prodotti usati, come i puntali per pipette, le provette portacampioni, i copri-priming e tutti gli
articoli monouso, attenersi alle disposizioni stabilite dal laboratorio.
10. Per il trasferimento dei campioni trattati ai micropozzetti di priming e per trasferire i campioni dai micropozzetti
di priming ai micropozzetti di amplificazione, usare solo pipette e puntali per pipette BD ProbeTec ET.
11. Una volta aperte, le buste dei reagenti che contengono micropozzetti di priming e micropozzetti di
amplificazione non utilizzati DEVONO essere richiuse con attenzione. Prima di richiudere le buste dei reagenti,
assicurarsi che contengano il sacchetto di essiccante.
12. Prima del trasferimento dall’incubatore per riscaldamento e priming BD ProbeTec ET allo strumento BD ProbeTec
ET, la piastra che contiene i micropozzetti di amplificazione DEVE essere opportunamente sigillata con il
sigillante di amplificazione. La chiusura a tenuta è necessaria per evitare la contaminazione dello strumento e
dell’area di lavoro con i prodotti di amplificazione. Non rimuovere mai dai micropozzetti il materiale sigillante.
13. Qualora una piastra per analisi superi 6 colonne (>48 campioni e controlli), per evitare il rischio di
contaminazione è necessario usare un foglio INTERO di sigillante di amplificazione.
14. Per evitare di contaminare l’ambiente di lavoro con i prodotti di amplificazione, una volta completata l’analisi
usare le buste dei rifiuti fornite per smaltire i micropozzetti di amplificazione.
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15. Per evitare la contaminazione crociata dei campioni, CAMBIARE I GUANTI quando specificato durante la
preparazione dei campioni e la procedura di dosaggio. Se i guanti vengono a contatto con i campioni, cambiarli
immediatamente per evitare la contaminazione di altri campioni.
16. Nel caso di contaminazione dell’area di lavoro o dell’attrezzatura con il campione preparato, pulire
accuratamente le superfici contaminate con ipoclorito di sodio 1% (v/v) contenente Alconox e sciacquare
abbondantemente con acqua deionizzata/distillata. Prima di proseguire, lasciare asciugare completamente le
superfici.
17. Pulire ogni giorno l’intera area di lavoro – le superfici dei banchi e degli strumenti – con ipoclorito di sodio
all’1% contenente Alconox. Sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata/distillata. Prima di procedere
ad altre analisi, lasciare asciugare completamente le superfici.
18. I micropozzetti di priming che contengono liquido residuo, dopo il trasferimento del liquido dai micropozzetti
di priming a quelli di amplificazione, costituiscono una fonte di contaminazione del target. Prima di eliminare i
micropozzetti di priming, sigillarli accuratamente con il sigillante per piastra.
19. Non introdurre le dita o le mani nel bagno ad ultrasuoni quando le onde ultrasonore sono attivate (ON), in
quanto questo può provocare una sensazione spiacevole e causare irritazione cutanea. È anche possibile che si
verifichino danni prolungati a carico del tessuto molle.
20. Non usare un termometro a mercurio per verificare la temperatura del bagno ad ultrasuoni; utilizzare il
termometro digitale appositamente fornito.
21. In caso di situazioni insolite, come un versamento nello strumento BD ProbeTec ET o una contaminazione di
DNA impossibile da eliminare con la pulizia, rivolgersi all’assistenza tecnica.
PRELIEVO E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI
Tutti i campioni devono essere prelevati e trasportati seguendo le disposizioni dei CDC, del Clinical Microbiology
Procedures Handbook (Manuale di procedure microbiologiche cliniche) o il manuale delle procedure fornito dal
laboratorio utilizzato.1,8
DIGESTIONE, DECONTAMINAZIONE E CONCENTRAZIONE
Per la preparazione dei campioni, usare il metodo NALC-NaOH raccomandato nella pubblicazione dei CDC Public
Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory.1 Alternativamente, usare il kit BBL MycoPrep per la
preparazione di campioni micobatterici (vedere “Disponibilità”).
NOTA - Se l’analisi con il dosaggio BD ProbeTec ET non viene seguita immediatamente, è possibile conservare i
sedimenti NALC/NaOH nel modo seguente. (a) A 2–8 ºC fino a 5 giorni. (b) Per oltre 5 giorni, congelare a -20 ºC o a
temperatura inferiore (senza ciclo temporizzato) fino a 3 mesi. Prima della preparazione per il dosaggio BD ProbeTec
ET per DTB, i sedimenti congelati devono essere scongelati a temperatura ambiente.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
A. Preparazione del campione BD ProbeTec ET per DTB – Fuori dall’armadio di sicurezza biologica (BSC)
1. Prima dell’uso, i tamponi per la preparazione del campione devono essere a temperatura ambiente e
mescolati accuratamente. Per evitare la contaminazione dei tamponi di stock, dispensare volumi sufficienti di
tampone in contenitori sterili, opportunamente etichettati come segue.
a. Tampone di lavaggio per DTB 1 - 1 mL per ciascun sedimento NALC-NaOH da preparare, più 1–2 mL extra
per pipettare.
b. Tampone di lisi per DTB 2 - 0,1 mL per ciascun sedimento NALC-NaOH e rispettivi controlli da preparare,
più 0,5–1 mL extra per pipettare.
c. Tampone di neutralizzazione per DTB 3 - 0,6 mL per ciascun sedimento NALC-NaOH e rispettivi controlli
da preparare, più 0,5–1 mL extra per pipettare.
d. Per evitare la contaminazione dei tamponi, non versare di nuovo nel flacone il tampone residuo.
2. Usare le etichette fornite con le provette portacampioni per etichettare una provetta da 2 mL per ciascun
sedimento NALC-NaOH da preparare.
3. Stappare le provette portacampioni e dispensare in ciascuna provetta 1,0 mL di tampone di lavaggio per
DTB 1. Richiudere le provette con il tappo.
4. Trasferire le provette nell’armadio di sicurezza biologica.
B. Preparazione dei campioni di sedimento NALC-NaOH per il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB – Dentro l’armadio
di sicurezza biologica
NOTA - Prima di eseguire la decantazione dei campioni, preparare un contenitore per rifiuti liquidi a rischio
biologico.
1. Agitare con vortex per 5 secondi il primo sedimento NALC-NaOH.
2. Usando pipettatore con un nuovo puntale anti-aerosol, trasferire 500 µL di sedimento NALC-NaOH nella
provetta portacampioni debitamente etichettata contenente 1 mL di tampone di lavaggio per DTB 1.
3. Richiudere bene la provetta.
4. Ripetere i passaggi 1–3 per ciascun sedimento NALC-NaOH.
5. CAMBIARE I GUANTI.
6. Agitare con vortex per 5 secondi ogni provetta portacampioni.
7. Collocare ciascuna provetta nel rotore a tenuta di aerosol e fissare saldamente il coperchio a tenuta di
aerosol. Pulire l’esterno del rotore con teli o garze imbevuti di soluzione antibatterica.
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8. Trasferire nella microcentrifuga il rotore a tenuta di aerosol. Centrifugare i campioni a 12.200 x g per
3 minuti. NOTA - È necessario seguire le condizioni di centrifugazione specificate, in quanto una
centrifugazione insufficiente può dar luogo a risultati falsi negativi.
9. Immediatamente dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il rotore dalla microcentrifuga (senza
disturbare la guarnizione di tenuta per aerosol) e rimetterlo nell’armadio di sicurezza biologica.
10. Togliere il coperchio a tenuta di aerosol e rimuovere immediatamente i campioni dal rotore, avendo cura di
ridurre al minimo la miscelazione del supernatante e del sedimento.
11. Stappare la prima provetta e decantare il supernatante nel contenitore per rifiuti liquidi nell’armadio di
sicurezza biologica. Esercitare un movimento regolare di inversione e terminare battendo leggermente verso
il basso la provetta capovolta. NOTA - È possibile che il sedimento si separi in un secondo tempo. Proseguire
subito con i passaggi 9, 10 e 11.
12. Richiudere bene con il tappo la provetta e collocarla nel cestello di provette portacampioni da 2 mL.
13. Ripetere i passaggi 11 e 12 per tutti i campioni.
14. CAMBIARE I GUANTI.
C. Riscaldamento dei campioni – Forno BD ProbeTec ET
NOTA - Assicurarsi che le provette portacampioni siano ben chiuse con il tappo.
Prima di riscaldare i campioni nel forno, esaminare visivamente i tappi delle provette per accertarsi che
gli o-ring siano posizionati correttamente. Sostituire il tappo se l’o-ring manca o appare deformato.
Per istruzioni dettagliate, incluse le avvertenze e le precauzioni pertinenti, consultare il Manuale d’uso
del sistema BD ProbeTec ET.
1. Mettere nel forno il cestello di provette portacampioni da 2 mL e chiudere lo sportello.
2. Selezionare RUN #01 (Ciclo n. 01). Premere “OK”.
3. Premere “START” (Avvio) per inizializzare il ciclo di analisi.
4. Quando inizia il ciclo di riscaldamento, eseguire i seguenti passaggi.
a. Per preparare il bagno ad ultrasuoni BD ProbeTec ET procedere come segue.
(1) Introdurre nella vasca l’inserto per bagno ad ultrasuoni.
(2) Riempire il bagno ad ultrasuoni con acqua calda di rubinetto, fino alla riga indicatrice di “massimo”.
(NOTA - Non usare acqua deionizzata.)
(3) Impostare la temperatura a 65 ºC e accendere l’incubatore.
(4) Erogare energia ultrasonica per 60 minuti (impostazione predefinita) tenendo il bagno chiuso con il
coperchio.
b. Fissare il rotore standard nella microcentrifuga.
5. Trascorsi 15 minuti di ciclo di riscaldamento, controllare e registrare il valore indicato dal termometro esterno
del forno, per accertarsi che la temperatura sia ≥ 95 ºC.
6. Al termine del ciclo di riscaldamento nel forno, si avverte un “bip” e il display LCD indica che il ciclo è
completo (DONE). Sbloccare la serratura dello sportello premendo il tasto OPEN DOOR (sportello aperto) e
rimuovere il cestello di provette portacampioni da 2 mL.
NOTA - A questo punto, gli eventuali micobatteri presenti nel campione non sono più vitali e le successive
manipolazioni possono essere effettuate fuori dall’armadio di sicurezza biologica. I campioni tuttavia vanno
ancora trattati come potenzialmente a rischio biologico.
D. Lisi dei campioni – Bagno ad ultrasuoni BD ProbeTec ET
AVVERTENZA - Non introdurre le dita o le mani nel bagno ad ultrasuoni quando le onde ultrasonore sono attivate
(ON), in quanto questo può provocare una sensazione spiacevole e causare irritazione cutanea. È anche possibile che
si verifichino danni prolungati a carico del tessuto molle.
AVVERTENZA - Non usare un termometro a mercurio per verificare la temperatura del bagno ad ultrasuoni;
utilizzare il termometro digitale appositamente fornito.
NOTA - Per istruzioni dettagliate, incluse le avvertenze e le precauzioni pertinenti, consultare il Manuale d’uso
del sistema BD ProbeTec ET.
1. Disporre le provette portacampioni nella microcentrifuga con il rotore standard.
2. Chiudere con il coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi.
3. Rimuovere le provette dalla centrifuga ed esaminarne i tappi alla ricerca di eventuale condensato. Se si nota
la presenza di condensato, ripetere la centrifugazione.
4. Rimettere le provette nel cestello di provette portacampioni da 2 mL.
5. Togliere il tappo dalla prima provetta. Usando un pipettatore con puntale anti-aerosol, dispensare nella
provetta 100 µL di tampone di lisi per DTB 2. Rimettere il tappo sulla provetta e stringerlo bene.
6. Ripetere la procedura per tutti i campioni usando un puntale nuovo per ogni campione.
7. CAMBIARE I GUANTI.
8. Agitare con vortex per 5 secondi ciascuna provetta.Assicurarsi che le provette siano ben chiuse con il tappo
quando vengono rimesse nel cestello di provette portacampioni da 2 mL e spingerle verso il basso in modo
che il bordo risulti alloggiato nella sagoma intagliata sul cestello. Questo serve ad orientare correttamente
le provette per la massima esposizione all’energia ultrasonica.
42
9. Interrompere (OFF) l’erogazione di energia ultrasonica e confermare che il livello dell’acqua sia sceso tra le
righe indicatrici di “minimo” e “massimo” che si trovano sull’inserto del bagno ultrasonico. Togliere o
aggiungere acqua calda di rubinetto come necessario. Controllare con il termometro digitale la temperatura
del bagno ad ultrasuoni, per accertarsi che sia pari a 65 +/- 5 °C.
10. Trasferire nell’inserto del bagno ad ultrasuoni il cestello di provette portacampioni da 2 mL. Rimettere il
coperchio sul bagno ad ultrasuoni.
11. Impostare il cronometro del bagno ad ultrasuoni su 45 minuti e accendere l’erogazione di energia
ultrasonica.
12. Al termine della sonificazione, spegnere il bagno ad ultrasuoni e rimuovere il cestello di provette
portacampioni da 2 mL. Mettere il cestello ad asciugare su dei fogli di carta assorbente.
E.
Neutralizzazione dei campioni
1. Disporre le provette portacampioni nella microcentrifuga con il rotore standard.
2. Chiudere con il coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi.
3. Rimuovere le provette dalla centrifuga ed esaminarne i tappi alla ricerca di eventuale condensato. Se si nota
la presenza di condensato, ripetere la centrifugazione.
4. Disporre le provette nel supporto trasparente per pipettaggio.
5. Togliere il tappo dalla prima provetta. Usando un pipettatore con puntale anti-aerosol, dispensare nella
provetta 600 µL di tampone di neutralizzazione per DTB 3. Rimettere il tappo sulla provetta e stringerlo
bene.
6. Ripetere la procedura per tutti i campioni usando un puntale nuovo per ogni provetta.
7. CAMBIARE I GUANTI.
8. Agitare con vortex ogni provetta per 5 secondi.
9. Centrifugare ad impulsi le provette seguendo i passaggi 1–3 descritti qui sopra.
10. Rimettere le provette nel supporto trasparente per pipettaggio.
11. I campioni trattati sono ora pronti per essere analizzati con il sistema BD ProbeTec ET.
NOTA - Se l’analisi non viene eseguita immediatamente, è possibile conservare nel modo seguente i
campioni preparati.
a) A 18–33 ºC fino a 12 ore.
b) A 2–8 ºC fino a 4 giorni. Prima dell’analisi, i campioni devono essere riscaldati nuovamente nel forno BD
ProbeTec ET.
c) Congelati a -20 ºC o a temperatura inferiore (senza ciclo temporizzato) fino a 3 mesi. Prima dell’analisi, i
campioni congelati devono essere scongelati a temperatura ambiente e riscaldati nel forno BD ProbeTec
ET.
d) Una volta riscaldate le provette (vedi i passaggi b e c qui sopra), disporle nella microcentrifuga utilizzando
il rotore standard. Chiudere con il coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi. Rimuovere le
provette dalla centrifuga ed esaminarne i tappi alla ricerca di eventuale condensato. Se si nota la
presenza di condensato, ripetere la centrifugazione. Rimettere le provette nel supporto trasparente per
pipettaggio. I campioni sono ora pronti per essere analizzati con il sistema BD ProbeTec ET.
PROCEDURA DEL TEST
A. Preparazione dello strumento
1.
Prima di iniziare il dosaggio, accendere lo strumento e lasciarlo riscaldare.
a. Per riscaldare e stabilizzare l’incubatore per riscaldamento e priming occorrono circa 90 minuti.
Il setpoint per il componente di priming dell’incubatore per riscaldamento e priming è di 72,5 °C.
Il setpoint per il componente di riscaldamento dell’incubatore è di 54 °C.
b. Lo strumento BD ProbeTec ET è controllato dal software e per riscaldarsi richiede circa 30 minuti.
2.
Prima di iniziare il dosaggio, controllare le temperature dell’incubatore per riscaldamento e priming.
Il termometro dell’unità riscaldante per priming deve indicare 72–73 °C.
Il termometro dell’unità riscaldante per riscaldamento deve indicare 53,5–54,5 °C.
3.
Controllare la temperatura visualizzata sullo schermo del BD ProbeTec ET. La temperatura indicata deve essere di
47,5–55,0 °C.
B. Pipettatore BD ProbeTec ET
Per spiegazioni dettagliate relative alle funzioni del tastierino del pipettatore BD ProbeTec ET, consultare il Manuale
d’uso del sistema BD ProbeTec ET.
Per eseguire il dosaggio per DTB, sono necessari i seguenti programmi. Programma 1 trasferisce il liquido dai
campioni preparati ai micropozzetti di priming. Programma 5 trasferisce il liquido dai micropozzetti di priming ai
micropozzetti di amplificazione.
Programmare il pipettatore nel modo seguente.
Programma 1
1.
Accendere il pipettatore. Il pipettatore emetterà un bip, lampeggerà “ZERO” e poi il numero di versione del
software ed emetterà un altro bip.
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2.
Premere il tasto blu “Prog” (Programmazione). Premere il tasto “Vol” (Volume) fino a quando viene visualizzato
“1” per selezionare il Programma 1. Premere “Enter” (Invio).
3.
Per accedere alla modalità di programmazione, tenere premuto il tasto “Prog”. Premere il tasto “Prog”, e
spingere contemporaneamente il tasto Funzione speciale con la punta di una pipetta o di una graffetta.
4.
Premere “Fill” (Riempimento). Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 200. Premere “Enter” (Invio).
5.
Premere “Disp” (Dispensazione). Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 150. Premere “Enter” (Invio).
6.
Premere “Purge” (Spurgare). Premere “Enter” (Invio).
7.
Premere “Enter” (Invio) una seconda volta per memorizzare il programma e uscire. Un “bip” dovrebbe indicare
che la programmazione è completa.
8.
Verificare il programma premendo il trigger per avanzare da ciascun passaggio al successivo e impostare per
ciascun passaggio le velocità di aspirazione/dispensazione usando il tasto “Vol”. Ad ogni passaggio appare
l’indicatore di velocità. Usare il tasto “Vol” per regolare l’indicatore di velocità in modo che visualizzi
2 quadratini per i passaggi di “Fill” (Riempimento) e “Disp” e 3 quadratini per il passaggio “Purge” (Spurgare).
Programma 5
1.
Premere il tasto “Prog”. Premere il tasto “Vol” fino a quando viene visualizzato “5” per selezionare il
Programma 5. Premere “Enter” (Invio).
2.
Per accedere alla modalità di programmazione, tenere premuto il tasto “Prog” e spingere contemporaneamente
il tasto Funzione speciale con la punta di una pipetta o di una graffetta.
3.
Premere “Fill” (Riempimento). Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 100. Premere “Enter” (Invio).
4.
Premere “Disp”. Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 100. Premere “Enter” (Invio).
5.
Premere “Mix”. Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 50. Premere “Enter” (Invio).
6.
Premere “Enter” (Invio) una seconda volta per memorizzare il programma e uscire. Un “bip” dovrebbe indicare
che la programmazione è completa.
7.
Verificare il programma premendo il trigger per avanzare da ciascun passaggio al successivo e impostare per
ciascun passaggio le velocità di aspirazione/dispensazione/miscelazione usando il tasto “Vol”. Ad ogni passaggio
appare l’indicatore di velocità. Usare il tasto “Vol” per regolare l’indicatore di velocità in modo che visualizzi
2 quadratini per le funzioni di aspirazione e dispensazione. Usare il tasto “Vol” per regolare la velocità di
miscelazione in modo che visualizzi 3 quadratini.
Revisione del programma
Prima di iniziare la procedura, accendere il pipettatore per rivedere tutti i programmi. Per rivedere i programmi,
accendere il pipettatore. Premere il tasto blu “Prog”. Premere il tasto “Vol” (Volume) fino a quando viene
visualizzato il numero del programma da rivedere. Premere il tasto “Enter” (Invio). Usare il trigger del pipettatore
per avanzare nel programma da un passaggio al successivo.
Programma 1 - Questo programma aspira 200 µL e dispensa 150 µL. Il display del pipettatore deve visualizzare
quanto segue.
Fill 200 µL – S II
Dispense 150 µL – S II
Purge - S III
Rivedere nello stesso modo il Programma 5.
Programma 5 - Questo programma aspira 100 µL; dispensa 100 µL e miscela 50 µL tre volte. Il display del pipettatore
deve visualizzare quanto segue.
Fill 100 µL – S II
Dispense 100 µL – S II
Mix 50 µL – S III
Zero (lampeggia)
C. Layout delle piastre
Il rapporto di layout delle piastre viene generato dallo strumento BD ProbeTec ET una volta caricati nel sistema il
tipo(i) di dosaggio, l’identificazione del campione, i numeri di lotto dei controlli e i numeri di lotto dei kit. Il
rapporto di layout delle piastre mostra la disposizione fisica dei campioni e dei controlli per ciascuna piastra da
analizzare. Questo orientamento viene usato sia per la piastra di micropozzetti di priming che per la piastra di
micropozzetti di amplificazione. I micropozzetti di priming per il dosaggio per DTB sono disposti su strisce bianche
compatte. I micropozzetti di amplificazione sono disposti su strisce arancione rigate.
D. Preparazione dei controlli del dosaggio
NOTA - Prima dell’uso, il diluente e i controlli BD ProbeTec ET per DTB, il tampone di lisi per DTB 2 e il tampone di
neutralizzazione per DTB 3 devono essere a temperatura ambiente. Usare i tamponi precedentemente aliquotati per
la preparazione dei campioni. Mescolare accuratamente prima dell’uso.
1.
Per ciascuna serie (piastra) da analizzare, preparare una provetta di controllo negativo DTB e una provetta di
controllo positivo per DTB. Se la piastra contiene reagenti DTB con numeri di lotto diversi, occorre testare i
controlli per ciascun lotto.
2.
Stappare la provetta di controllo negativo.
a. Usando la pipetta con un nuovo puntale, dispensare 100 µL di tampone di lisi per DTB 2.
b. Usando la pipetta con un nuovo puntale, dispensare 600 µL di tampone di neutralizzazione per DTB 3.
44
3.
Richiudere bene la provetta con il tappo e agitare con vortex per 5 secondi.
4.
Stappare la provetta di controllo positivo.
a. Usando la pipetta con un nuovo puntale, dispensare 100 µL di tampone di lisi per DTB 2.
b. Usando la pipetta con un nuovo puntale, dispensare 600 µL di tampone di neutralizzazione per DTB 3.
5.
Richiudere bene la provetta con il tappo e agitare con vortex per 5 secondi.
6.
Disporre le provette dei controlli nella microcentrifuga con il rotore standard. Chiudere con il coperchio e
centrifugare ad impulsi per 10 secondi. Rimuovere le provette dalla centrifuga e disporle nel supporto
trasparente per pipettaggio.
E.
Procedura di analisi
1. Rimuovere ed eliminare i tappi delle provette portacampioni e portacontrolli da usare per il primo ciclo di analisi.
2. CAMBIARE I GUANTI.
3. Preparare la piastra di micropozzetti priming come indicato nel rapporto di layout delle piastre.
4. Procedere come segue per richiudere e sigillare le buste dei micropozzetti di priming.
a. Mettere la busta su una superficie piatta. Appiattire con una mano l’estremità aperta.
b. Mantenendo la pressione, far scorrere un dito lungo l’esterno della chiusura, da un margine all’altro della
busta.
c. Assicurarsi che la busta sia sigillata.
5. Selezionare il Programma 1 sul pipettatore BD ProbeTec ET.
6. Sollevare i puntali delle pipette. Tirare completamente in fuori la manopola spaziatrice per espandere il
pipettatore.
NOTA - Per evitare perdite, assicurarsi che i puntali siano ben fissati sul pipettatore.
NOTA - Nell’aspirare i campioni, fare attenzione ad evitare di catturare pellet residui che potrebbero ostruire i
puntali delle pipette e compromettere i risultati del test.
7. Aspirare 200 µL dalla prima colonna di campioni.
8. Abbassare con attenzione il pipettatore, portare i puntali delle pipette a contatto con le pareti dei pozzetti e
dispensare 150 µL nella prima colonna di micropozzetti di priming (1A-H).
NOTA - Per garantire accuratezza e precisione e per evitare la contaminazione crociata, è importante dispensare
i liquidi contro le pareti interne dei micropozzetti.
9. Eliminare i puntali. Premere il grilletto di pipettaggio per reimpostare il pipettatore.
10. Prendere dei nuovi puntali, espandere il pipettatore e aspirare 200 µL dalla seconda colonna di campioni.
11. Abbassare con attenzione il pipettatore, portare i puntali delle pipette a contatto con le pareti dei pozzetti e
dispensare 150 µL nella seconda colonna di micropozzetti di priming (2A-H).
NOTA - Per evitare la contaminazione, non abbassare il pipettatore sui campioni o sui micropozzetti. I
movimenti bruschi possono causare la dispersione di goccioline o aerosol.
12. Eliminare i puntali.
NOTA - Eliminare con attenzione i puntali per evitare la dispersione di goccioline o aerosol che potrebbero
contaminare l’area di lavoro.
13. Continuare a trasferire gli altri campioni della serie.
14. Coprire la piastra di micropozzetti di priming con il rispettivo coperchio e lasciarla incubare a temperatura
ambiente per almeno 20 minuti. (L’incubazione può essere protratta fino a 6 ore.)
NOTA - Richiudere con tappi nuovi i campioni trattati. CAMBIARE I GUANTI.
15. Al termine dell’incubazione della piastra di priming, preparare la piastra di micropozzetti di amplificazione.
Configurare i micropozzetti di amplificazione in una piastra, in modo che corrisponda alle indicazioni del
rapporto di layout delle piastre (come per la piastra di priming). Richiudere e sigillare le buste dei micropozzetti
di amplificazione come descritto al passaggio 4.
16. Togliere il coperchio dalla piastra di micropozzetti di priming e trasferirla nell’incubatore di priming. Mettere
IMMEDIATAMENTE la piastra di micropozzetti di amplificazione nell’incubatore per pre-riscaldarla.
17. Impostare il cronometro su 10 minuti. (NOTA - Per questo passaggio, il tempo è di importanza critica.)
18. Trascorsi i 10 minuti (+/- 1 min.) di incubazione, selezionare il Programma 5 sul pipettatore.
19. Sollevare immediatamente i puntali delle pipette e trasferire 100 µL dalla colonna 1 dei micropozzetti di
priming alla colonna 1 dei micropozzetti di amplificazione. Portare i puntali delle pipette a contatto con le
pareti dei pozzetti e dispensare il liquido. Dopo la dispensazione, lasciare che il pipettatore mescoli
automaticamente il liquido nei pozzetti.
20. Eliminare i puntali. Sollevare dei nuovi puntali e continuare a trasferire la miscela reattiva dai micropozzetti di
priming ai micropozzetti di amplificazione, una colonna alla volta, usando nuovi puntali per ciascuna colonna.
21. Una volta trasferita l’ultima colonna, rimuovere la pellicola protettiva dal sigillante di amplificazione. (Un
sigillante di amplificazione [1/2] può coprire un massimo di 6 colonne; se la piastra ha più di 6 colonne, è
NECESSARIO usare un foglio intero di sigillante.) Afferrare per i bordi il foglio di sigillante e applicarlo sui
micropozzetti, servendosi delle guide che si trovano sull’incubatore. Premere sul sigillante per assicurarsi che
tutti i micropozzetti siano completamente sigillati.
45
22. Sull’interfaccia utente BD ProbeTec ET, estrarre il portapiastre e aprire lo sportello e il coperchio della piastra.
IMMEDIATAMENTE (entro 30 secondi) trasferire la piastra sigillata di micropozzetti di amplificazione allo
strumento BD ProbeTec ET e iniziare il ciclo di analisi. (Per spiegazioni dettagliate, consultare il Manuale d’uso
del sistema BD ProbeTec ET.)
23. Una volta iniziato il ciclo, completare la fase seguente della procedura di pulizia.
a. Sigillare la piastra dei micropozzetti di priming con il sigillante di amplificazione e rimuoverla dall’incubatore
per riscaldamento e priming. (Per rimuovere la piastra, usare guanti resistenti al calore, in quanto la
temperatura supera i 70 ºC.)
b. Lasciar raffreddare la piastra sul banco per 5 minuti. Eliminare i micropozzetti di priming in un contenitore
per rifiuti a rischio biologico.
c. Pulire la piastra metallica.
Sciacquare la piastra con ipoclorito di sodio all’1% (v/v) contenente Alconox.
Sciacquare la piastra con acqua distillata o deionizzata.
Avvolgerla quindi in un telo pulito e lasciarla asciugare completamente prima di riutilizzarla.
24. Al termine del ciclo verranno stampati i risultati del test.
25. Estrarre il portapiastre dalla stazione, aprire lo sportello e rimuovere la piastra. Chiudere lo sportello e rimettere
il portapiastre nello strumento.
26. Togliere dalla piastra i micropozzetti di amplificazione sigillati. ATTENZIONE - Non rimuovere dai micropozzetti il
materiale sigillante. Per rimuovere tutti insieme i micropozzetti sigillati, afferrare la parte superiore e inferiore
del sigillante e sollevare il tutto fuori dalla piastra. Mettere i micropozzetti sigillati nella busta per rifiuti e
sigillarla. Sigillare la piastra.
27. Pulire la piastra metallica.
Sciacquare la piastra con ipoclorito di sodio all’1% (v/v) contenente Alconox.
Sciacquare la piastra con acqua distillata o deionizzata.
Avvolgerla quindi in un telo pulito e lasciarla asciugare completamente prima di riutilizzarla.
28. Dopo l’ultimo ciclo della giornata, eseguire le seguenti procedure di pulizia.
a. Pulire le superfici del banco da lavoro con ipoclorito di sodio all’1% (v/v) contenente Alconox. Lasciare la
soluzione sulle superfici da lavoro per 2–3 minuti e poi ripassare con acqua distillata o deionizzata.
b. Per pulire il cestello per provette portacampioni e il supporto trasparente per pipettaggio, immergerli in
ipoclorito di sodio all’1% (v/v) contenente Alconox per non oltre 60 secondi. Sciacquare abbondantemente
con acqua distillata o deionizzata e lasciare asciugare all’aria.
c. Pulire le superfici esterne dell’incubatore per riscaldamento e priming e dello strumento BD ProbeTec ET con
ipoclorito di sodio all’1% (v/v) contenente Alconox. Ripassare poi le superfici con acqua distillata o
deionizzata.
d. Pulire l’impugnatura del pipettatore (SOLO L’IMPUGNATURA) con ipoclorito di sodio all’1% (v/v) contenente
Alconox. Ripassare poi con acqua distillata o deionizzata e asciugare con un asciugamano pulito.
e. Ricaricare il pipettatore.
f. Eliminare la busta dei rifiuti sigillata e il materiale a rischio biologico in osservanza delle procedure stabilite
per lo smaltimento dei rifiuti contaminati.
Controllo di qualità
Il set di controlli BD ProbeTec ET per DTB viene fornito separatamente. Includere un controllo positivo e un controllo
negativo in ogni ciclo di dosaggio e in ogni kit di reagenti con un nuovo numero di lotto. La disposizione dei
controlli può essere casuale. Il controllo positivo per DTB serve solo per il monitoraggio dei fallimenti del reagente,
del completamento delle fasi essenziali delle procedure (pipettaggio e incubazione), dell’amplificazione e
dell’individuazione. Il controllo negativo per DTB serve per il monitoraggio della contaminazione del reagente e/o
dell’ambiente. Per la validità dei risultati dei campioni, i risultati dell’analisi del controllo per DTB positivo e del
controllo per DTB negativo devono essere rispettivamente positivo e negativo. Se i controlli non si comportano come
previsto, il dosaggio viene considerato non valido e lo strumento non include i risultati nel referto del paziente. Se il
controllo di qualità non è conforme ai risultati previsti, ripetere l’intero ciclo di analisi utilizzando un nuovo set di
controlli, nuovi micropozzetti e i campioni preparati. Se anche quando viene ripetuto, il controllo di qualità non
fornisce i risultati previsti, rivolgersi all’assistenza tecnica (vedere “Interpretazione dei risultati”). Per le istruzioni
sulla preparazione dei controlli, consultare la sezione D della “PROCEDURA DI ANALISI”. Una volta preparati i
controlli, proseguire con l’analisi come descritto nella sezione E della “PROCEDURA DI ANALISI”.
All’interno del micropozzetto è integrato un controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control IAC). Il controllo interno di amplificazione contiene un target di acido nucleico che viene amplificato in presenza
della matrice del campione. Questo controllo serve a confermare la validità della reazione di amplificazione e ad
identificare una possibile inibizione da parte del campione analizzato.
Controllo della preparazione dei campioni Per testare l’efficacia della preparazione dei campioni, occorre analizzare di routine un controllo procedurale, in
osservanza delle disposizioni locali. Il controllo procedurale è composto da una sospensione di M. tuberculosis, (ad
es., American Type Culture Collection, H37Ra ATCC 25177). Preparare la sospensione nel modo seguente.
1.
Preparare una sospensione dell’organismo secondo lo standard 1 McFarland.
2.
Diluire la sospensione McFarland 1:100 in albumina bovina (FractionV), (ad es., pipettare 0,1 mL di sospensione
McFarland in 9,9 mL di albumina bovina e mescolare accuratamente).
46
3.
Le aliquote da 1,0 mL possono essere congelate a -20 ºC o a temperatura inferiore (senza ciclo temporizzato).
4.
Preparare le sospensioni cellulari come campione di routine da analizzare con il sistema BD ProbeTec ET.
Monitoraggio della presenza di contaminazione da DNA
Prima di eseguire per la prima volta il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB e successivamente almeno una volta al
mese, effettuare la seguente procedura di analisi per individuare l’eventuale presenza di contaminazione da DNA
sulle superfici dell’area di lavoro e delle attrezzature. Questo monitoraggio dell’ambiente è indispensabile per
individuare la contaminazione prima che insorgano problemi.
1. Usare un tampone CultureSwab EZ per ciascuna area* da analizzare.
2. Etichettare una provetta portacampioni per ciascuna area da campionare con il tampone e pipettare in ogni
provetta 100 µL di tampone di lisi per DTB 2 e 600 µL di tampone di neutralizzazione per DTB 3.
3. Intingere il primo tampone nella miscela tampone contenuta nella provetta portacampioni e passarlo sulla
prima area muovendolo in varie direzioni.
4. Mescolare il tampone nella miscela tampone, comprimerlo, richiudere con il tappo la provetta e agitare con
vortex per 5 secondi. Eliminare i tamponi.
5. Ripetere questo passaggio per ciascuna area campionata con tampone.
6. Disporre le provette del cestello per provette portacampioni e riscaldarle nel forno (Sezione C della PROCEDURA
DI PREPARAZIONE DEL CAMPIONE).
7. Mentre le provette si riscaldano, usare dei teli puliti imbevuti di acqua per rimuovere la miscela tampone residua
dalle superfici campionate con il tampone.
8. Dopo il riscaldamento, disporre le provette nella microcentrifuga con il rotore standard, chiudere con il
coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi.
9. Rimuovere le provette dalla centrifuga ed esaminarne i tappi alla ricerca di eventuale condensato. Se si nota la
presenza di condensato, ripetere la centrifugazione.
10. Rimettere le provette nel supporto trasparente per pipettaggio e proseguire con la PROCEDURA DI ANALISI.
*Le aree da testare raccomandate includono: la superficie del forno, il bagno ad ultrasuoni, il cestello per provette
portacampioni da 2 mL, il supporto trasparente per pipettaggio, l’incubatore per riscaldamento e priming, le piastre
di micropozzetti nere, l’impugnatura del pipettatore, i tasti a sfioramento dello strumento, la tastiera dello
strumento e il banco da lavoro.
Se per una delle aree si ottiene un risultato positivo, pulirla con una soluzione fresca di ipoclorito di sodio all’1%
(v/v) e Alconox. Assicurarsi che la soluzione di candeggina copra l’intera area e resti sulla superficie per almeno 2
minuti o fino a quando si asciuga. Se necessario, rimuovere l’eccesso di soluzione di candeggina con un telo pulito.
Passare sull’area un telo pulito e imbevuto di acqua deionizzata o distillata e lasciare quindi asciugare la superficie.
Ripetere l’analisi dell’area interessata fino a quando si ottengono risultati negativi. Se la contaminazione persiste,
rivolgersi all’assistenza tecnica per ulteriori informazioni.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Risultato del dosaggio DTB
Rapporto consigliato
Positivo
“Dosaggio con sonda positivo per la presenza di DNA del complesso
M. tuberculosis. Coltura di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli – AFB)
ancora non determinata”.
Negativo
“Dosaggio con sonda negativo per la presenza di DNA del complesso
M. tuberculosis. Coltura di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli – AFB)
ancora non determinata”.
Indeterminato
Ripetere il dosaggio con sonda del campione preparato Se il risultato dell’analisi
ripetuta è positivo o negativo, usare l’interpretazione pertinente come descritto
qui sopra. Se il risultato ripetuto è indeterminato, riportare “Sia il dosaggio iniziale
che quello ripetuto hanno fornito risultati indeterminati. Analizzare un nuovo
campione. Coltura di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli – AFB) ancora
non determinata”.
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
1. Questo metodo è stato testato solo con campioni delle vie respiratorie, come l’espettorato (indotto o escreato), i
lavaggi broncoalveolari e l’aspirato bronchiale e tracheale. Non ne sono state valutate le prestazioni con altri
campioni.
2. Un risultato negativo non esclude la possibilità che la concentrazione dell’organismo bersaglio sia inferiore alla
sensibilità del test.
3. Come per altri test diagnostici, i risultati del dosaggio per DTB devono essere interpretati contestualmente agli
altri dati clinici e di laboratorio a disposizione del medico.
4. Il dosaggio per DTB non differenzia i componenti del complesso M. tuberculosis - M. tuberculosis, M. bovis,
M. bovis BCG, M. africanum e M. microti.
5. Per fornire prestazioni ottimali, questo dosaggio richiede una tecnica corretta di prelievo e manipolazione dei
campioni.
6. È necessario seguire le condizioni di centrifugazione specificate, in quanto una centrifugazione insufficiente può
dar luogo a risultati falsi negativi.
47
7. Il dosaggio per DTB non riconosce le varianti del complesso M. tuberculosis in cui manca sequenza di inserzione
IS6110.
8. Il dosaggio per DTB deve essere usato esclusivamente da personale che abbia ricevuto una preparazione
adeguata per effettuare la procedura di dosaggio e utilizzare il sistema BD ProbeTec ET.
9. Il dosaggio DTB non può essere usato per valutare il successo o l’insuccesso terapeutico, in quanto la presenza di
acidi nucleici da organismi del complesso Mycobacterium tuberculosis può persistere anche dopo la terapia
antibiotica.
10. Il dosaggio DTB non sostituisce i metodi di coltura quando l’obiettivo è di analizzare la suscettibilità
antibatterica
11. Il dosaggio DTB fornisce risultati qualitativi. Quindi non esiste alcuna correlazione tra l’entità del valore MOTA
(Method Other Than Acceleration – Metodo diverso dall’accelerazione) e il numero di cellule presenti in un
campione positivo.
12. La sequenza della sonda del complesso M. tuberculosis IS6110, è specifica per M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis
BCG, e M. microti.
13. Il dosaggio per DTB riconosce le varianti di specie micobatteriche non tubercolari che possono contenere la
sequenza IS6110.
14. Il valore predittivo del dosaggio dipende dalla prevalenza della malattia in una data popolazione.
15. Non sono stati determinati gli effetti di altre potenziali variabili, come la terapia antibiotica o i campioni
coinfettati.
RISULTATI PREVISTI
Presso due centri di ricerca clinica in diverse aree geografiche, 1157 campioni prelevati da 986 pazienti sono stati
analizzati con il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB. Una distribuzione di frequenza dei valori MOTA iniziali è
illustrata nella Figura 1. I risultati del dosaggio BD ProbeTec ET per DTB sono presentati a confronto con i risultati di
TB di riferimento e con gli strisci di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli – AFB). Per risultato di TB di
riferimento è stato considerato un reperto di coltura micobatterica o la diagnosi del paziente in base alla cartella
clinica.
La presenza o l’assenza del complesso Mycobacterium tuberculosis viene determinata confrontando i valori BD
ProbeTec ET per DTB MOTA dei campioni con valori soglia predefiniti. Il MOTA è un valore metrico usato per
valutare l’intensità del segnale generato dalla reazione. L’entità del valore MOTA non è indicativa del livello di
organismi nel campione. Tutti i calcoli vengono eseguiti automaticamente dal software dello strumento.
I campioni analizzati presso i due centri sono stati identificati con il dosaggio BD ProbeTec ET come positivi, negativi
o indeterminati. Solo un campione ha fornito un risultato indeterminato all’analisi originale ed è poi risultato
negativo quando il test è stato ripetuto.
48
Figura 1 - Frequenza di distribuzione dei valori MOTA per DTB
900
800
792
700
Frequenza
600
500
400
300
200
184
100
82
3
6
2
≥ 80.000
36
1
40.000–
59.999
60.000–
79.999
12
20.000–
39.999
< 3.400
0
10
3.400–
19.999
31
TB di riferimento (–)
TB di riferimento (+)
DTB MOTA
Risultato degli strisci
e TB di riferimento
Striscio
Striscio
Striscio
Striscio
(+) TB (+)
(+) TB (–)
(–) TB (+)
(–) TB (–)
0–
3.399
3.400–
19.999
2
18
29
774
20.000–
39.999
1
0
11
10
19
1
17
0
40.000–
59.999
60.000–
79.999
144
1
40
5
60
0
22
1
≥ 80.000
1
0
1
0
PRESTAZIONI METODOLOGICHE
Valutazione clinica
Il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB è stato valutato presso due centri in diverse aree geografiche in cui la
prevalenza della tubercolosi era compresa tra il 9,2% e il 34,1%. Con il dosaggio per DTB sono stati analizzati
1157 campioni prelevati da 986 pazienti e i risultati sono stati confrontati al quelli ottenuti da coltura micobatterica.
I risultati del dosaggio BD ProbeTec ET per DTB sono illustrati nella Tabella 1 (per campione) e nella Tabella 2 (per
paziente). I risultati sono separati in base alla condizione dello striscio Per classificare un paziente vengono utilizzati
tutti i campioni prelevati da quel paziente. Il numero di campioni per paziente è compreso tra uno e tre. Un
paziente con uno o più risultati positivi per DTB viene considerato come DTB positivo. Un paziente con uno o più
risultati di coltura positiva per il complesso MTB viene considerato come coltura-positivo.
Tabella 1 - Risultati per DTB rispetto a risultati iniziali da coltura - per campione
Risultati per DTB
(+)
(–)
Risultati dello striscio
Coltura (+)
Coltura (–)
Striscio (+)
223
4
Striscio (–)
88
19
Striscio (+)
2
18
Striscio (–)
29
774
Tabella 2 - Risultati per DTB rispetto ai risultati iniziali da coltura - per paziente
Risultati per DTB
(+)
(–)
Risultati dello striscio
Coltura (+)
Striscio (+)
192
Coltura (–)
3
Striscio (–)
82
16
Striscio (+)
2
17
Striscio (–)
23
651
Si sono verificati 54 risultati discrepanti per DTB rispetto a quelli da coltura iniziale. Per stabilire una diagnosi per
tutti i risultati discrepanti sono state utilizzate le cartelle cliniche dei pazienti. Per risultato di TB di riferimento è
stato considerato un reperto di coltura micobatterica o la diagnosi del paziente in base alla cartella clinica. I risultati
del dosaggio BD ProbeTec ET per DTB rispetto ai risultati di TB di riferimento sono illustrati nella Tabella 3 (per
campione) e nella Tabella 4 (per paziente). I risultati sono separati in base alla condizione dello striscio.
49
Tabella 3 - Risultati per DTB rispetto ai risultati di TB di riferimento - per campione
Risultati per DTB
(+)
(–)
Risultati dello striscio
TB di riferimento (+)
TB di riferimento (–)
Striscio (+)
225
2
Striscio (–)
91
16
Striscio (+)
2
Striscio (–)
29
8
774
Tabella 4 - Risultati per DTB rispetto ai risultati di TB di riferimento - per paziente
Risultati per DTB
(+)
(–)
Risultati dello striscio
TB di riferimento (+)
Striscio (+)
193
TB di riferimento (–)
2
Striscio (–)
83
15
Striscio (+)
2
17
Striscio (–)
23
651
I parametri delle prestazioni previste sono illustrati nella Tabella 5, rispetto ai risultati da coltura iniziale e ai risultati
di TB di riferimento. I parametri di sensibilità sono separati in base ai risultati dello striscio.
Tabella 5 - Prestazioni previste del dosaggio per DTB
BD ProbeTec ET rispetto ai risultati da coltura
Sensibilità
totale
90,9%
Sensibilità
striscio (+)
99,1%
Sensibilità
striscio (–)
75,2%
BD ProbeTec ET rispetto ai risultati di TB di riferimento
Sensibilità
totale
91,1%
Specificità
97,2%
Sensibilità
striscio (+)
99,1%
Sensibilità
striscio (–)
75,8%
Specificità
97,8%
Studi analitici
Precisione I pannelli di precisione sono stati analizzati presso tre centri (due esterni e uno interno). Ciascun pannello ha incluso
due campioni negativi, due campioni con bassa positività (95 CFU/mL) e due campioni con positività relativamente
alta (1000 CFU/mL). I campioni positivi sono stati preparati aggiungendo ad un pool di sedimento NALC-NaOH
negativo aliquote note di Mycobacterium tuberculosis. I campioni sono stati testati in triplicato in sei diversi cicli di
analisi. In ogni ciclo è stato incluso un controllo di dosaggio positivo e uno negativo. Non essendo stata osservata
una variabilità significativa tra i centri o da un giorno all’altro, i dati forniti da tutti i centri sono stati combinati e
sono presentati nella Tabella 6.
Tabella 6
Campione
Positività moderatamente elevata (+)
Bassa positività (+)
Negativo (–)
No. di osservazioni
108
108
108
% corretta
100
97,2
99,1
Sensibilità del test
Il limite di rilevamento (LOD) del dosaggio per DTB viene definito come il numero minimo di target di acido nucleico
riconoscibile dal sistema il 95% delle volte. È stato determinato che questo limite di rilevamento corrisponde a
204 copie della sequenza target IS6110 per reazione. Questa sequenza di inserzione può essere presente negli
organismi del complesso Mycobacterium tuberculosis in un massimo di 23 copie per organismo. Quando sono stati
analizzati 31 isolati appartenenti al complesso, il limite di rilevamenti è risultato pari a nove CFU per reazione o
125 CFU/mL. Il limite inferiore di sensibilità per uno striscio di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli – AFB) è di
circa 1 x 104 CFU/mL.
Specificità analitica
La specificità del dosaggio per DTB è stata valutata analizzando centoventi (120) organismi a concentrazioni tra
106 e 108 CFU/mL. Questi organismi, che possono essere o non essere presenti nei campioni delle vie respiratorie,
includevano 66 batteri, 39 micobatteri non tubercolari, sei lieviti e miceti e nove virus. Nessuno degli organismi
testati ha evidenziato una reazione crociata con il dosaggio per DTB e non si è verificata alcuna inibizione del
riconoscimento del controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control – IAC).
Sostanze interferenti
Sono state analizzate con il dosaggio per DTB le sostanze potenzialmente interferenti reperibili nei campioni delle
vie respiratorie. Le sostanze potenzialmente interferenti sono state valutate in assenza dell’organismo target.
Nessuna delle sostanze testate ha evidenziato interferenza con il dosaggio per DTB e non si è verificata alcuna
inibizione del riconoscimento del controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control – IAC).
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Sostanza analizzata
Sangue intero (2,5%–10%)
Leucociti umani (1000–50.000 WBC/µL*)
Lidocaina (2%)
Spray fenolico per la gola (0,02 x dose normale)
Soluzione per induzione di espettorato (3% NaCl)
Farmaci antiasmatici (quattro volte la dose normale)
Farmaci antitubercolari (nove volte la dose normale)
Farmaci antiretrovirali (tre volte la dose normale)
*I campioni contenenti ≥ 50.000 WBC/µL possono causare la separazione del sedimento NALC-NaOH durante la
decantazione.
DISPONIBILITÀ
N. di cat.
Descrizione
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Confezione di reagenti BD ProbeTec ET per l’identificazione diretta del complesso Mycobacterium
tuberculosis (DTB), 96 test.
Kit BD ProbeTec ET per la preparazione dei campioni per l’identificazione diretta del complesso
Mycobacterium tuberculosis (DTB).
Set di controlli BD ProbeTec ET per l’identificazione diretta del complesso Mycobacterium
tuberculosis (DTB).
Kit di accessori BD ProbeTec ET (copri priming, sigillanti per amplificazione e buste per rifiuti, 20 di
ciascuno).
Puntali per pipette, 6 x 120.
Provette portacampioni e tappi BD ProbeTec ET, 2 mL, 200 per confezione.
Tappi per provette portacampioni BD ProbeTec ET, 2 mL, 200 per confezione.
Cestello per provette portacampioni BD ProbeTec ET, 2 mL.
Supporto trasparente per pipettaggio.
Strumento BD ProbeTec ET.
Incubatore per priming e riscaldamento BD ProbeTec ET (120V).
Pipettatore BD ProbeTec ET.
Forno BD ProbeTec ET.
Bagno ad ultrasuoni BD ProbeTec ET (90–110 V c.a.).
Kit di decontaminazione/digestione dei campioni BBL MycoPrep, dieci flaconi da 75 mL di soluzione
NALC-NaOH e 5 confezioni di tampone fosfato.
Kit di decontaminazione/digestione dei campioni BBL MycoPrep, dieci flaconi da 150 mL di soluzione
NALC-NaOH e 10 confezioni di tampone fosfato.
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RIFERIMENTI
Vedere la sezione “References” nel testo inglese.
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AVAILABILITY
Cat. No.
Description
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BD ProbeTec™ ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack, 96 tests.
BD ProbeTec™ ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen
Processing Kit.
BD ProbeTec™ ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Control Set.
BD ProbeTec™ ET Accessories Kit (20 Primer covers, Amplification sealers and Disposal bags).
Pipette Tips, 6 x 120.
BD ProbeTec™ ET Sample Tubes and Caps, 2 mL, 200/pk
BD ProbeTec™ ET Sample Tube Caps, 2 mL 200/pk.
BD ProbeTec™ ET Sample Tube Rack, 2 mL.
Clear Pipetting Rack.
BD ProbeTec™ ET Instrument.
BD ProbeTec™ ET Priming and Warming Heater (120V).
BD ProbeTec™ ET Pipettor.
BD ProbeTec™ ET Oven.
BD ProbeTec™ ET Sonic Bath (90–110 VAC).
BBL™ MycoPrep™ Specimen Digestion/Decontamination Kit, ten 75 mL bottles of NALC-NaOH
solution and 5 packages of phosphate buffer.
BBL™ MycoPrep™ Specimen Digestion/Decontamination Kit, ten 150 mL bottles of NALC-NaOH
solution and 10 packages of phosphate buffer.
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REFERENCES
1. Kent, P.T., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. USDHHS,
Centers for Disease Control, Atlanta.
2. Bloom, B.R., and C.J.L.Murray. 1992. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer. Science 257:1055-1064.
3. Tenover, F.C., et al, 1993. The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? J. of Clin. Microbiol. 31:767-770.
4. Wayne, L.G. 1982. Microbiology of tubercle bacilli. Am. Rev. Respir. Dis. 12 (Suppl):31-41.
5. Isenberg, H.D. (ed.) 1992.Clinical microbiology procedures handbook. Vol. 1. American Society for Microbiology,
Washington, D.C.
6. Walker, G. T., Frasier, M. S., Schram, J. L., Little, M. C., Nadeau, J. G., Malinowski, D. P. 1992. Strand displacement
amplification – an isothermal, in vitro DNA amplification technique. Nucleic Acids Res. 20(7): 1691–1696.
7. Walker, G. T., Linn, C. P. 1996. Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA with thermophilic strand
displacement amplification and fluorescence polarization. Clin. Chem. 42(10): 1604–1608.
8. Spargo, C. A., Frasier M. S., Van Cleve, M., Wright, D. J., Nycz, C. M., Spears, P. A., Walker, G.T. 1996. Detection of
M. tuberculosis DNA using thermophilic strand displacement amplification. Mol. Cell. Probes 10: 247–256.
9. Bloodborne Pathogens. Code of Federal Regulations, Title 29, Part 1910.1030, Federal Register 1991, 56:64175-64182.
10. Dept. of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of
Health. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 4th ed. U.S. Government Printing Office,
Washington, D.C.
11. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Approved Standard M29-A. Protection of laboratory
workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids and tissue. NCCLS,
Wayne, Pa.
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B
m
A
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Sparks, Maryland 21152 U.S.A.
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