Principi di Genomica funzionale - Prof. Muzi Falconi

LIBRERIA GENOMICA e di cDNA
La libreria genomica contiene le informazioni di tutto il genoma. E' usata per studiare la struttura
dei geni,per poter isolare le regioni regolatrici e studiare le regioni non codificanti (es. origini di
replicazioni,centromeri). La libreria di cDNA serve per studiare la sequenza e la funzione delle
proteine. Il vantaggio è che il n° di ricombinanti che si screenano è molto basso. Questa libreria è
più piccola di quella genomica.
PREPARAZIONE DEL Cdna
Sistema classico:
TTTTTTTTTTT
5'-----------------------------AAAAAAAAAA3'
Si usa un oligonucleotide che contiene tante T una dopo l'altra che si appaia alla coda poli-A. La
trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNA dipendente) copia un'informazione presente sull'mRNA
leggendo da 5' a 3'. Utilizza uno stampo da copiare,un 3'OH fornito dall'oligodt e fa la prima elica di
DNA. La trascrittasi inversa ogni tanto fa un uncino: prosegue la sintesi anche quando finisce il
templato cioè polimerizza un po' di più e l'uncino si ripiega su se stesso. Questo uncino fornisce un
3'OH e la seconda elica sfrutta l'uncino come innesco. Non è più usato perchè l'attività della
trascrittasi inversa è inefficiente. Si chiede alla trascrittasi inversa di copiare fino in fondo per
ottenere tutto il cDNA (non lo posso ricostruire e viene persa l'informazione non copiata). Le DNA
polimerasi sono distribuitive cioè si attaccano poi si staccano e si riattaccano in un altro punto. Più è
lungo il DNA più è probabile che si stacchi. E' necessario che siano processive.
Sistema recente:
Si prende l'mRNA e gli si dà oligonucleotidi a sequenza casuale. Si appaiano a caso e chiediamo
alla trascrittasi inversa di retrotrascrivere l'RNA. Ho diversi eventi di sintesi in cui difficilmente la
trascrittasi inversa arriva fino in fondo. La probabilità di trovare un certo pezzo è molto più alta che
non partendo dal fondo. Parto da punti diversi. Lo svantaggio è che gli oligonucleotidi si appaiano
in modo casuale a qualsiasi RNA quindi serve prima estrarre l'mRNA e purificarlo.
Sintetizzare la 2° elica di DNA
Serve togliere l'RNA e per farlo si usa l'RNasiH. Quest'enzima taglia l'RNA quando è appaiato al
DNA. Le cellule hanno questo enzima affinchè gli ibridi di RNA-DNA vengano controllati. Più
tempo la incubiamo più mangia via l'RNA. Se si fa un'incubazione parziale si ha che lascia dei
pezzettini. Questi funzionano da innesco e possono essere usati per sintetizzare la seconda elica.
______________________TTTTTTTT
______________________AAAAAAA
Per fare un clonaggio si usa un oligodt che ha una sequenza sintetica per un sito di restrizione
all'estremità in modo che il cDNA abbia un sito di restrizione in più.
5'____________3'
_____________Xho1
Se ho un cDNA fatto così mi interessa avere Xho1 anche al 5' quindi per attaccarlo dall'altra parte si
lega un adattatore. Sto usando una libreria di cDNA che deve essere espressa e serve che ci sia un
promotore. Se si clonano i frammenti di cDNA può accadere che entrino al contrario e si ha che il
cDNA non viene espresso.
La sequenza riconosciuta da EcoR1 è
GAATTC
CTTAAG
Sintetizzo due oligodt sintetici: uno con una certa sequenza che termina con una G e l'altro che
abbia una sequenza che viene lasciata quando Ecor1 taglia. Li sintetizzo e li faccio appaiare tra di
loro e ottengo un emi-sito EcoR1 che può essere attaccato all'estremità del cDNA. Questo è un
cDNA con due siti EcoR1 già tagliati (sono degli emi-siti). Serve fare un clonaggio direzionale in
modo che il 5' vada vicino al promotore e Xho1 al 3'.
→ problema: è un insieme di frammenti di cDNA che hanno siti di Xho1 nella sequenza codificante
quindi se la taglia con Xho1,taglio anche il cDNA. Quando sintetizzo il cDNA lo devo metilare
attraverso la metilasi di coli perchè in questo modo l'enzima di restrizione non può tagliare il DNA
di coli. Si ha un cDNA emi-metilato in cui la 1° elica è metilata mentre la 2° no perchè si taglia solo
l'oligonucleotide sintetico.
Scelta del vettore
Il vettore di espressione ha: un promotore,un RBS,un MCS in cui inserisco il frammento e un
terminatore. I vettori di espressione spesso sono fatti per creare proteine di fusione.
His-tag
Sequenza di 6 istidine fusa al cDNA quando è tradotto. E' utile per fare analisi successive. Il tag si
può trovare o monte dell'MCS o a valle dell'MCS ma prima del codone di stop.
Vettori
1)
2)
3)
4)
5)
plasmide: inserto max di 10 kb
fago: inserto max di 20 kb
cosmide: inserto max di 50 kb
BAC: inserto max di 300 kb
YAC: inserto fino a 1000 kb
Fago λ:
ha delle sequenze cos in cui si trova il singolo genoma di λ. Si ha che il genoma di λ viene replicato
e va nel fago; il fago becca la sequenza cos; tira dentro il DNA di λ e quando trova la sequenza
successiva taglia e il genoma è pronto per andare via. Nella testa ci stanno dai 48 alle 50 kb non di
più quindi si toglie un pezzo di genoma che non serve come ad es. la parte per fare il ciclo litico.
Cosmide:
non si comporta come un fago perchè non ci sono le placche di lisi ed è un plasmide che sfrutta le
sequenze cos di λ. Lo taglio,inserisco l'inserto,faccio degli oligomeri cioè attacco plasmidi testacoda,metto il plasmide nei capsidi di λ e ottengo un fago che ha solo le sequenze cos ma non fa la
lisi e si possono ottenere moltissimi cloni ricombinanti.
YAC:
si comporta come un cromosoma lineare. Ha un telomero e un centromero altrimenti verrebbe
perso.
ESEMPIO:
il lievito non sa sintetizzare il lievito e quindi si usa un ceppo mutato in Ura3 che è in grado di
crescere anche se non c'è uracile perchè sa sintetizzarselo. Ura3 e Trp1 sono i marcatori selettivi. Le
cellule se metto triptofano crescono. Se piastro le cellule in un terreno senza trp e ura ho che le
cellule wt non crescono ma se contengono lo YAC cib TRP1 e URA3 possono crescere. Utilizzo
due marcatori selettivi perchè è un pezzo di DNA molto grosso e devono esserci entrambe le braccia
infatti abbiamo un marcatore su un braccio e uno sull'altro. Devo cercare le cellule che lo YAC con
l'inserto. Il mutante soppressore è la mutazione in un gene x che combinato con uracile sopprime la
mutazione e si passa da ura- a ura+. La mutazione non senso è quella mutazione che mette un
codone di stop in un punto in cui di solito non c'è e si ottiene una proteina tronca. Questo accade
perchè il ribosoma si attacca,traduce ma quando arriva al TAA si ferma e il ribosoma si stacca. Ci
sono tRNA che sopprimo le mutazioni non senso. Può accadere che da un GCA si passi a un ATT
che è complementare al codone non senso e il ribosoma attacca un altro amminoacido e continua la
traduzione. Questa mutazione del tRNA è dominante e si vede il fenotipo nel mutante.
SUP4: sequenza del tRNA con la mutazione che sopprime mutazioni non senso di lievito e si trova
dentro lo YAC
ADE3: marcatore per l'adenina
adenina→ ADE3→ADE2
Se elimino ADE3 ho che le cellule restano bianche. Se elimino ADE2 ho che il precursore passa
dentro l'enzima che produce un prodotto che però non viene usato da ADE2 in quanto è stato
eliminato. Si accumula pigmento rosso che non è consumato quindi da ADE2 e si hanno cellule
rosse.
ade2 ADE3 cellule rosse
ade2 ade3 cellule bianche
ADE2 ADE3 cellule bianche
ADE2 ade3 cellule bianche
Può accadere che: le cellule wt fanno il precursore ma è consumato da ade2. Se il precursore non
viene formato le cellule restano bianche. Se il precursore viene formato ma ade2 non funziona
diventano rosse.
Le cellule necessitano di uracile,triptofano e adenina per crescere. Hanno una mutazione non senso
in ade2 e sono rosse. Se metto lo YAC ho che: la mutazione in trp1 è complementata da trp1,la
mutazione in ura3 è complementata da ura3 e la mutazione in ade2 è soppressa dal tRNA mutato.
Queste cellule fino a quando non le trasformo sono rosse. Quando ci butto dentro lo YAC sono
bianche. Perchè ho soppresso la mutazione in ade2.
1) le cellule senza YAC muoiono perchè non hanno triptofano e uracile
2) se metto lo YAC ricombinante le cellule sono rosse
3) se metto lo YAC senza ricombinante le cellule sono bianche
Mi serve per selezionare le cellule con l'inserto o meno.
Vettori fagici:
Sono usati per clonare pezzi di DNA grandi. Λ quando infetta può prendere 2 strade: ciclo litico o
ciclo lisogeno. A noi interessa amplificare l'inserto quindi si elimina dal genoma di λ la parte che
serve per la via lisogena e questa viene sostituita dall'inserto. Questo perchè il capside tira dentro il
genoma di λ fino a quando la testa è piena. Ogni fago ha un pezzo di DNA genomico diverso e ha
un'alta efficienza di infezione. Si vanno a creare le placche di lisi dalle quali poi posso aspirare il
fago.
Come fare lo screening:
per sapere quanti cloni devo analizzare prima di vedere il gene che mi interessa dipende dalla
grandezza del genoma e dalla grandezza dell'inserto nel vettore. E' + facile se guardo i cosmidi
perchè contengono un pezzo + grosso. Statisticamente i geni sono clonati più volte.
N= ln(1-p)/ln(1-f)
N: n° di cloni ricombinanti
p: probabilità con cui voglio trovare il mio gene
f: frazione di genoma contenuta nel mio clone
Identificazione del gene
1) screening su sequenza
2) screening su funzione
3) screening su caratteristiche strutturali
Se conosco qualcosa sulla sequenza del gene
serve avere informazioni sulla sequenza che sto cercando o su una sequenza omologa e lo posso
fare o x ibridazione o x PCR. Può accadere che qualcuno abbia già clonato il cDNA del gene o
posso avere il cDNA e andare a cercare le sequenze regolative.
Come marcare il DNA:
posso denaturare il DNA scaldandolo;incubo il DNA con una miscela di oligonucleotidi con
sequenza casuale e che si appaiano in modo casuale;abbasso la temperatura. Ho DNA
polimerasi,nucleotidi non marcati e 1 nucleotide marcato con P32. Si deve usare dATP e si marca il
P in α cioè P-P-P*-adenina. La DNA pol usa gli oligonucleotidi come inneschi e il DNA come
stampo e ho che le sequenza sintetizzate sono tutte radioattive perchè c'è il dATP radioattivo e
ottengo una sonda marcata. Questo è un random priming in cui si hanno molti atomi radioattivi e
un'alta attività specifica. Se ho a disposizione invece un oligonucleotide sintetico e a singola elica lo
incubo in presenza di polinucleotide chinasi e P32 γ. L'enzima stacca il P dall'ATP e lo attacca
all'oligonucleotide.
Si piastrano le cellule e si ottengono delle colonie,si fa replica plating su un filtro di nitrocellulosa.
Stacco il filtro e ho alcune cellule sul filtro. Il filtro lo appoggio su una nuova piastra e liso le
cellule mettendo il filtro a contatto con una soluzione tampone contenente SDS. Ottengo DNA e
proteine al posto della colonia. Nella soluzione tampone metto anche soda che aiuta la lisi e
denatura il DNA.
Ibridazione:
si deve saturare il filtro con DNA specifico cioè si butta sul filtro un eccesso di DNA. Il DNA deve
essere denaturato perchè in questo modo si attacca meglio alla nitrocellulosa. DNA e sonda stanno
attaccati fino a quando non si alza la temperatura. Si lava via l'eccesso di DNA.
Si incuba con una sonda omologa marcata e denaturata e si appia alla sequenza complementare,si
lava via l'eccesso di sonda che non si è attaccato e si alza la stringenza per lavare via la sonda che si
è appaiata per pochi nucleotidi. Si usa la lastra radiografica per vedere le colonia.
Si può incubare con una sonda eterologa che deriva da un gene che ha la stessa funzione ma in un
altro organismo quindi ha una specificità più bassa e devo usare condizioni di stringenza più bassa
per consentire un'ibridazione meno forte.
Si può incubare con una sonda degenerata. Posso ottenere una parte della sequenza della proteina e
usarla per cercare il gene. Usando il codice genetico al contrario e trovando la sequenza del DNA
deducendola dagli amminoacidi. Si deve usare come sonda tutte le combinazioni possibili che
danno la mia sequenza. Si fa una sonda degenerata che è l'insieme di sequenze nucleotidiche
diverse e sono le diverse combinazioni dei codoni. Si deve scegliere la regione di minor
degenerazione per la fare la sonda. Si avrà che una delle sonde avrà la sequenza complementare al
gene cercato. Non si deve però abbassare troppo la stringenza.
PCR degenerata:
A volte si possono utilizzare primer degenerati, costituiti da miscele di molecole simili ma non
identiche (differenti per alcuni nucleotidi all'interno della sequenza). Primer degenerati risultano
utili, ad esempio, quando si devono amplificare gli stessi geni provenienti da organismi diversi (che
hanno sequenze simili ma non identiche), oppure quando la sequenza del gene è stata ricavata dalla
sequenza della proteina corrispondente, tenendo conto della degenerazione del codice genetico. Es.
voglio cercare l'omologo umano di 2 sequenze di pompe e cereviasiae e disegno un oligonucleotide
degenerato. So che le due proteine di lievito contengono 2 regioni molto conservate e da questo
posso immaginare che la stessa proteina nell'uomo sia conservata nella funzione. Disegno due
oligonucleotidi degenerati e so che c'è un dominio ATPasico. Si cerca di trovare cloni che
contengano tutte e due le sequenze. Si prende la libreria di cDNA e si fa la PCR con due
oligonucleotidi che serve che non siano troppo distanti tra loro. Spero che questi due oligonucleotidi
si appaino al cDNA ma ce n'è uno a cui si appaiano tutti e due. Ottengo un prodotto di PCR in cui
c'è un pezzo di DNA che contiene le due sequenze più quello che c'è in mezzo. Ho amplificato un
pezzo del gene di interesse,lo marco e lo uso come sonda. Si è riusciti a costruire una macchina in
cui c'era un gradiente di temperatura e si fanno correre su gel.
Se conosco la funzione del gene
Quando voglio fare uno screening basato sulla funzione devo usare le librerie di espressione. Posso
utilizzare:
1) complementazione di mutanti
2) soppressione: interazioni genetiche
3) letalità sintetica: interazioni genetiche
4) Synthetic dosage lethality : interazioni genetiche
5) two hybrid
Complementazione:
ho un mutante che ha perso una funzione e voglio trovare un gene che codifica per quella funzione.
Ad es. ho cellule che su terreno che contiene uracile crescono mentre se non c'è non crescono. La
cellula ha perso la funzione di crescere su uracile e ha una mutazione su un gene che consente la
crescita in assenza di uracile. Per clonare questo gene trasformo le cellule con una libreria di
espressione con un clone. La cellule che tira dentro cDNA con il gene mutato è capace di crescere
anche se non c'è uracile. Avrò tanti morti e un vivo che contiene il gene selvatico che ho mutato.
Ad es. ho un mutante che a 25° fa colonia mentre a 37° è morto. Per clonare il gene mutante
trasformo con una libreria di espressione con un clone che a 37° vive. Vivono solo quelle cellule
che contengono un cDNA che codifica per questa caratteristica.
Screening genetici:
la funzione del gene posso studiarla analizzando il fenotipo del mutante. Gli screening genetici
possono essere fatti per tutti i geni che hanno una certa funzione. Può essere fatto per tanti mutanti
ed è reso possibile dai sistemi ad high troughtput. Ad es. se la cellula muore a 37° è perchè ha una
mutazione in un certo gene. Trasformo la libreria e tolgo un plasmide che ha una certa sequenza.
Dopo che ho tolto il gene devo verificare che sia veramente la copia selvatica del gene di interesse.
Le mutazioni possono essere complementate o soppresse. Reversione significa che quando
trasformo la libreria spinge ad avere una mutazione magari inversa. Prima A poi T e poi ridiventa A.
Crescono a 37° ma non perchè contengono il cDNA. Se la mutazione è la delezione del gene non
può revertire facilmente mentre le mutazioni puntiformi possono revertire. Oppure può accadere
che sia veramente la copia selvatica del gene mutato e ho effettivamente la complementazione.
Potrebbe essere una soppressione: questa mutazione in presenza di questo gene si ha un fenotipo
soppresso. E' un altro gene che sopprime la mutazione.
Soppressione:
il ceppo di partenza è vivo a 25° e morto a 37°. Quando metto la library ho che il clone isolato è
vivo a 37°. Tolgo il plasmide: se è vivo a 37° il plasmide non fa niente e la mutazione è revertita,se
muore c'è ancora la mutazione sulla cellula. Uso un sistema per far perdere il plasmide. Nel caso del
lievito posso usare un plasmide che porta come marcatore selettivo ura3. Le cellule senza plasmide
muoiono se non c'è uracile mentre sono vive se hanno il plasmide. Voglio fargli perdere il plasmide.
Uso ura3 perchè è un marcatore selezionabile: conferisce a cellule ura3- la capacità di vivere senza
uracile ma è anche contro-selezionabile perchè posso usarlo per ammazzare le cellule che non
hanno il marcatore e lasciare vivere le cellule che hanno il marcatore. Può selezionare a favore o
contro: a favore perchè vivono solo le cellule con il plasmide se non c'è uracile oppure posso
mettere le cellule su un altro terreno in modo che vivere solo le cellule che hanno perso il plasmide
vivono. Questo altro terreno contiene FOA che è un analogo dell'uracile. Il FOA entra nelle cellule e
se le cellule sono capaci di sintetizzare uracile ammazza le cellule mentre se le cellule non sono
capaci di sintetizzare uracile non usano FOA e vivono. Quindi le cellule sono vive su ura a 37° e
posso prenderle e trasferirle in un terreno che contiene FOA. Se la cellula ha il plasmide,esso viene
replicato quando la cellule si divide. Se il plasmide non ha centromero, la cellula segrega il genoma
e anche il plasmide. I plasmidi si distribuiscono a caso e si ha che con una certa frequenza il
plasmide viene perso spontaneamente. Se io piastro su terreno con FOA solo le cellule che hanno
perso spontaneamente il plasmide possono crescere perchè sono diventate ura- mentre quelle che
hanno il plasmide muoiono perchè FOA le uccide. Se si prende la colonia e la si mette a 37°: se è
viva la mutazione è revertente; se è morta significa che era mantenuta in vita dal plasmide. Bisogna
mettere sia uracile che FOA nel terreno.
Resta da considerare la soppressione. Può accadere che la cellula contenga la mutazione ma non
esprima il fenotipo mutante perchè ha dentro un gene soppressore. E' un gene che è capace di
sopprimere il fenotipo di una mutazione. Voglio sapere se il cDNA contiene la sequenza wt o il gene
soppressore. Dovrei confrontare la sequenza del cDNA con quella della mutazione e se ho che sono
uguali ho beccato il gene per complementazione mentre se sono diverse ho un gene soppressore. La
cellula può farlo perchè se ho una certa sequenza sul genoma e ho una sequenza sul plasmide posso
chiedere alla cellula di ricombinare. Se le due sequenze sono uguali si ha che la ricombinazione
omologa funziona mentre se le due sequenze sono diverse la ricombinazione omologa non funziona.
Ho un plasmide con una certa sequenza che spero sia il mio YFG e ho sul cromosoma un gene x
con una certa mutazione. Se le due ORF sono uguali ho clonato il gene per complementazione ma
se le due ORF sono diverse ho un soppressore visto che complementa il fenotipo. Posso quindi
confrontare le due sequenze e vedere se sono uguali o diverse.
Es. gene X che porta la mutazione
gene clonato YFG
plasmide con marcatore selettivo
Un plasmide quando lo trasformo in una cellula può essere integrato con una certa frequenza
soprattutto se contiene regioni di omologia. Per facilitare l'integrazione,renderla più efficiente e
dirigerla posso tagliare il plasmide. Se lo taglio con un sito di restrizione,prima di trasformarlo,ho
che sto dicendo alla cellula di fare crossing over esattamente in quella posizione perchè le due
estremità del plasmide verranno usate dai meccanismi di ricombinazione omologa dalla come inizio
per l'invasione della ricombinazione omologa. Per fare la ricombinazione devo avere un'estremità a
singola elica che va a cercarsi la regione di omologia e si appaia. Sto creando le estremità i sistemi
di ricombinazione useranno cioè dico alla cellula di andare a cercare partendo da queste estremità.
Con una linearizzazione dirigo la ricombinazione omologa.
Facciamo l'esempio che YFG sia lo stesso gene che porta la mutazione. Quando il gene si integra ho
che:
il cromosoma integra il plasmide e poi si riprende con la sequenza rappresentata sul cromosoma. Se
in * la mutazione è recessiva si ha che la cellula dopo l'integrazione è una cellula wt perchè porta la
copia mutante ma ha anche la selvatica. Se questo è un gene che complementa si ha che il plasmide
si integra di fianco alla copia cromosomica e ho una cellula selvatica. Questa cellula ha ancora la
mutazione sul cromosoma e se la prendo e la incrocio con un'altra cellula di lievito selvatica. Il
lievito esiste sia alla stato aploide (1 copia di cromosomi) che diploide (2 copie di cromosomi) Si
può mantenerlo allo stato aploide e farlo crescere e ottenere una popolazione oppure si possono
incrociare due cellule di lievito e ottenere un diploide e mantenere questo diploide. Il tipo sessuale
di lievito può essere MATa e MATα e solo questi due possono incrociarsi e secernere a-factor. Se
nella stessa beuta ci sono cellule che producono ferormone di tipo a e cellule che producono
ferormone di tipo α si ha che decidono di incrociarsi. In G1 una cellula aploide ha una copia di
cromosomi mentre in G2 ne ha due. Se devo incrociare due cellule aploidi e per caso unisco una
cellula G2 di tipo α e una cellula G1 di tipo a otterrei un triploide. Non succede mai perchè quando
una cellula di tipo a sente l'α-factor conclude il ciclo cellulare e si ferma in G1. Stessa cosa per α
che finisce il ciclo e si blocca in G1 e quindi ho solo cellule in G1 che si incrociano. Quando le
cellule stanno per incrociarsi me ne accorgo perchè hanno una forma smooth e allungata. Si
mettono lì,si “annusano” e poi si fondono e fanno uno zigote che diventerà poi una cellula diploide.
Il diploide sarà MATa MATα. Posso anche farlo tornare allo stato aploide mettendole in carenza di
azoto e vanno in meiosi dopo circa 6h. Producono 4 spore aploidi molto resistenti che vivono in
assenza di azoto. Posso incrociare MATa con MATα e ottengo un diploide che avrà 2 copie di
cromosomi 5 ad esempio. Tolgo l'azoto dal terreno,faccio fare la meiosi e si ha che i due cromosomi
omologhi si separano e vanno uno da una parte e l'altro dall'altra. Ho 2 spore che entrano nella
prima copia di cromosoma 5 e 2 nell'altra. Queste spore a 37° saranno tutte vive perchè 2 non hanno
nemmeno la mutazione mentre le altre 2 hanno il gene selvatico che complementa e quindi sono
vive.
Se clono il soppressore:
ho il gene sul cromosoma con la mutazione,ho il plasmide con il marcatore e che porta un gene
soppressore. Taglio il plasmide e produco due estremità lineari che sono usate dai meccanismi di
ricombinazione per invadere le sequenze omologhe. Dico alla cellula di fare il crossing over sulla
sequenza omologa. Il meccanismo di ricombinazione la porta a cercare sul genoma il punto in cui si
può integrare. Questa cellula ha un fenotipo selvatico perchè il gene soppressore sopprime la
mutazione. Ho una cellula che contiene il gene che sopprime in qualche punto del genoma. Se
incrocio con una cellula wt ottengo un diploide che ha due copie del cromosoma 5 e avrà da qualche
parte integrato il gene soppressore. Se la library è di lievito ho da qualche parte anche il gene YFG
che proviene dalla cellula parentale. Non si è infilato nel mio gene di interesse. Il gene soppressore
e quello della mutazione non sono uniti e ho che quando fanno meiosi segregano a caso se non sono
strettamente concatenati. Questo significa che non c'è nessun motivo per cui debbano andare nella
stessa spora,lo faranno ma a caso. Se vanno in spore diverse avrò una spora che ha una mutazione
nel gene soppressore ma non in YFG perchè questo è andato con l'altra copia del cromosoma 5.
Qualcuna delle spore torna ad essere mutante perchè facendo fare meiosi separo il costrutto che
sopprimeva dall'altro. Per sapere se ho isolato il gene soppressore o il gene di interesse è di
incrociarlo con il selvatico e fargli fare la meiosi. Tutto questo funziona se la mutazione è recessiva.
Significa che quando metto la cellula in presenza della mutazione recessiva osservo il mutato. Se la
mutazione è dominante significa che quando metto il gene mutato in presenza della copia selvatica
vedo il mutante. Se voglio clonare il gene devo preparare una libreria di cDNA dal mutante. Devo
prendere la cellula mutante e fare la libreria in modo che uno di questi cloni contenga il gene
mutante. Ho un clone con la sequenza mutante che è dominante. Se questa sequenza la trasformo in
un ceppo wt ottengo una copia wt sul cromosoma e una copia mutante che deriva dal plasmide.
Ottengo un mutante e ho clonato per complementazione ma è più difficile perchè devo fare una
libreria apposta.
Se lo screening viene fatto con una libreria genomica devo vedere quale dei pezzi tagliati
complementa la mutazione.
Letalità sintetica:
due mutanti sono letali sintetici se abbiamo ad es. il gene a mutato che dà un certo fenotipo e
vediamo crescita a 37°. Il ceppo wt cresce bene,il ceppo che porta la mutazione cresce meno bene,il
gene che porta la mutazione nel gene b cresce ma non benissimo. Se faccio un ceppo che porta la
mutazione nel gene a e b ho che il ceppo è morto. Queste due mutazioni diventano letali quando
sono messe insieme. Questo è uno dei sistemi + potenti per cercare di capire in quale processo
cellulare un gene sta lavorando e serve per identificare geni che lavorano in processi cellulari simili.
Es. abbiamo un DNA rotto e ci sono sistemi per riparare il danno. Possono esserci due strade che
porta alla riparazione: se elimino la strada a la cellula non sta benissimo ma vive e se elimino la via
b non sta benissimo ma se le elimino tutte e 2 la cellula è morta. I geni a e b sono letali sintetici.
Es. il danno al DNA viene riparato da un complesso a-b. Se elimino a ho che il complesso è ancora
stabile e sa assemblarsi e ho che la cellula sta abbastanza bene. Se elimino b idem. Se li elimino
entrambi ho che il complesso non riesce a stare insieme e la cellula muore. La letalità sintetica si ha
quando ci sono due pathway alternativi per fare la stessa cosa o quando ci sono due geni che
codificano per proteine che fanno parte dello stesso complesso.
Se ho in mano un gene che non so cosa faccia nella cellula posso andare a cercare i geni letali
sintetici e magari scopro un letale sintetico di cui si conosce la funzione.
Screening per la letalità sintetica:
Es. ho un gene che non so cosa fa e voglio cercare geni che sono letali sintetici. Ho un mutante alk2
e l'idea è quella di cercare un mutante in un gene x che quando è combinato con alk2 mi dia un
fenotipo sintetico. Ho una mutazione alk2 e la cellula è ura3- e ho anche le mutazioni ade2 e ade3.
ADE3 selvatico processa il precursore e lo fa diventare rosso,se ADE2 funziona le cellule sono
bianche. Se mancano tutti e due le cellule sono bianche perchè il rosso nemmeno lo fanno. Il ceppo
di partenza è bianco. Perché il sistema funzioni ho che il ceppo deve essere trasformato con un
plasmide che porta ALK2 selvatico,ura3 marcatore selettivo per selezionare le cellule trasformate e
ADE3 selvatico. Le cellule sono rosse perchè ADE3 è presente ma ADE2 resta sul cromosoma.
ALK2 non è espressa perchè c'è solo il gene selvatico e sono rosse perchè c'è solo ADE3. L'idea è
di trovare un mutante in un gene x in modo che sia letale sintetico con alk2. Se il mutante è letale
sintetico ho che la cellula è morto. Come lo trovo se è morto? Il trucco è che se questa cellula che
contiene ALK2 selvatico è viva perchè la mutazione è complementata dal plasmide. Con una certa
frequenza la cellula perde il plasmide e muore. Non deve assolutamente perdere il plasmide. Se il
plasmide contiene ade3 quando esso è dentro le cellule sono rosse mentre quando non c'è sono
bianche perchè non hanno ADE3. Le distinguo dal colore. Il ceppo è rosso perchè c'è dentro ADE3.
Se prendo questa cellula e la piastro vedo che avrò alcune colonie sono rosse mentre altre sono
bianche. Piastro e ho colonie + rosse,+ bianche e alcune a spicchio. La parte delle colonie rosse
sono quelle con il plasmide,le bianche hanno perso il plasmide. Ho che il ceppo di partenza fa
settori. Voglio trovare una mutazione di un altro gene che impedisca la perdita del plasmide e sia
quindi letale sintetico su alk2. Le colonie saranno tutte rosse. La frequenza di mutazione spontanea
c'è ma è molto bassa quindi devo mettere un agente mutageno come EMS che aumenta la
probabilità di ottenere mutazioni in altri geni (aggiungendo gruppi metilici alle basi azotate).
Quando queste cellule lo vedono subiscono mutazioni magari nel gene x. Ho quindi una collezione
di mutanti e devo cercare quali le cellule che hanno una mutazione del gene x che è letale sintetico
in alk2. Piastro le cellule e gli faccio fare colonia e ho che la maggior parte fanno settori perchè non
hanno a che fare con alk2. Le altre danno colonie rosse che è indice possibilmente della letalità
sintetica con alk2. Ci sono alcune colonie a settori che non hanno la mutazione. Se la mutazione
riguarda il gene Z si ha una colonia a settori perchè può ancora perdere il plasmide e comunque alk2
non è letale. Se la mutazione è in un gene x che è letale sintetico con alk2 si vedono colonie rosse.
Le cellule sono rosse quando c'è il plasmide mentre quando lo perdono diventerebbero bianche
perchè perdono alk2 ma abbiamo che sono morte. Si cercano solo le colonie totalmente rosse.
Quindi esiste un gene x che quando è mutato è letale sintetico con alk2. Il gene x non lo posso
clonare in base alla sequenza ma in base alla funzione. Lo clono per complementazione. Le cellule
sono rosse e se trasferisco una banca di cDNA che contiene il gene x wt quando questo entra ho che
le cellule cambiano fenotipo e fanno di nuovo i settori. Questo è vero se la mutazione è recessiva
perchè se invece è dominante anche se metto il wt restano rosse. Devo quindi controllare che la
mutazione sia recessiva: il diploide fa i settori perchè questo ceppo ha due plasmidi uno per il gene
alk2 e uno per il gene x. Fenotipicamente le mutazioni sono coperte dal gene selvatico e si vede il
fenotipo del wt. Si ottengono reti di interazioni tra alk2 e altri geni. In realtà c'è un gene alk1 che
svolge una funzione quasi identica perciò sfalsa i risultati.
Ho una cellula con alk2 e voglio trovare una mutazione per cui alk2- e x- la cellula muore. Come
seleziono se muore? Inserisco un plasmide con alk2 funzionante e vedo che le cellule con questo
plasmide sono fenotipo per alk2 normale e sono rosse perchè hanno come marcatore ade2. Quindi
mutagenizzo la cellula con il plasmide e ho che se nasce una mutazione x- letale sintetica con alk2la cellula è viva a patto che abbia il plasmide perchè o è rossa o è morta. Sicuramente non può
essere bianca. Il plasmide è privo di centromero e la cellula lo perde con una certa frequenza perchè
alla duplicazione il plasmide duplica e può finire tutto o nella madre o nella figlia. Le colonie
possono essere un po' bianche e un po' rosse quindi settorate. Finchè la mutazione è solo alk2anche le colonie bianche vivono però se la cellula viene mutata e si ha alk2- e x- se non contiene il
plasmide quindi è bianca e muore sicuramente. Riconosco perciò i ceppi alk2- x- perchè le colonie
sono tutte rosse. Queste cellule vengono coltivate su un terreno contenente uracile altrimenti
morirebbero lo stesso. X- da solo permette la sopravvivenza della cellula altrimenti morirebbero sia
le colonie bianche che quelle rosse. La mutagenesi la posso fare con EMS e dipende dalla quantità
che metto e tratto per avere in media una mutazione ulteriore a cellula. Trovo x con una banca di
cDNA fatta nelle colonie rosse se x è recessiva.
Test di recessività o dominanza:
incrocio x- alk2- ade3 ura3 con alk2- ade2 ade3 ura3
ottengo un diploide x-x+e se la mutazione è recessiva il diploide è settorato altrimenti è rosso. Se è
recessiva inserisco del cDNA nel ceppo alk2- x- e le colonie con x+ saranno le uniche con i settori.
Estraggo il DNA dalle cellule settorate e trasformo un coli con questo DNA e ho che il DNA
genomico viene degradato e restano solo i plasmidi. Trovo le cellule con il plasmide con X,faccio la
PCR e sequenzio.
Sinthetic dosage lethality
Se ho un mutante a- e aumento l'espressione di b e il meno a- cresce meglio ho la soppressione. Se
ho un mutante a- e inserisco una mutazione b- e il mutante a-b- muore ho la letalità sintetica. Se ho
un mutante a- e aumento l'espressione di b e il mutante a-b> muore ho la sinthetic dosage lethality.
Es. a ripara il DNA e b danneggi il DNA ma esiste un pathway c che ripara 1 un po' però se c'è b ma
non c'è a muore.
Doppio ibrido
Avendo un gene a che codifica per A esistono Bs che interagiscono fisicamente con A? Il doppio
ibrido è un sistema genetico che funziona in cellule vive ma non è un metodo biochimico. Si basa
sulla struttura modulare dei fattori trascrizionali che legano il promotore e attivano la trascrizione.
Es. il DNA binding domain e l'activation domain sono legati da un linker. In questo esperimento si è
rimosso il linker e al DNA binding è stato legata la proteina 1 mentre all'activation la proteina 2. Se
le proteine 1 e 2 interagiscono tra loro i due domini si collegano e quindi si ha che l'attivatore
trascrizionale funziona e il gene viene trascritto. Più forte è l'interazione,più il gene viene espresso.
Questo è anche un test quantitativo. Lo screening è effettuato di solito in lievito,a volte in batteri e
in mammiferi. Viene usato lacZ come gene reporter. Si usa come substrato Xgal (blu) che si usa in
piastra oppure ONPG (giallo). Xgal dà anche sfumature di azzurro perciò è un test complesso da
condurre da solo perciò si inserisce un secondo reporter che se non è espresso direttamente le
cellule muoiono. Si usa leu2 per la sintesi della leucina. Solo le cellule che trascrivono leu2 possono
crescere. Nella cellula devono quindi esserci due plasmidi: DBD-proteinaA e cDNA-AD. Se la
proteina e il cDNA interagiscono si ha che il reporter viene espresso. Di solito si usa come DBD
LexA batterico. Nei plasmidi si mette MCS,LexA,TRP1,oriC di cereviasiae e un promotore di
lievito. Di solito si usa il promotore costitutivo ADH1. Il secondo plasmide contiene il
cDNA,URA3,ori,AD,promotore. In questo plasmide si usa in promotore inducibile GAL1 perchè il
cDNA potrebbe essere tossico.
Di solito si usa un costrutto che contiene un plasmide fatto da LexA batterica DBD e B42 di lievito
che è l'AD. Voglio ottenere proteine di fusione. I plasmidi hanno un sito di restrizione quindi
possono inserire in frame qualunque sequenza ligandola ai reporter. Amplifico per PCR il gene dal
genoma mettendo codine in un sito ecoR1 in modo che quando esso viene tagliato le codine si
possano rilegare e vadano così in frame. Questo è il cosiddetto plasmide esca cioè è quello che uso
per andare a pescare l'interazione e ha come marker ad esempio il triptofano. Quando viene
espresso questo plasmide dal promotore ADH1 viene fatta la proteina di fusione YFP-lexA. Quando
viene trascritto questo costrutto è sintetizzata la proteina di fusione costituita da B42 fusa in frame
con i cDNA che abbiamo trovato. Si sta facendo uno screening nella libreria. E' meglio metterci un
promotore inducibile perchè qualche cDNA può essere tossico. Il ceppo di lievito che si utilizza è
EGY48 che avrà sul cromosoma il gene leu2 controllato da un promotore artificiale che viene
attivato solo quando lexA-B42 è posizionato. C'è un LexAO che è un operatore (a cui si lega il
regolatore). Quando LexA è legato e si porta dietro B42 si ha attivazione di leu2. L'attivazione si ha
solo quando c'è interazione tra le due proteine. C'è un altro gene reporter in un altro punto perchè il
sistema leu2 è molto comodo per fare una prima selezione. LacZ invece è comodo dopo per
valutare quanto è forte l'interazione. Se c'è un'interazione debole si ha che lacZ è trascritto poco. Un
altro motivo è che quando si fanno screening si trovano sempre falsi positivi. Più sistemi diversi si
usano e meno falsi positivi ci sono. Quando faccio lo screening posso avere che crescono su mellow
e sono positive per la mutazione ma quando metto lexA diventano blu. Sono cresciuti su mellow ma
non perchè c'è interazione. Se l'interazione esiste devono essere leu+ e blu. E' utile per eliminare i
falsi positivi avere due reporter. Un altro caso di falso positivo è il sistema di leu2. Si può avere ad
esempio un ceppo con un gene leu2 inattivato e in un altro locus avere una copia leu2 wt. Se
l'interazione è negativa ho che il gene cromosomico è inattivo,l'altro non lo possono trascrivere. Si
ha che le cellule sono leu-. C'è però una probabilità bassa che la mutazione leu2 possa revertire e far
diventare le cellule leu+. Ho colonie che crescono su mellow anche se non c'è interazione ma
semplicemente perchè ho revertito. Se passo su Xgal vedo però che non diventano blu. Questo
accade quando uso sistemi di screening molto forti. Eventi come la reversione danno un vantaggio
selettivo molto forte e le cellule vive diventano un numero importante. Oppure può forse accadere
che le cellule che hanno revertito la mutazione producono leucina,muoiono e rilasciano leucina
sufficiente per la sopravvivenza delle altre. Leu2 e lacZ sono già dentro al ceppo di lievito. Ci sono
proteine che anche senza l'activation domain se ha regioni acide o ricche in prolina sono
ugualmente in grado di indurre la trascrizione. Si trasforma il plasmide esca se buttargli dentro il
plasmide preda AD. Se il ceppo non cresce significa che non sa fare la trascrizione mentre se cresce
in assenza di attivatore trascrizionale continua a crescere. Non sono in grado di distinguere le
interazioni negative dalle positive. Trasformo l'esca per vedere se da sola attiva o meno la
trascrizione. Se attiva da sola posso prendere YFG e farlo a pezzetti. Clono il gene su pezzi diversi
sperando di trovare qualche pezzo che non attivi la trascrizione spontaneamente. Perdo delle
interazioni perchè ho pezzi di proteina. Trovo dei positivi e poi posso fare il 2° esperimento di
trasformazione. Ho il ceppo con il plasmide esca e gli butto dentro la libreria preda e li metto su
mellow. Vedo che crescono delle colonie che sono dei possibili positivi,li trasferisco su una piastra
fresca di mellow poi su Xgal. I positivi su entrambi sono gli effettivi positivi e su questi lavoro. Ho
colonie positive in cui c'è un plasmide trp1 che contiene l'esca e LexA e c'è un plasmide preda con
B42 e un cDNA diverso da colonia a colonia che si trova all'interno. C'è una certa proteina che
interagisce con YFP e una proteina b che interagisce anche lei con YFP. B42b ha un attivatore
trascrizionale che è B42 e poi una proteina b. Se questa proteina b per qualunque motivo riesce a
legarsi a monte del gene leu2 visto che c'è attaccato l'attivatore trascrizionale B42 attiva la
trascrizione del gene reporter anche senza l'esca. La colonia sopravvive anche se l'interazione non
c'è. Mi dà un risultato positivo allo screening su leu2 e lacZ ma è un falso positivo perchè non
dipende dall'interazione. Può essere che la proteina abbia un'attività molto forte per il DNA. Faccio
un controllo lisando e purificando le cellule. So che l'esca da sola non basta per attivare la
trascrizione. Devo essere sicuro che la trascrizione del reporter non dipenda esclusivamente dalla
fusione della proteina con il dominio di interazione al DNA. Successivamente tolgo il plasmide e lo
trasformo in un ceppo vergine di lievito senza l'esca. Ho che B42 è espresso ma non ho più l'esca.
Mi aspetto che questa cellula non trascriva più il gene reporter perchè non c'è l'esca e quindi non c'è
interazione. Se resta leu- la positività del ceppo dipendeva dalla presenza contemporanea dei due
plasmidi. Se il ceppo diventa leu+ ho che la preda da sola attiva la trascrizione e non posso sapere
se c'è interazione o meno. Controllo n°2: sequenzio il plasmide e vado a leggere la sequenza del
clone. Ho trovato un gene a che interagisce con una proteina di mio interesse. Il sistema del doppio
ibrido rileva anche interazioni transienti. I problemi che pone il doppio ibrido sono che non è detto
che questa situazione sia ricreabile quando creo proteine di fusione. La fusione di per sé può
modificare le proprietà della proteina. Se il dominio di interazione è reverso perchè può essere che
sia colpa della proteina di fusione che non mi fa funzionare l'interazione.
Es. YFP ha un dominio di interazione all'interno e normalmente non interagisce con a perchè il sito
di interazione è nascosto. La proteina nativa viene sottoposta a una forma di regolazione tale che il
sito viene esposto e si ha che l'interazione è possibile. Quando però faccio il two hybrid non vedo
interazione ma potrebbe essere rilevata con altri sistemi. In questi casi è utile usare pezzi di proteina
ma non posso saperlo a priori.
Problemi dei fasi positivi:
proteina YFP e proteina a hanno un'affinità bassa nella cellula e si ha che non si toccano mai.
Ricordiamo che usiamo ADH1 per esprimere YFP e gal1 per esprimere la proteina a. Queste due
proteine fisicamente non interagiscono mai ma se alzo la concentrazione della proteina ho
interazione. YFP e a devono poter raggiungere il reporter per poter attivare la trascrizione. Questo
reporter si trova nel nucleo e ho che le due proteine devono finire nel nucleo altrimenti il two hybrid
non può funzionare. I plasmidi esca e preda hanno anche un sito di localizzazione nucleare che
costringe queste proteine ad andare nel nucleo. Trovo un positivo e questa interazione avviene e ho
che il reporter viene trascritto. Può accadere che YFP sia una proteina del nucleo e va bene ma a
può essere una proteina del mitocondrio. Se mando a nel nucleo interagisce con YFP ma
normalmente non si incontrerebbero mai. Costringo i due partner a finire nello stesso
compartimento cellulare.
Es. ho un plasmide esca e uno preda e posso mettere l'esca in presenza di diversi plasmidi preda che
contengono diverse parti della proteina.
Interazione proteina-proteina
Posso identificare i domini di interazione proteina-proteina. Per conoscere il tipo di interazione
posso rompere l'interazione se essa ha un significato fisiologico. Uso il reverse two hybrid che
serve per identificare i mutanti che perdono l'interazione che sto studiando. Lo scopo è di trovare
mutanti che non sono capaci di interagire e chiedermi così cosa succede se la cellula esprime questo
mutante. Ho un plasmide che contiene YFP,DBD,AD. So che quando YFG e la proteina a
interagiscono ho espressione del reporter. Voglio trovare una mutazione in una delle due proteine
che faccia perdere l'interazione. Devo usare un reporter contro-selezionabile cioè selezionare per
quelli che non lo esprimono. Quando aggiungo FOA ho che esso entra nella via metabolica
dell'uracile e se la cellula ha ura3 attivo prende il FOA,lo trasforma in un composto letale e la
cellula muore. Se la cellula è ura- il FOA entra nella cellula ma essa continua a vivere. Questa
tecnica usa come reporter ura3. Prendo il ceppo e se lo piastro su terreno che contiene FOA il ceppo
è morto. Ura3 è espresso e il ceppo è morto. Se ci sono mutanti in cui l'interazione tra le due
proteine è persa,ura3 non è espressa e le cellule fanno colonie. Posso prendere il plasmide preda e
sottoporlo a mutagenesi,lo piastro su FOA e ottengo colonie che hanno perso l'interazione perchè
hanno accumulato delle mutazioni nel gene a che fanno saltare le interazioni. Sequenzio il gene
mutato e verificare se ci sono mutazioni che hanno fatto perdere l'interazione. Se uso un ceppo di
lievito selvatico posso vedere ad es. se assume un fenotipo particolare o smettere di crescere. Posso
quindi valutare se l'interazione ha un significato fisiologico o meno.
→ il two hybrid non basta per dire che le proteine interagiscono. E' una forte indicazione ma devo
confermarlo in qualche altro modo. Devo fare una dimostrazione biochimica perchè il two hybrid è
un sistema genetico!!
One hybrid
Ho isolato il promotore di un gene che mi interessa e voglio sapere quali sono le proteine che si
legano a questo promotore. Voglio sapere verosimilmente quali sono i fattori trascrizionali che
controllano il gene che mi interessa. Oppure posso avere uno dei geni di replicazione e mi chiedo
quali proteine vanno ad attaccarsi alle origini di replicazione e troverò le proteine che servono per
controllare l'inizio della trascrizione. Nel sistema one hybrid c'è uno solo ibrido,un
reporter,cDNA+AD. Quale cDNA si lega alla sequenza che mi interessa? Se ne trovo qualcuna ho
che si porta dietro l'AD che attiva a sua volta lacZ. La cellula esprime quindi lacZ. Non viene usata
l'esca.
Altri screening per l'interazione proteina-proteina
1) con anticorpi specifici
2) con proteine specifiche: visto
3) IVEC
Anticorpi specifici:
Discutiamo come faccio a clonare quando ho in mano un anticorpo. In alcuni casi ho un paziente
che produce l'anticorpo e posso isolarla dal paziente. In altri casi ho la proteina e posso isolare il
gene corrispondente. Posso sequenziare la proteina e dà qui andare a trovare il gene oppure posso
prendere questa proteina dal topo. Gli anticorpi li prelevo dal sangue. Devo prima purificare
l'anticorpo perchè non voglio usare un siero che contenga anticorpi contro diverse proteine ma solo
quello che mi interessa. Prendo la proteina che ho messo nel topo,attacco la resina sulla colonna e
ho che gli anticorpi specifici si attaccano alla resina. Faccio passare il siero e ho che resta attaccato
solo l'anticorpo di interesse. Lavo la colonna,stacco l'anticorpo dall'antigene usando una soluzione
con pH tra 1.5-2.5. Lo recupero e lo tampono riportandolo a pH neutro. Come trovo il gene che mi
interessa? Si usa un fago λ gt11 che consente di esprimere gli inserti che hanno il fago. Λ ha un
sistema di infezione molto efficiente e non devo nemmeno lisare le colonie come invece faccio in
coli. Λ gt11 ha una sequenza lacZ clonata a valle del sito di restrizione e metto l'inserto che si va ad
infilare in frame o meno con lacZ. Quando l'inserto entra ho che inattiva lacZ e i fagi producono
una βgal inattiva. Può accadere che: il gene entra e scassa βgal oppure va in frame e produce la
proteina di fusione. Altra cosa importante è il gene di coli 857 che è temperatura sensibile: a 32° la
proteina è attiva e la cellula fa il ciclo lisogenico. Si mettono le cellule su IPTG che induce
l'espressione di lacZ. Metto sulla piastra un filtro di carta,sollevo e ho che faccio una replica delle
colonie sulla carta. Il filtro lo bagno con IPTG. Quando lo vedono diventano blu se l'inserto è
andato in frame. Sposto le cellule a 39° e lisano. Ho sul filtro delle proteine anziché delle colonie.
Posso fare western e ho che l'anticorpo riconosce solo la posizione in cui è presente la proteina.*
Significa che quella colonia ha il fago con il gene che codifica per la proteina di interesse. E'
importante perchè se infetto con il fago ricombinante le cellule ho che da una cellula ottengo molte
cellule ricombinanti. Se la cellula fa subito il ciclo litico la cellula è infettata,produce molti fagi ma
poi lisa e non produce più nulla. Voglio invece amplificare il fago quindi il 1° passaggio è quello
lisogenico. Quando voglio fare lisare le cellule sposto la temperatura a 39° ho che il fago passa dal
ciclo lisogenico al ciclo litico e lisa le cellule. Durante il ciclo lisogenico ho però fatto una colonia
che ha espresso il genoma del fago e quindi ha espresso anche la mia proteina. Ho una colonia piena
di proteina con l'inserto. Voglio esprimere una libreria di inserti con questo fago! Quando accendo
la lisi ho che le cellule rilasciano sulla piastra la mia proteina. Il sistema funziona perchè io creo il
fago e ho quindi fagi ricombinanti e non. Per distinguerli si usa il sistema del lacZ perchè questo
sistema è basato sul fatto che vado a prendere solo le colonie che diventano blu cioè solo dove si è
formata la proteina di fusione. Se si è formata significa che l'inserto è espresso perchè non ha un
promotore. Se l'inserto entra fuori frame ho che interrompe lacZ ma non viene espresso. Se entra in
frame ho che il promotore quando è acceso trascrive e fa la proteina di fusione. L'inserto è una
proteina di fusione con lacZ e le cellule sono blu e stanno esprimendo l'inserto.
* western blotting: ho delle proteine sul filtro di nitrocellulosa,si satura il filtro di proteine non
specifiche usando di solito latte in polvere. Si mette l'anticorpo 1° che riconosce la proteina che mi
interessa e si attacca solo dove è presente l'antigene. Si lava il filtro per togliere l'anticorpo in
eccesso. Si deve evidenziare questo anticorpo attaccato e si mette l'anticorpo 2° che riconosce
l'anticorpo 1°. L'anticorpo 2° ha attaccato un sistema di rilevazione infatti è coniugato con la
perossidasi. Questo enzima va a trovarsi esattamente dove è la mia proteina di interesse. Devo dare
un substrato alla perossidasi che lo processa ed emette fotoni. Il substrato è luminolo e lo trasforma
emettendo fotoni. Sulla lastra radiografica vedo dove si trova il gene.
IVEC:
permette di identificare un gene quando conosco qualche attività della proteina corrispondente. Es.
ho un substrato di una proteasi e so che c'è una proteasi nella cellula che taglia questo substrato e
voglio clonare il gene che taglia questo substrato. Devo prendere una libreria di espressione e
prendere i vari cloni e andare a vedere se c'è ad es. un'attività chinasica che fosforila il mio
substrato. IVEC consente di identificare il gene che codifica per una proteina quando conosco
qualcosa di questa proteina. E' un approccio sistematico per clonare geni sulla base della proprietà
biochimica. Significa in vitro expressing clonign. Prima accadeva di prendere la libreria di cDNA,si
trasferiva in coli,si induce l'espressione della libreria,si prendono le cellule,si fanno estratti di
proteine e si fa un saggio biochimico di ogni estratto. Si mette ogni estratto insieme al substrato che
conosco e ci si chiede se c'è una proteina in quell'estratto che sa fosforilare il substrato. Questa cosa
si fa per tutti i cloni della libreria di espressione. Ora questo sistema è abbreviato usando un sistema
di espressione in vitro. Quando devo esprimere un gene ho il cDNA con il promotore e ho che il
cDNA è riconosciuto dai fattori di trascrizione che reclutano l'RNA polimerasi e producono un
mRNA. Esso è riconosciuto dai ribosomi che lo traducono in una proteina. E' possibile ripetere
questo sistema in una provetta senza passare dalla cellula. Per farlo si usa un promotore di T7 che
trascrive ad alti livelli. Si trova a valle del cDNA e nella provetta metto tutto ciò che alla cellula
serve per trascrivere: RNA pol di T,nucleotidi,magnesio,ATP,tampone a pH controllato,sale. Incubo
a 37° e ho che dal cDNA vengono sintetizzati mRNA. Il sistema ha trascritto. Se all'mRNA metto
ribosomi,amminoacil-tRNA,magnesio,ATP,buffer,sali ho che il sistema dà la proteina. Posso anche
mettere aa marcati e ottengo una proteina marcata. Questo sistema non è molto efficiente ed è molto
costoso.
Si parte da una libreria di cDNA non amplificata,si fanno pool di cloni (da ad es. 1000 pool fatti da
100 cloni). Si ha che ogni clone è abbastanza rappresentato perchè ho ad es. 1 clone ogni 100
anziché 1 ogni 1000. E' meglio che l'attività rappresenti l'1% anziché l'un per mille. Faccio
solamente 1000 saggi. Ogni provetta è sottoposta a trascrizione e traduzione in vitro. Si fa un saggio
biochimico buttando dentro ad es. il substrato della chinasi e si ha che la chinasi sarà in una di
queste provette. Almeno una queste provette dovrebbe avere un risultato positivo. Ho però 100
proteine dentro. Si fa un processo di nome deconvoluzione: riprendo la provetta,separo i 100 cDNA
in 10 provette da 10 cDNA l'uno. Troverò una provetta positiva. Risultato: 1000 saggi → provetta
positiva → divisa in 10 provette e ho fatto 10 saggi → divisa in altre 10 → ho fatto 1020 saggi e ho
trovato il clone. E' ovvio che devo avere un saggio facilmente realizzabile.
Es. SDS-page: sistema usato per studiare le modificazioni post-traduzionali delle proteine. Vedo una
banda che si sposta quindi se la banda sparisce vedo l'attività delle proteasi. Ho una proteasi a e
voglio trovare il suo substrato: con l'aggiunta della proteasi ho che la banda che sparisce è
probabilmente il substrato perchè la proteasi se l'è mangiata.
Es. IVEC: identificare quali sono le proteine importanti per fare la mitosi. Si sa che le cellule
normalmente fanno un ciclo cellulare G1-S-G2-M e il passaggio è regolato in modo molto fine da
alcune chinasi. Si sa che perchè la mitosi sia fatta serve un'attività chinasica. Qualcuno dei substrati
della chinasi deve essere fosforilato per fare avvenire la mitosi. Si vanno a cercare le proteine
mitotiche fosforilate dalla chinasi. Ci sono + di 50 proteine fosforilate in modo specifico durante la
mitosi e sono riconosciute dall'anticorpo MPM-2. Ne riconosce tante. Si fanno pull da 100
cDNA,incubo con l'estratto proteico e ho che qualcosa si fosforila se lo incubo con l'estratto
mitotico. Non accade su incubo con l'estratto interfasico. Vedo la fosforilazione in base al
cambiamento di mobilità elettroforetica. Sull'SDS page ho che la proteina non fosforilata migra in
una certa direzione che dipende dalla sua massa mentre la proteina fosforilata viene rallentata. Forse
visto che il gruppo fosfato ha una carica negativa e l'SDS maschera le cariche superficiali dando
una carica negativa a tutte le proteine ho che se la proteina è + negativa lega meno SDS e quindi si
sposta di meno nel gel. La fosforilazione spesso causa lo shift mentre in altri casi non si vede nulla.
Ci sono dei controlli: positivo e negativo. Si ha che da questo screening hanno tolto 20 cloni cioè 20
proteine che sono substrati della chinasi mitotica. Devo verificare che gli estratti funzionino cioè
che l'estratto mitotico sia vivo. Uso una proteina che si sa essere fosforilata dall'estratto mitotico ma
non dall'estratto interfasico. Questo è un controllo positivo. E' stata aggiunta questa proteina
purificata e ho che si muove in modo diverso in base a cosa la incubo. Mi dice che il saggio
funziona e l'estratto mitotico è attivo. Il controllo negativo è che uso una proteina che sia che non
cambia movimento in base agli estratti. Faccio il saggio con i pool e ho che una certa banda cambia
cioè mi dà risultato positivo. Si fa la deconvoluzione e si sono identificati i cloni positivi. Oppure si
può usare un saggio contenente MPM-2. Vedo se questo anticorpo trova qualcosa nell'estratto
mitotico o interfasico. Fa un ulteriore controllo con l'M+CIP. Tolgo la fosforilazione per vedere se
la banda si sposta o resta dove era prima. C'è infine un controllo definitivo: vedo nella cellula se le
proteine sono veramente fosforilate in mitosi. Prendo cellule in interfase,liso e faccio il western.
Prendo le cellule in mitosi,liso e faccio il western. Vedo come shiftano. Si cercano proteine note che
hanno una sequenza simile. Si fa un analisi trascrizionale per vedere dove i geni vengono espressi.
Mi dice se è espresso e come è espresso,dove è espresso e quando/quanto è espresso,con quali altri
geni è espresso.
Per capire la funzione del gene
I metodi che si usano sono: northern blotting,fusioni con la βgal,PCR quantitativa,microarrays.
1) Northern blotting: si guarda l'RNA e separo l'RNA chiedendomi se in questa cellula il gene che
ho è espresso o no. Prendo le cellule,preparo l'RNA,separo l'RNA con un gel denaturante in modo
che l'RNA sia totalmente lineare e si separi in base alla dimensione. A me interessano gli mRNA.
Trasferisco su un filtro,saturo il filtro con DNA di sperma di salmone. Vedo una banda che
corrisponde all'mRNA del mio gene e so in che cellule è espresso. Se confronto cellule diverse so se
questo gene è + o meno espresso. Uso dei pannelli cellulari oppure pannelli di tessuti e vedo dove è
espresso il gene. Solo il northern può dirmi quanto è grande il messaggero e che forma di splicing
c'è.
2) PCR quantitativa: il DNA è amplificato da reazioni a catena della DNA polimerasi. Dopo ogni
turno di amplificazione, il DNA è quantificato. I metodi comuni di quantificazione includono l'uso
delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA doppio-filamento (ds) e gli oligonucleotidi
modificati del DNA (denominati sonde) che sono fluorescenti una volta ibridati con un DNA.
Spesso la PCR real-time è combinata con la PCR retro trascrizionale per quantificare i livelli di
espressione di specifici RNA: la retro-trascrizione produce del DNA complementare a singolo
filamento detto cDNA (complementary DNA) mantenendo inalterati i rapporti relativi di
concentrazione delle diverse specie degli RNA. In questo modo è possibile, ad esempio, misurare
l'espressione relativa di un gene ad un tempo particolare, o in una cellula o in un tipo particolare di
tessuto. La combinazione di queste due tecniche è spesso denominata RT-PCR quantitativa. Questa
tecnica ermette di valutare la quantità di stampo presente ed è un sistema quantitativo, sensibile,
specifico e riproducibile. Serve per valutare il prodotto dell'amplicone monitorando la fluorescenza
emessa durante la reazione. L'amplicone è proporzionale allo stampo solo nella fase esponenziale di
una PCR normale. In generale si ha che nella PCR vedo se c'è o meno la banda e quanto è grande.
Nella PCR real time si ha che il range dinamico è + ampio e sono in grado di vedere quante
molecole ci sono (questa tecnica non dà informazioni sullo splicing). Si ha che la molecola è
fluorescente solo quando si intercala. Vengono usate sonde fluorescenti multiplex. Se invece viene
amplificato tutto si ha una contaminazione aspecifica e si usano primer che si appaiano a tutti e due
i geni e posso distinguerli. Controllo negativo: non deve dare prodotto. Nel grafico si devono avere
delle curve che salgono: queste indicano il n° di molecole stampo durante la reazione. Come
intercalante si usa subr green che però non elimina i problemi di aspecificità. Le sonde fluorescenti
sono usate per misurare il prodotto accumulato. Serve usare una sonda che posso appaiarsi al
prodotto e anche dei primers. Il primer deve avere: delle code che si appaiano tra di loro e che
quindi sono complementari;delle estremità marcate (fluorocromo);un quencher che si eccita con la
lunghezza d'onda del fluorocromo ed emette un'altra lunghezza d'onda. Il quencher serve quindi a
spegnere il segnale del fluorocromo. Si ha che l'appaiamento porta ad avere il quencher da un lato e
il fluorocromo dall'altro. Si ha quando quando i primer si appaiano al prodotto quencher e
fluorocromo si allontanano. Con la sonda elimino il problema della aspecificità. E' possibile anche
inserire due sonde diverse. Le sonde taqman servono per aumentare la specificità della RT-PCR. Il
principio della sonda TaqMan si basa sull'attività esonucleasica 5'-3' della Taq polimerasi. Ho che la
DNA polimerasi mangia l'oligonucleotide solo se esso è appaiato davanti a lei. Quando i nucleotidi
non sono + appaiati leggo la fluorescenza solo quando la polimerasi sta mangiando.
3) Microarrays: è costituito da un insieme di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una
superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio formanti un array (raggruppamento). Tali
array sono usati per esaminare il profilo d’espressione di un gene o per identificare la presenza di un
gene o di una breve sequenza all'interno di una miscela di migliaia di geni. Per studiare gli mRNA,
essi vengono prima estratti dalle cellule, convertiti in cDNA, con l’uso di un enzima chiamato
trascrittasi inversa e allo stesso momento marcati con una sonda fluorescente. Quando si fa avvenire
l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il cDNA target, quest'ultimo rimarrà legato alla
sonda e può essere identificato semplicemente rilevando la posizione dove è rimasto legato. Vedo
dove è il segnale fluorescente: metto sul filtro la sonda non marcata e ci vado sopra con l'mRNA
marcato. Negli spotted microarrays, i probe sono oligonucleotidi, cDNA o piccoli frammenti
prodotti con la tecnologia PCR corrispondenti a mRNA. Questo tipo di microarray sfrutta
l’ibridazione di DNA con cDNA da due campioni comparati (es. paziente e controllo), che sono
marcate con due differenti fluorofori. I campioni possono essere miscelati e ibridizzati in un singolo
microarray e quindi analizzati, permettendo la visualizzazione dei geni up-regolati e down-regolati
contemporaneamente. I microarrays si possono anche utilizzare per piastrare una libreria specifica.
Gli svantaggi sono che l'array è limitato a un tessuto e l'array è sbilanciato. Quindi nei cDNA
microarrays: scelgo i cloni; li amplifico; li spotto su un substrato solido (circa 10000 cloni a
vetrino); marco il cDNA derivato dall'mRNA; faccio ibridare la sonda con il cDNA. I limiti sono:
quantità di sonda richiesta e normalizzazione e riproducibilità del dati. Non è possibile usare una
marcatura radioattivi perchè i segnali radioattivi si sovrapporrebbero tra loro. I vantaggi sono:
• Sono applicabili a qualsiasi sistema
• Hanno costi molto inferiori
• Sono più flessibili nella progettazione
• Si basano su ibridazione tra sequenze lunghe e quindi sono meno suscettibili a problemi di crossibridazione e meno sensibili a polimorfismi
DNA chips
I chips sono fatti di silicio a cui gli oligonucleotidi sono legati covalentemente. Per ciascuna ORF ci
sono 20 oligon con un match e 20 con un dismatch. La sonda completa per un gene è costituita da
20 aree distinte, così ogni gene deve essere identificato in modo molto stringente da ben 20 sonde
(identificando così anche varianti di splicing del gene). Inoltre per evitare l'ibridazione aspecifica
ogni area è fiancheggiata da un'area di controllo. Mi aspetto che tutti i 20 oligon diano un segnale +:
se in uno non c'è ho un'ibridazione aspecifica. Se il segnale è positivo è moloto probabile che il
gene sia espresso. I 20 con un mismatch mi indicano quanto è specifico il segnale. Gli
oligonucleotidi sono sintetizzati così da sinistra a destra:
OH in posizione 1 5'ATC.........GGC3'
OH in posizione 2 5'TAT..........CATC3'
OH in posizione 3 5'CGG.........GATG3'
Gli OH sono protetti da un gruppo fotosensibile e non sono esposti. In posizione 3 ho ad es. che non
passa il raggio e l'OH resta chiuso. Incubo con una soluzione di dCTP che si attacca in 1 e 2 ma non
in 3. I chip sfruttano una proprietà importante del DNA, ossia l'appaiamento tra basi complementari
(la T si appaia con la A e la G con la C) nella sua struttura.Mi serve una G al 1° e al 3°. Mi serve
una T al 2° e al 3°.I vantaggi sono che vengono sintetizzati sul chip con densità è alte e che sono
sicuro di quanti oligon siano sintetizzati. Preparazione del campione: si usa aRNA che è RNA
amplificato. Si usano da 0,2 a 2 μg di RNA. Si usano gli oligon+promotore di T7 per fare il cDNA.
Cioè si retrotrascrive in vitro l'mRNA a cDNA. L'ibridazione DNA-RNA è + stabile e si può usare
questo sistema anche quando si ha poco mRNA. Gli aRNA sono pieni di biotina che interagisce con
avidina e in ogni posizione dell'mRNA piazza una molecola di fluorocromo verde. Il DNA viene
marcato con biotina. Incubo mRNA amplificato con il fluorocromo verde o rosso: verde per la
cellula sana e rosso per la cellula malata. Il colore indica dove è espresso un particolare gene.
Faccio + cicli di trascrizione e posso togliere tutto l'RNA che voglio. Ho maggior riproducibilità
perchè i chip sono uguali per tutti i laboratori. Ripeto mettendo a sinistra il rosso e a destra il verde
e uso questo come controllo perchè il colorante potrebbe influenzare l'esperimento. Risultati: i
punteggi indicano l'affidabilità del segnale. Se ho una variazione significativa del 2X dico che quel
gene è sovraespresso. Dopo l'analisi si fa un clustering cioè si raggruppano i geni in gruppi simili
tra loro dividendoli in base al profilo trascrizionale. Geni appartenenti allo stesso cluster hanno
profili trascrizionali simili e quindi potrebbero avere funzioni simili. I vantaggi del DNA chips
sono:
• Consentono di ottenere una maggiore densità
• Includono sequenze non necessariamente presenti nel cDNA
• Sono altamente riproducibili
• Contengono controlli mismatch
• Non richiedono apparecchi dedicati per la produzione degli array
• Producono dati che sono comparabili tra gruppi diversi
Drug discovery
Pathway biochimico coinvolto in un processo patologico e si possono cercare molecole che
legano/modificano l'attività di tali enzimi.
-drug discovery I: possibile quando abbiamo i geni,isolare proteine omologhe e testarle su target
simili,mutagenesi sito-specifica
-drug discovery II: identificare possibili geni target,vedere i pathway alterati,microarrays sulle
molecole
Caratterizzazione del gene/ proteina
La creazione di mutanti si può fare per: mutagenesi per delezione , RNAi , mutagenesi random in
vitro o mutagenesi sito specifica . La mutagenesi di solito si fa per irraggiamento (raggi x o
gamma), mutagenesi chimica (EMS),inserzionale cioè tramite trasposoni. Più mutageni do più
muoiono e si fa una mutagenesi al 50% di letalità (aumento la frequenza di mutazione di circa 1001000 per).
Mutagenesi per delezione:
Cosa succede se manca la funzione codificata dal gene nella cellula? Mutagenesi per delezione
significa eliminare completamente o quasi la sequenza codificante dal genoma. In caso di lievito ho
in mano la sequenza del gene e so che questo gene è presente nel genoma. Voglio eliminare questo
gene dal genoma e devo sostituirlo con una cassetta che contiene un marcatore selettivo. Serve per
capire se questo gene è stato deleto o no. Si sfrutta il fatto di avere una ricombinazione omologa
efficiente. Se in lievito metto un frammento di DNA lineare che è omologo al gene ho che viene
integrato grazie a 2 eventi di ricombinazione omologa (uno da un lato e l'altro dall'altro). Le
estremità del DNA lineare sono ricombino-geniche. La formazione della singola elica è + facile se
ho estremità libere che vanno a cercare la regione omologa e ho ricombinazione. Questo sistema
non funziona quasi mai in mammifero. La cassetta + classica codifica per la resistenza al G418. Le
cellule di lievito normalmente muoiono se le metto su una piastra contenente G418. Se contengono
quel marcatore selettivo KAN posso far crescere le cellule su G418. Posso sequenziare il gene e
identificare le estremità del gene che mi interessano. E' lì che voglio far avvenire la ricombinazione.
Disegno 2 primer per PCR che contengano la regione 1 e la regione 2 che sono le regioni di
omologia con il gene che voglio distruggere. Devono essere capaci di appaiarsi sul plasmide
standard che contiene la cassetta KAN. Ho dei primer ibridi con una parte che si appaia su KAN e
una parte che si appaierebbe su YFG. Dall'altra parte ho un primer che si appaia su KAN e una coda
che si appaia su YFG. Faccio la PCR e ottengo un prodotto che contiene la cassetta KAN e da un
lato contiene la sequenza 1 mentre dall'altro la sequenza 2. Quando trasformo le cellule di lievito ho
che la sequenza terminale è molto ricombino-genica e va a trovare il suo omologo,dall'altra parte
avviene l'altro evento di ricombinazione di YFG che è dove c'è la sequenza 2. Ottengo un
cromosoma che sostituisce YFG con KAN. YFG verrà degradato mentre KAN viene integrato al
posto di YFG. Questo è un processo molto efficiente e dipende dalla localizzazione cromosomica
del gene (se si trova in una cromatina molto compatta è difficile che ricombini) e dalla lunghezza
delle estremità (se sono troppo lunghe l'evento di invasione non è facilitato). La coda omologa può
essere lunga al max 40 nucleotidi in lievito per ottenere una ricombinazione molto efficiente. Voglio
ora andare a vedere se queste cellule ha un fenotipo. Per vedere quelle che hanno integrato su KAN
seleziono con G418 perchè KAN è mantenuto dalla cellula solo se si integra. Devo fare un controllo
e utilizzo il Southern blot. Devo guardare il locus della wt e della cellula trasformata e chiedermi se
sono uguali o diversi e se questo locus diverso contiene la cassetta KAN. Se prendo il DNA
genomico di una cellula wt e lo taglio con un enzima e so dove taglia perchè conosco la sequenza di
questo locus ---//-----(//YFG)-----//-Separo su un gel di agarosio,trasferisco il DNA separato sul filtro di nitrocellulosa e faccio
un'ìbridazione con una sonda specifica per queste regioni. Mi aspetto di trovare una banda di 500 pb
e una di 1500 bp: ---//-----(KAN)-----//-- non si vede il 2° frammento perchè non c'è + YFG in
mezzo e vedo una banda diventata 2kb. Mi dice che tra wt e mutante c'è una differenza. L'evento di
trasformazione ha modificato YFG. Se faccio una sonda per YFG non vedrei nessuna banda cioè
non so se ha ibridato o meno. Se vedo bianco non è un risultato! Può accadere che sia salto il sito di
restrizione. Per vedere se c'è l'estratto KAN prendo una sonda su KAN. L'ibridazione con il KAN
mi dice esattamente se KAN c'è o meno. Prendo quindi un enzima di restrizione che taglia in punti
precisi di KAN dato che conosco la sequenza di KAN. E' un sistema che mi permette di ricostruire
esattamente la banda di restrizione del locus e posso quindi sapere se la banda è di YFG o di KAN.
L'altro sistema + rapido è quello di usare la PCR. Prendo un primer:
–//a----(YF//bG)----//d----- wt --//a----(//cKAN)----//d----Se faccio una PCR con la coppia a e b ho che nel wt mi aspetto un segnale con una dimensione
definita da a a b. Se faccio la PCR sul mutante non trovo nulla quindi faccio un controllo con ac.
Nel wt non vedo nulla mentre in KAN sì, se faccio la PCR con ad nel wt vedo la banda 1200 kb ad
esempio mentre in KAN 800 kb. Usare ad ha senso solo se wt ha una dimensione diversa KAN. Ad
ibrida sia sul wt che sul mutante. A volte succede che KAN si integri nel posto sbagliato. Si
controlla che tutto vada bene. La mutazione per delezione si fa su un ceppo aploide ed è sempre
recessiva (del diploide non vedo la mutazione). Questo esperimento non è possibile farlo per tutti i
geni: non posso farlo con i geni essenziali.
1° SISTEMA per studiare i geni essenziali
Per studiarli devo fare la delezione nel diploide
----(POL1)---- wt
----(KAN)---Faccio sporificare e ottengo 2 spore con la sequenza wt e 2 spore con la sequenza mutante. Le spore
con la sequenza mutante però muoiono. Per sapere cosa succede alle cellule se perdono POL1 devo
trasformare il ceppo con un plasmide che porta POL1 e un marcatore selettivo ura3. Queste cellule
avranno una copia di POL1 sul cromosoma,una copia deleta di POL1 e una copia di POL1 sul
plasmide associata al marcatore ura3. Faccio sporificare il diploide e ottengo 2 spore con il
cromosoma POL1,2 spore con il cromosoma deleto KAN. Questo plasmide è andato a caso un po'
di qua e un po' di là. Le possibili combinazioni sono: wt sul cromosoma che se ne va con il
plasmide,wt che se ne va senza il plasmide,gene mutato che se ne va con il plasmide,gene mutato
che se ne va senza plasmide. Abbiamo queste 4 spore: POL1 sul cromosoma-POL1 + plasmide;
POL1-POL1 senza plasmide; KAN sul cromosoma-POL1 con il plasmide; KAN sul cromosoma e
nessun plasmide. La 1° spora è viva perchè ha POL1 sul cromosoma,la 2° spora è viva perchè ha
POL1 sul cromosoma,la 3° è viva perchè ha POL1 sul plasmide,la 4° è morta. Metto su G418 e
vedo che la 3° è l'unica che vive,verifico se ha dentro ura3 e ce l'ha per forza. Questa è la spora che
mi interessa. Prendo la cellula e faccio crescere un litro di queste cellule. Gli do FOA e ho che
questo facilita la perdita del plasmide e ho che POL1 va via. Quando do il FOA favorisco solo le
cellule che hanno il plasmide. Voglio vedere, in mezzo alle cellule che non crescono + perchè non
hanno + POL1, come si bloccano. La cellula senza plasmide cresce un po' fino a quando c'è la
proteina poi smette di crescere. Nel caso di una proteina richiesta per l'inizio della replicazione mi
aspetto che queste cellule si accumulino tutte in G1 (come cellule non gemmate). Ipotizzo quindi
che le cellule abbiano problemi nella sintesi del DNA.
2° SISTEMA per studiare i geni essenziali:
Uso i mutanti condizionali: mutanti che in condizioni permissive non esprimono la mutazione e in
condizioni non permissive esprimono la mutazione. I più noti sono quelli temperatura sensibile. La
temperatura permissiva in lievito è 25° mentre la restrittiva è 37°. Il problema è che abbiamo in
mano un gene. Queste mutazioni rendono + instabile la struttura della proteina: quando alzo la
temperatura salta qualche legame e la proteina si unfolda e spesso viene degradata. E' stata
sviluppata una tecnologia in lievito. Si crea dei mutanti usando il degrone cioè qualcosa che induce
la degradazione. Quello che voglio fare è eliminare la proteina essenziale e vedere cosa succede alle
cellule. Si può spegnere l'espressione del gene ed eliminare l'mRNA e vedere cosa succede. Sistema
un po' lento: se la proteina è stabile si ha che l'esperimento dà risultati sfalsati. Se spengo ad es. pol
α ci vogliono 7 generazioni prima che le cellule muoiano. L'altro sistema è di far fuori la proteina
ed è quello che fa il mutante Ts. Per fare ciò si usa il degrone. L'obiettivo è avere un costrutto del
genere: abbiamo il gene che codifica per pol α e voglio avere una fusione con il degrone. La scatola
contiene la sequenza di una molecola di ubiquitina e un pezzo di DHFR che Ts. Queste sequenza
quando è tradotta produce un pezzo di DHFR che a 25° è ok mentre a 37° perde il folding. In DHFR
ci sono due residui di lisina. Per fare questo costrutto esiste una cassetta che può andare ad essere
integrata per ricombinazione omologa. Anziché integrare KAN integro questa cosa. Faccio
esprimere il gene a temperatura permissiva e ho una proteina di fusione che si porta DHFR e
l'ubiquitina. L'ubiquitina viene usata dalla cellula come una molecola che dà diversi tipi di segnale:
si sa che regola la degradazione delle proteine. La degradazione funziona così: c'è un enzima che
trova una lisina nella proteina e gli attacca una molecola di ubiquitina. Se questa proteina deve
essere degradata si ha che questa molecola di ubiquitina diventa una catena di poliubiquitine. E' una
catena + o – ramificata. Per degradare una molecola di proteina servono molte molecole di
ubiquitina. La cellula deve fare in modo di riciclare le ubiquitine. La cellula ha un sistema che ogni
volta che trova una proteina con attaccata un ubiquitina nel modo corretto, ricicla l'ubiquitina
staccandola. La cellula recupera l'ubiquitina e se la porta via. La poliubiquitinazione è un segnale
degradativo. Può interessare la lisina 48 o 63 e ha un significato degradativo o regolativo. La cellula
cerca di riciclare quelle che non sono K63. L'ubiquitina nella cellula è sintetizzata come una
molecola con diverse ripetizioni di ubiquitine. Quando trova una ubiquitina fusa ad un'altra
proteina la taglia. Si ha che la cellula trascrive una ripetizione di geni dell'ubiquitina e la proteina di
fusione prodotta la taglia a pezzettini. Quando vede l'ubiquitina che è parte di una proteina di
fusione la stacca. Le proteine di solito iniziano con AUG, però qui si ha che l'ubiquitina è stata
staccata e si ha che resta fuori un residuo di arginina. La stabilità di una proteina dipende dal
residuo ammino-terminale. L'arginina in N-terminale è la + destabilizzante. La cellula si prepara a
degradare la proteina. Lo scopo è fare degradare rapidamente la proteina di interesse. La scatoletta
davanti che si mette destabilizza la proteina di interesse. Perché funzioni la poliubiquitinazione ci
devono essere delle lisine a cui andare ad attaccare le ubiquitine. Qui le lisine sono nascoste.
Quando sposto le cellule a 37° ho che il dominio DHFR perde il folding (è Ts) e le lisine vengono
esposte. Arginina e lisine esposte: la cellula degrada la proteina e piazza quindi la poliubiquitina. La
proteina viene subito degradata. Il sistema del degrone non può essere usato per tutti i geni e non
tutte le proteine sono degradate così efficientemente.
Knock out
Si usa questa tecnica quando voglio andare a vedere cosa succede nell'animale. Devo eliminare il
gene quando voglio analizzare la funzione del gene ad es. nello sviluppo dell'animale. Se voglio
fare un knock out devo eliminare un esone ---E1---E2---E3
Si inattiva ad es. l'esone 2 dal locus genico della cellula e sostituirlo con un marcatore selettivo.
Questo è l'unico modo che abbiamo per selezionare le cellule che hanno eliminato l'esone da quelle
che non l'hanno eliminato. Si usa un marcatore Tk (timidina chinasi). Si fa un costrutto che contiene
l'esone 1,la cassetta per la resistenza all'antibiotico e la regione 3. Negli eucarioti superiori si ha una
bassa efficienza di ricombinazione. Le cellule di topo sono sensibili a G418 ma resistenti a
Gancyclovir. La sensibilità a Gancyclor è dovuta al fatto che è un analogo della timidina ed entra
nelle cellule,se c'è la timidina chinasi questa fosforila il Gancyclovir pensando che sia timidina. Il
Gancyclovir fosforilato è diventato un nucleotide trifosfato e può entrare nella biosintesi degli acidi
nucleici. E' però un composto tossico e si ha che la cellula muore. Questo costrutto che devo
trasfettare nelle cellule di topo porta un gene Tk che fornisce sensibilità a Gancyclovir e la
resistenza a G418. Ho un marcatore di selezione e un marcatore di contro-selezione. Se cioè do
G418 seleziono le cellule che hanno dentro tutto il costrutto mentre se do timidina chinasi seleziono
le cellule che non hanno dentro tutto il costrutto intero o comunque Tk. Questo sistema del
Gancyclovir è importante perchè io trasfetto le cellule in topo,il DNA entra nella cellula e va ad
integrarsi + o – a caso nel genoma. ---E1---E2---E3 se il costrutto si va ad integrare a caso ho una
cellula che contiene sia la copia wt del gene che la copia che manca delle due. Le cellule di partenza
sono: se dò G418 sono sensibili perchè le cellule di partenza non hanno nessun costrutto. Se le
trasfetto e il costrutto si infila a caso nel genoma ho che le cellule diventano resistenti a G418:
Tk---E1---NEO---E2.
Se si integra nel punto giusto tra E1 ed E3 ho E1---NEO---E2 ho che il pezzo Tk è stato exciso e ha
tirato dentro NEO. Queste cellule sono G418 resistenti. Se uso solo la resistenza al G418 riesco sì a
distinugere le cellule trasfettate da quelle non trasfettate ma non riesco a distinguere le cellule che
hanno fatto ricombinazione omologa da quelle che non l'hanno fatta. Tutte sono G418 resistenti ma
se do Gancyclovir ho che le cellule wt sono resistenti perchè non hanno la timidina chinasi mentre
le altre sono sensibili perchè hanno dentro la timidina chinasi. Posso selezionare le cellule che mi
interessano con G418 e Gancyclovir e seleziono le cellule che hanno fatto ricombinazione omologa.
Devo fare controlli con Souther e PCR per verificare che la cassetta si sia infilata nella regione 2.
Prendo le cellule staminali embrionali del topo,introduco il costrutto e seleziono le cellule che
hanno fatto l'evento di ricombinazione. Queste cellule vengono impiantate in una blastocisti di un
topo femmina. Queste blastocisti viene impiantata in una madre surrogata in cui è stata simulata una
gravidanza anche se non ha una blastocisti di su. Vengono prodotti dei topi: non sono topi
omozigoti. E' una chimera cioè solo alcune cellule hanno la mutazione che abbiamo messo mentre
le altre non ce l'hanno. Alcune cellule vanno a finire nella linea germinale e portano la mutazione.
Possiamo usare queste cellule germinali x fare un altro incrocio. Si deve verificare che la chimera
porti la mutazione nella linea germinale. Se c'è abbiamo alcune cellule con la delezione e altre
cellule che non la portano (è una chimera). Facciamo incrociare questo topo con un topo normale e
otteniamo alcuni topi eterozigoti (delezione/wt). Vogliamo ottenere gli omozigoti dagli eterozigoti e
quindi dobbiamo fare un altro incrocio. Dobbiamo incrociare 2 eterozigoti tra di loro: voglio
ottenere l'omozigote che porta la delezione e ottengo il topo knock out. Se il gene è essenziale il
topo knock out è morto ma se il gene è importante nello sviluppo ho che il topo muore in utero. Se
l'omozigote si ferma posso studiare comunque il fenotipo dell'embrione che non ha terminato lo
sviluppo.
Topo knock out condizionale:
il topo contiene la sequenza codificante intera e si sviluppa normalmente. Posso chiedermi cosa
succede se faccio perdere la funzione al gene. Il sistema funziona così:
---E1---E2---E3 →
E1---//lox/---NEO---E2---//lox//---E3
La modificazione che voglio ottenere è questa: sostituisco l'E2 con l'E2+NEO attaccandogli di
fianco questi due siti lox. Sono sequenze corte che sono riconosciuti in modo specifico dalla
ricombinasi cre. Se NEO è un marcatore,c'è lox e lox ho che la ricombinasi fa avvenire una
ricombinazione in maniera sequenza specifica. Il prodotto sarà un cromosoma che ha perso il NEO.
---//-----lox------//
voglio un topo in cui l'esone 2 è circondato da siti lox finchè il topo non vede la ricombinasi cre.
Questa modifica il genoma del topo. L'utilità di questo sistema è che posso decidere quando far
saltare via E2 durante il ciclo di sviluppo del topo e vedere la funzione del gene di interesse. Posso
prendere queste cellule e dargli cre solo ad es. nel cervello per vedere l'effetto della mutazione in un
organo. Devo fare un altro incrocio per dare cre alle cellule. Il topo deve avere nel suo genoma il
gene cre sotto il controllo di un promotore regolabile ON/OFF. Normalmente è tenuto spento ma
quando voglio far excidere E2 dò al topo l'induttore del promotore. A me interessa che sia sempre
spento e che possa essere acceso. Ho che la ricombinasi cre viene espressa e taglia E2. Questo topo
esprime quindi la mutazione (ho fatto la trasfezione). Questo promotore può essere la tetraciclina. In
base alla sostanza che do il promotore si accende o si spegne. Oppure posso mettere un promotore
specificamente espresso in un determinato organo. Oppure è possibile usare una ricombinasi flip
che rovescia nel modo corretto E2. Vedo cosa succede quando il gene non c'è,faccio fare il flipping
e vedo cosa succede quando ridò il gene.
RNAi
Questo sistema si usano nelle cellule in coltura. Il principio è quello di cercare di eliminare
l'espressione di un gene. Voglio vedere cosa succede alle cellule se quel gene non è espresso.
Anziché andare a togliere la sequenza dal genoma cerco di togliere l'mRNA. L'RNAi cancella
l'mRNA. Il gene trascrive,produce mRNA ma è eliminato e la proteina non dovrebbe essere fatta.
Non impedisco l'espressione del gene perchè il gene è comunque trascritto. Quanto funziona bene
l'RNAi dipende da quanto è trascritto il gene o da quanto velocemente è degradata la proteina. A
volte accade che con l'RNAi si elimina totalmente la proteina oppure viene ridotta. Devo sapere
quanto era efficiente l'RNAi. Se abbiamo una cellula con YFG e questa cellula accumula RNA a
doppia elica che contiene la sequenza YFG,questo RNA a doppio elica causa la repressione
dell'espressione di questo gene. YFG viene trascritto in un mRNA che va a dare YFP,se butto dentro
l'RNA ottengo -YFP. E' inibita l'espressione del gene. Il sistema funziona perchè quando la cellula
vede l'RNA a doppia elica la cellula cerca di degradarlo. Interferisce con l'espressione genica a
livello post-trascrizionale. Il trascritto viene fatto,l'RNAi deve mangiare questo trascritto ma se
questo trascritto gira nella cellula qualche minuto prima di essere mangiato e ce ne è tanto riesce ad
iniziare ad essere tradotto. Se è tradotto si ha che un po' di proteina viene fatta se ad es. i codoni
sono molto frequenti. Se questa proteina è molto stabile abbiamo che la funzione del gene è svolta
nella cellula. Se la trascrizione è invece lenta,si fa poco mRNA e l'RNAi se lo va a mangiare subito
si ha che l'mRNA non viene tradotto. Oppure ne è tradotto poco la proteina è instabile e si ha che la
cellula muore. Il tutto dipende da come viene trascritto e tradotto il gene,dalla stabilità della
proteina e da come faccio l'RNAi. In C. elegans ci sono gli siRNA e gli shRNA. Nello small
interference RNA vengono usate corte sequenze di RNA oppure shRNAi in cui si usano gli siRNA.
Si fa in modo che nella cellula entrino o vengano prodotte queste molecole che causano la
degradazione dell'RNA. Se ho cellule in coltura faccio la trasfezione in cui butto dentro un shRNA.
C. elegans è un verme e io devo intingerlo nella provetta che contiene RNA interferenti e si ha che
l'RNA entra nelle cellule ed è trasmesso in tutte le cellule di C. elegans. RNA entra e va ad inibire i
miei YFG. Oppure posso anche prendere un plasmide T7 e trasformarlo in coli si ha che la
polimerasi di T7 viene trascritto e ottengo tante molecole di siRNA. Coli si riempie di queste
molecole di siRNA,faccio una patina di coli e ci butto sopra i vermi. Questi mangiano coli e
mangiano anche gli siRNA. Queste molecole raggiungono tutte le cellule e l'espressione del gene
viene inibita. Il vantaggio di questo sistema è posso fare degli screening usando le library di siRNA.
Faccio un ceppo di coli che esprime siRNA che inibisce YFG1 o YFG2. Metto il verme e vado a
cercare il fenotipo che mi interessa.
Se ho all'interno della cellula RNA a doppia elica esso viene tagliato in pezzettini da un enzima
Dicer (c'è in tutte le cellule umane e fa parte di un sistema di difesa dai retrovirus); i pezzettini
vengono catturati da un complesso di proteine e si forma un complesso fatto da proteine+RNA;
questo complesso va alla ricerca delle sequenze complementari di questo siRNA. Questo complesso
contiene proteine Risk che trovano le sequenze complementari nell'mRNA e si ha ibridazione del
siRNA sull'mRNA. Questo RNA a doppia elica viene tagliato e non può + fare la proteina. L'RNA
viene degradato ma può essere a sua volta trasformato in una sequenza complementare che può
andare a sua volta ad inibire la molecola di mRNA. C'è qualche retrotrascrittasi che converte l'RNA
nel pezzo di RNA complementare. Dal punto di vista pratico io devo trasfettare nella cellula siRNA
che si appaia alla sua sequenza complementare e il messagero viene tagliato. In questo modo
l'mRNA non è + espresso. Si devono disegnare + siRNA e provarli. L'efficienza con cui
l'appaiamento avviene e l'efficienza dipendono dalla sequenza del gene. Si fa un controllo in cui si
inserisce l'RNA e ho che la cellula ne è modificata. Devo fare una verifica con l'siRNA scrambled:
GACCAGUAC
CAUCAGCCAC
sono le stesse basi mescolate in ordine casuale. Se vedo l'effetto che vedo è dovuto alla trasfezione
o all'ingresso di RNA che non centra con la cellula e vedo lo stesso fenotipo so che è una bufala.
Vedo lo stesso fenotipo se butto dentro un siRNA che non centra niente. Se la cellula sta bene
immagino che sia un fenotipo dovuto dall'inibizione dell'espressione di YFG. Faccio un secondo
controllo: può essere che il siRNA di YFG vada ad inibire l'espressione di qualche altro gene xxx.
RNA potrebbe appaiarsi all'mRNA di xxx causerebbe la down-regolazione anche di xxx. Il fenotipo
che io vedo è dovuto alla down-regolazione di YFG o di xxx?Uso 2 o 3 diversi oligonucleotidi in
diverse posizioni lungo il gene e devo vedere lo stesso fenotipo. Trasfetto la cellula con un
nucleotide alla volta. Questi si chiamano effetti off-target cioè sono effetti che si trovano su un
target che non è il mio. La trasfezione ha un effetto transiente perchè si ha non si propaga nelle
generazioni future. Si usa un shRNA che fa un loop perchè contiene due sequenze complementari
tra di loro e si ripiega. Posso fare un costrutto dove ho clonato un pezzo di DNA che codifica per
quell'shRNA. Trasfetto il costrutto nelle cellule che deve avere un marcatore. Voglio ottenere un
clone stabile in cui il pezzo di DNA che contiene un promotore regolabile,un marcatore e il
costrutto sia integrato in modo stabile. Posso selezionare cloni stabili che all'interno del genoma si
portano la sequenza che codifica per questo shRNA. Ho cellule in cui posso fare RNAi in maniera
stabile. Ho che la cellula trasmette alla sua progenie l'intero costrutto. Se accendo il costrutto perchè
ho messo TET ON ho che tutte le cellule che hanno dentro shRNA produrranno un RNA che si
folda e viene tagliato subito e va ad inibire l'shRNA. Basta poco RNA a doppia elica per spegnere
geni molto espressi ed è persistente cioè dura fino alla generazione dopo e attraversa barriere
cellulari perchè posso intingere il verme.
Creazione di mutanti
Mi interessa fare la mutagenesi del gene e creare dei mutanti puntiformi. Se ho una proteina che ha
una sua attività catalitica e recluta un altro enzima che ha un'altra attività catalitica posso avere un
mutante che perde un'attività ma mantiene l'altra. Posso avere una proteina che ha un particolare
sito di legame su cui possono legarsi diversi fattori che sono in competizione tra di loro. Posso
avere un mutante che inattiva un enzima cioè la proteina si può legare ma è inattiva vedo il fenotipo
dell'inattivazione di questa attività. Se tolgo tutta la proteina vedo il fenotipo dovuto all'inattività e il
fenotipo dovuto al fatto che questa proteina è l'unica che può legarsi là quindi questa proteina è
sempre legata. Oppure se ho proteine che svolgono + funzioni posso caratterizzare tutte le diverse
funzioni di questa proteina. Ho dei mutanti a cui manca una funzione,altri a cui ne manca un'altra.
Faccio quindi degli studi struttura-funzione che non riesco a fare con la delezione. Se voglio avere
delle risposte + complete è meglio creare mutanti puntiformi.
Mutagenesi in vitro:
Ho un gene YFG sul plasmide e voglio ottenere da questo plasmide una libreria di mutanti cioè
generare tanti mutanti puntiformi diversi di questo gene. Voglio fare un analisi per cercare di capire
quali sono le funzioni di YFG. Ho due modi per farlo: mutagenesi chimica e PCR. Mutagenesi
chimica significa prendere il plasmide e incubarlo con un agente mutageno. Prendo la provetta,butto
dentro il plasmide e l'agente mutageno come ad es. idrossilammina. Quest'agente altera le basi del
DNA. + tempo incubo con l'agente mutageno + aumenta il n° di mutazioni + diminuisce l'attività
del gene. Se ho + mutazione rischio di inattivare tutte e tre le attività di una certa proteina ad es.
Quindi è come una delezione. Devo fare un bilancio perchè vorrei avere tutte le singole mutazioni
che possono avvenire in quel gene. Voglio una miscela di plasmidi dove ciascuno ha una mutazione
in un posto diverso dagli altri. Non posso sapere a priori quali sono le condizioni migliori quindi
faccio diverse prove: campione a tempo zero,uno,due,tre e ad ogni step inattivo l'idrossilammina
con un tampone. Ho una collezione di campioni e man mano che il tempo passa ho le mutazioni. Io
voglio trovare la situazione in cui ho un numero di mutazioni alto ma non troppo da demolire il
plasmide. Vado a vedere in letteratura per vedere i tempi migliori. Ho una libreria con una
popolazione di plasmidi: 1)–//-------2)----//---3)--------//
Li inserisco in cellule che mancano di una funzione e vado a vedere cosa succede. Prendo la cellula
e butto dentro il plasmide e vedo che fenotipo causano le mutazioni. Quando faccio la mutagenesi
chimica ho che la mutagenesi avviene a caso ma non è un problema. Se ho metto il marcatore
ura3,un centromero,un'origine di replicazione ho che ho mutagenizzato tutto. Se mutagenizzo ARS
e questo perde la sua funzione e vado poi a mutagenizzare l'ARS mutato vedo che il plasmide non
dà cellule trasformate perchè non può essere tenuto e non mi dà colonie. Se inattivo ura3 ho che il
plasmide non viene selezionato. Se elimino il centromero ho che il plasmide è instabile e dà colonie
+ piccole. Quindi non crea problemi avere delle mutazioni fuori dalla regione di interesse perchè la
maggior parte di quei plasmidi sono persi quando seleziono. Ora ho trasformato e mi chiedo cosa
succede. Posso recuperare il plasmide dalla cellula di lievito e andarlo a sequenziare: vedo che una
certa posizione è essenziale per una certa funzione.
Es. Ho un enzima che replica che si blocca quando trova una lesione sul DNA. Si lega una proteina
che recluta enzimi che sono capaci di superare questa lesione. Se non si supera le lesione le cellule
sono morte perchè non possono + replicare. Se ho una DNA pol a e b e polB è il mio YFG. La polb
ha un dominio catalitico e un dominio di legame che riconosce la proteina capace di indicare alle
due polimerasi di andare lì per superare la lesione. Se ho un mutante nel dominio di legame ho che
polB non può essere reclutata e polA viene reclutata ma passa oltre. Le cellule stanno bene ma non
benissimo. Se ho una mutazione nel dominio polimerasico ho che la proteina può essere reclutata
perchè il dominio di legame funziona ma polB arriva lì ma non è capace di fare nulla perchè il
dominio catalitico è morto ed è tossica. Non è capace di legarsi e previene anche la funzione di
polA che invece potrebbe legarsi. Se invece avessi una delezione totale di polB lui non potrebbe
fare il suo lavoro ma polA sì. Per fare la mutagenesi in vitro devo avere la sequenza del plasmidee
la posso fare sul gene di interesse. In vivo faccio la mutagenesi su tutto il genoma.
Es. con PCR. Il vantaggio è quello di decidere dove mettere la mutazione. Scelgo i 2 primer e
mutagenizzo quello che c'è tra i due primer. Metto in una provetta Taq,nucleotidi,magnesio e il
buffer. Non trovo molti mutanti e devo aumentarli. Posso togliere il magnesio e metterci il
manganese. In questo modo ho che la polimerasi sbaglia + spesso e aumenta la probabilità di avere
mutanti. Oppure posso cambiare i rapporti tra i nucleotidi. Do 200 μM dATP,200 μM dGTP,200 μM
TTP ma se io metto 20 μM dGTP ho che quando deve mettere la G fa + fatica a trovarla perchè è 10
volte meno concentrata. Spesso la polimerasi al posto della G mette un altro nucleotide. Mi preparo
4 provette: una con dGTP basso,una con dATP basso,una con dTTP basso e una con dCTP basso.
Faccio 4 reazioni di PCR e mescolo tutti i prodotti. Dovrei riuscire ad avere tutte le possibili
mutazioni che possono colpire questo frammento. E' il sistema che mi dà la + grande varietà di
alleli. Ho nella provetta tanti frammenti ognuno con una mutazione in una posizione diversa. Questi
frammenti devo metterli in un vettore che mi consenta di esprimerli: o li clono facendo la ligation
oppure uso il lievito. Se voglio clonare normalmente devo fare una digestione del frammento,
digestione del vettore,purificazione del vettore,defosforilo il vettore perchè se è tagliato con un
enzima solo si può richiudere,ligation,trasformazione di coli,isolo le colonie,preparo il DNA
plasmidico,trasformazione dell'ospite. Se il mio ospite è il lievito posso prendere il plasmide iniziale
e lasciargli solo il pezzo in fondo o mettere oligo con codine per la PCR. Voglio fare in modo che le
estremità dei prodotti di PCR siano uguali alle estremità del plasmide. Lo faccio o tagliando via
quasi tutto YFG o mettendo come codine ai primer delle sequenze plasmidiche. Mescolo in provetta
la libreria di mutanti con il plasmide. Trasformo le cellule di lievito con questa miscela di DNA che
è un plasmide lineare. Ho che le cellule di lievito,appena questi entrano,fanno ricombinazione e il
plasmide si chiude su se stesso. Questo metodo si chiama GAP repair cioè è riparato il buco del
plasmide.
Mutagenesi sito-specifica
Ho il mio gene sul plasmide e devo fare la mutazione in un punto particolare. Voglio cambiare un
certo aa con un altro per vedere se questo aa ha un ruolo importante. Ad es. mi chiedo a cosa serve
la fosforilazione. Posso cercare dove avviene e fare una mutazione del sito fosforilato in modo che
non sia + fosforilato e vedere cosa succede nella cellula. Posso convertire serina,treonina in
un'alanina che non è fosforilabile e mi chiedo a cosa serve la fosforilazione.
Es. la fosforilazione di una proteina serve per interagire con un'altra proteina. Si è notato che la
fosforilazione avveniva su treonina 194 e si è fatto un mutante in cui da treonina 194 si passava ad
adenina 194. Si ottiene che la proteina non è + fosforilata quindi l'interazione non c'è più. Questo
suggerisce che la mutazione sia collegata alla fosforilazione. E' stato messo un altro sistema
fosforilabile trasformando l'a194 in s194. T e S sono entrambe fosforilabili e si è dimostrato che la
fosforilazione sulla treonina 194 serve per interagire con l'altra proteina.
Es. la monoubiquitinazione ha un'attività regolativa. PCNA (fattore replicativo) viene ubiquitinato
con la k194. Faccio un mutante in cui converto k194 in un arginina. La lisina è carica + e può essere
ubiquitinata mentre l'arginina no. Il gene mantiene le sue funzioni ma non viene + ubiquitinato e
quindi posso chiedermi a cosa serve l'ubiquitinazione.
Come faccio le mutagenesi:
Voglio convertire ...GAC... in una sequenza ...ATG...
...CTG...
...TAC...
Disegno un oligonucleotide che abbia la sequenza giusta del gene tranne nel punto in cui io voglio
fare la mutazione e quindi sarà ...ATG___
___TAC...
Disegno quindi un primer che complementa la mutazione sulla sequenza trailer. Il primer ha una
direzione mentre la trailer ha la direzione opposta. Se faccio la PCR ho che i due sono appaiati nella
stessa posizione. E' difficile fare un'amplificazione esponenziale quindi posso dargli nucleotidi,
magnesio,tampone e DNA polimerasi. La DNA pol trova un innesco e inizia a sintetizzare e ho che
normalmente si ferma quando trova il primer dall'altra parte (perchè siamo abituati a fare la PCR
compresa tra due regioni). Qua le due regioni sono nello stesso punto quindi la polimerasi va avanti
fino a quando trova i primer complementati. Il primer è beccato dalla polimerasi che va avanti e si
fa tutto il giro. Non è un'amplificazione esponenziale perchè i due nuovi filamenti non possono
funzionare da stampo. La molecola non è chiusa covalentemente e la polimerasi non può
continuare. L'unica molecola che funziona da stampo è il plasmide originale. Faccio pochi dei cicli
di PCR e otterrò un tot di prodotti che contengono la sequenza mutante. Devo usare una polimerasi
fedele come la Pfa. + cicli faccio + è probabile che entri la mutazione quindi devo fare pochi cicli
(es.10). Ottengo giustamente poco prodotto ed è inutile che carico su gel ma mi devo fidare che c'è.
I prodotti che posso ottenere sono: 1° prodotto ho un filamento parentale appaiato a un filamento di
neosintesi interno ma non ha la mutazione;2° filamento parentale e parentale;3° parentale senza
mutazione e un filamento di neosintesi all'esterno con mutazione; 4° ho i due filamenti di neosintesi
appaiati tra di loro. A me interessa il 4° perchè ha la mutazione su entrambi i filamenti. Se mettessi
il 3° nella cellula ho che viene replicato e i due filamenti si separano e fa un plasmide mutato
quando copia il filamento di neosintesi e un plasmide wt quando copia il filamento stampo. Ho due
cellule figlie: una con il plasmide mutato e una con il plasmide wt. Ho un miscuglio e non capisco
nulla. Voglio eliminare 1°,2°,3° e mantenere solo il 4°. Per distinguerli devo usare un sistema che
sfrutta il sistema di modificazione e restrizione dei batteri. L'enzima di restrizione Dpn1 non taglia
il DNA se non è metilato ma taglia solo quello metilato o emimetilato (solo quando uno dei due
filamenti è metilato). Voglio avere tutti i filamenti parentali metilati. Dpn1 taglia 1°,2°,3° ma non il
4°. Questo enzima ha un'efficienza dell'80%. Il plasmide che uso per la PCR devo averlo tolto da un
ceppo di coli che metila. Il vantaggio di questo sistema è che è molto rapido. Devo verificare che la
mutazione ci sia e conviene sequenziare l'intera ORF per esser sicuri che non siano state messe
dentro + mutazioni. Posso mettere + primer mutati e ottengo + mutazione diverse. Se voglio ad es.
eliminare 3 aa è importante che la mutazione sia in mezzo al primer affinchè si appai bene
altrimenti se sta troppo al 5' destabilizza il 5' e non deve stare nemmeno al 3' altrimenti fa casino
quando si deve appaiare l'altro primer.
Mutagenesi su larga scala: i barcode e la delezione sistematica
Per fare l'analisi funzionale a livello genomico è necessario avere librerie di mutanti per delezione
ordinate. Vogliamo avere una collezione di ceppi di lieviti diversi ognuno delle quali porta una
mutazione in geni diversi del genoma. Questa è una delezione sistematica: posso chiedermi ad es.
quali sono tutti i geni necessari per un determinato processo come i geni che deleti fanno la gemma
lunga. Non possiamo avere dentro geni essenziali. Le collezione sono state fatte per delezione con
le cassette KAN quindi sono state delete solo le ORF annotate. E' un problema perchè dopo che è
stata fatta la collezione c'erano sequenze chiamate nORF che codificavano per proteine importanti.
Le mutazioni su larga scala sono due: delezione sistematica e mutagenesi inserzionale. Posso fare la
delezione del gene usando una cassetta KAN che porta delle regioni di omologia ai lati in modo che
quando la trasformo mi faccia ricombinazione omologa. Per fare la delezione di tutte le ORF si
sono costruite delle cassette KAN che avessero alle estremità delle sequenze omologhe per le
singole ORF. Si è pensato di aggiungere all'interno della cassetta anche delle codine tipiche di
ORF1,ORF2 ecc. Si è messo all'interno della cassetta un codice a barre in modo che la sequenza
ORF1 contenesse la cassetta KAN + delle codine tipiche di ORF1. Quindi hanno messo una corta
sequenza specifica presente solo nel ceppo che contiene la delezione in ORF1. Se potessi leggere il
codice a barre potrei dire subito quale gene è deleto senza sequenziare nulla (se è bar code 1 è la
delezione nel gene ORF1). I bar code sono chiamati uptag e downtag sono specifici per ciascuna
delezione e identificano il ceppo. La cassetta è fatta così:
ORF//UT//KAN//DT//ORF
UT e l'uptag mentre DT è il downtag.
ORF1 ---/.../KAN//...//--ORF2 ---/.../KAN//...//--Disegno due primer universali all'inzio della ORF1 e due all'inizio della ORF2. I primer si
disegnano in alto a sinistra e in basso a destra sia sulla ORF1 che sulla ORF2. I primer vanno bene
per tutte le ORF ma i bar code sono diversi per ogni ORF. Per leggere i bar code li amplifico con la
PCR. Ottengo delle librerie ordinate.
Esperimento:
Mettiamo il caso di avere una collezione di mutanti per delezione. Sono distribuite su tanti pozzetti
in cui in ogni posizione c'è un ceppo che porta una specifica delezione. Questo sistema è utile
perchè posso fare un certo tipo di esperimento. Voglio trovare tutti i geni che sono importanti per
sopravvivere in presenza di un agente mutageno MMS. Prendo la piastra con tutte le delezioni e
succhio le cellule da ciascun pozzetto e le stampo su 2 piastre di agar: in una non ci metto MMS
mentre nell'altra ce lo metto. Cerco quali sono le colonie che nella prima crescono mentre nella
seconda no. Posso fare questo esperimento ma è un lavoro piuttosto grosso e non so cosa è successo
dal giorno 0 al 3. Posso quindi prendere i ceppi contenuti nella piastra iniziale e mescolarli insieme
in una beuta. Prelevo un campione e lo uso come controllo. La beuta contiene quindi una miscela di
tutti i ceppi e la divido in 2: in una aggiungo l'MMS mentre nell'altra no e le metto ad incubare.
Prendo T0-MMS e T0+MMS. Le incubo per un tempo crescente e a tempi diversi vado a prelevare
ad es. dopo 2,4,6,8,12 ore. Faccio delle cinetiche nel tempo. Quali di questi geni è necessario per la
sopravvivenza in MMS? Mi aspetto che se c'è qualche delezione che distrugge un gene necessario
alla sopravvivenza in MMS avrò cellule presenti al T0 ma dopo 24h ho che le cellule sono o morte
o non si sono divise. Quello che è sicuro è che le cellule sono sottorappresentate nella popolazione.
Prendo i campioni e da questi amplifico i barcode e faccio per ciascuno dei campione una reazione
di PCR. Amplifico tutti i barcode di tutte le delezioni e marco con dei fluorocromi. Ora mi chiedo
quali barcode sono presenti alla pari di tutti gli altri e quali sono invece ridotti (cellule lisate,morte o
non + divise). Trovo quindi quali geni sono necessari per sopravvivere in MMS. Per analizzare i
barcode si è costruito un chip in cui sono sintetizzati gli oligonucleotidi che sono tutti i barcode. Si
ottiene quindi un DNA chip con i barcode. Ibrido sul chip il prodotto di PCR e vedo quanto
rappresentato è il codice a barre nel campione. Posso sapere quanto ciascuno ceppo è rappresentato
nella popolazione. Ad es. se confronto T0 con il T24 ho alcune delezioni che al T0 danno una certa
intensità di fluorescenza perchè il barcode era rappresentato di un tot nella popolazione,24h dopo il
ceppo ha fatto 6 divisione quindi sarà molto + rappresentato. Il segnale sarà quindi + intenso. Può
esserci qualche delezione in cui T0=T24,questo significa che il ceppo in 24h non si è mai diviso.
L'MMS probabilmente ha fatto male alle cellule. Devo usare il controllo per vedere se senza MMS
dopo 24h è cresciuto o meno il ceppo e se vedo che è cresciuto ho che l'MMS è tossico. Devo fare
un analisi nel tempo: posso raggruppare in diverse categorie i geni in base a quanto sono importanti
per la sopravvivenza all'MMS. Il vantaggio è che faccio 2 beute e ibrido il chip. So in che momento
un certo gene è importante e quanto la mancanza del gene ha rallentato la crescita delle cellule.
Posso fare un analisi anche a diverse concentrazioni di MMS. I geni per sopravvivere in terreno
minimo sono ura3,ade2,ade3 oppure tutti i geni x sopravvivere a basso o alto sale,in galattosio,per
la respirazione,heat/cold shock o H2O2.
Mutagenesi inserzionale
I trasposoni sono elementi mobili presenti nel genoma. Usano enzimi forniti dalla cellula,dal
trasposone stesso o dal fago. Sono usati per fare mutagenesi perchè posso farli muovere nel
genoma. L'integrazione non è così casuale perchè deve uscire da una regione ed entrare in un'altra.
Si infilano meglio in una cromatina – compatta. L'idea è produrre mutanti casuali in tutto il genoma
e per farlo basta far saltare in giro i trasposoni.
-//---(YFG/)---Se si infila qui // la proteina non viene fatta cioè è equivalente ad una delezione. Se si infila qui /
abbiamo quasi tutta la sequenza della proteina. Potrebbe anche essere funzionale. Ho diversi alleli:
ho la proteina wt,la proteina con il trasposone infilato all'inizio e la proteina in cui il trasposone si è
infilato in fondo. Se il trasposone si infila un po' + a sinistra ho una proteina un po' + tronca magari
gli mancano alcune funzioni ma non tutte. Il vantaggio è che è possibile avere tanti alleli diversi: ho
tutte le forme intermedie e non solo allele vivo o morto. Questo è molto importante se il mio gene è
essenziale perchè non posso fare la delezione mentre con il trasposone sì. Se il trasposone si infila
all'inizio della sequenza ho una cellula morta ma se si infila verso il fondo mi dà una cellula con un
difetto. Ho un mutante in un gene essenziale. Il traspone si può anche infilare nel promotore e può
alterare la funzione del promotore: la sequenza della proteina è wt ma ho che è + espressa o –
espressa. Si prende una libreria di DNA genomico e si trasformano i ceppi di coli. Ho una
collezione di cellule in cui ognuna ha dentro un pezzo diverso di genoma di lievito. Induco la
trasposizione. Regolo l'espressione delle trasposasi in modo che vengano indotte solo quando voglio
io. Ho che il trasposone può saltare all'interno della libreria di lievito. Se salta dentro ottengo una
sequenza di lievito mutante. Tolgo dalle cellule la libreria genomica che avrà il trasposone infilato
da qualche parte. Ogni plasmide porta il trasposone in una posizione diversa. Il trasposone è
formato da: un'estremità TR per integrarsi ed excidersi; dal 5' ho un sito lox,sequenza del gene
lacZ,ura3,marcatore tetraciclina,sito lox e 3xHA,estremità del trasposone. Il marcatore per la
tetraciclina serve per sapere se in coli c'è il trasposone o meno. Si usa l'enzima Not1 che taglia
raramente ma produce pezzi grossi di lievito. Ottengo un frammento lineare che contiene un pezzo
del genoma di lievito con integrato il trasposone. Sostituisco la copia wt della ORF con quella in cui
c'è dentro il trasposone e ho che si fa ricombinazione omologa. Seleziono le cellule che hanno fatto
ricombinazione perchè il trasposone contiene ura3. Ottengo una collezione di mutanti in cui ci sono
tanti alleli diversi per ogni gene.
TRIPLES
Il trasposone si può infilare in frame o fuori frame. Se si infila fuori frame si ha un mutante perchè
la proteina è tronca. Se si infila in frame ho una proteina tronca ma si può infilare in frame con lacZ
e ottengo una proteina di fusione. Consente di studiare quando e dove viene espressa,basta che
seguo lacZ e ho che quando è espressa la mia proteina ho che è espresso anche lacZ. Posso fare sia
analisi con X-gal che con ONPG. Posso fare un analisi fenotipica e un analisi dell'espressione
genica.
HA sono 9 aa che sono ricosciuti in modo specifico da degli anticorpi commerciali. Se la proteina
che mi interessa è fusa in frame con l'epitopo ho che l'anticorpo riconosce l'epitopo. Come metto
HA in frame con la proteina? Se il trasposone è entrato in frame e ho fusione con beta-gal prendo le
cellule e faccio esprimere la ricombinasi cre. Ottengo la sequenza della proteina fusa in frame con
HA.
–//-(........)-- il trasposone si è infilato qui // e ha interrotto la sequenza codificante della proteina
---(lox-ura-lox///)HA--- queste cellule sono ura+,induce l'espressione di cre che induce la
ricombinazione tra i due siti lox. Il sistema è costruito in modo che se il frame è mantenuto con
lacZ,è mantenuto anche con HA ed è mantenuto anche quando finisce la sequenza codificante di
HA. Ho ricreato una proteina intera in cui in mezzo o dovunque nella posizione in cui si è integrato
il trasposone si sono piazzati 3HA. Ho un pezzo di YFP che è fuso in frame con 3HA e fuso in
frame con il resto della proteina. Queste cellule sono ura- e resistenti al FOA. Per vedere quando e
dove è espressa la proteina uso western blot e immunofluorescenza con un anticorpo anti-HA. Ho
creato una libreria di mutanti ma quando ho trovato un mutante che mi interessa posso studiarne
l'espressione e la proteina. Il gene in cui si è inserito il trasposone è immediatamente sequenziabile
e uso dei primer che si appaiano con il trasposone per sequenziarlo.
SGA
Esperimento:
Ho che le wt a 0 MMS fanno colonia,a 0,02% di MMS colonia,a 0,04% colonia + lofia. Il mutante a
0 MMS fa colonia,a 0,02% fa colonia lofia,a 0,04% non fa nulla. So che il gene ha a che fare con la
sopravvivenza ad MMS. Mi chiedo quali sono gli altri geni implicati nella risposta all'MMS. Voglio
cercare una situazione in cui ho un certo gene mutato che non conosco che quando è combinato con
il mutante cresce bene in assenza di MMS mentre è morto anche a 0,02% di MMS. Questa è una
letalità sintetica. Faccio degli screening letali sintetici. Abbiamo un ceppo mms2delta e vogliamo
trovare un mutante che combinato con il mio mutante è + sensibile all'MMS. Un modo è quello di
prendere il ceppo e fare tutte le delezioni qui dentro. Oppure ho già a disposizione una collezione
ordinata di mutanti in cui ci sono tutti i geni deleti di lievito. Se il mio mutante lo faccio in un ceppo
di sesso α e il gene in un ceppo di sesso a ho che posso combinare le due mutazioni semplicemente
incrociando i due ceppi. Non serve trasformare. Posso testare tutti contro tutti o uno contro tutti. Il
sistema si chiama SGA. Ho il mio gene che è stato distrutto con una cassetta che ha il NAT ed è di
sesso α e ho una libreria ordinata in cui ci sono 20 piastre con i ceppi tutti in ordine. Hanno
costruito un robot per fare questo lavoro: c'è una piastra di terreno solido e il robot con degli aghi fa
una replica e li riposiziona tutti i mutanti ordinati,va in un contenitore in cui c'è mms2delta intinge
gli aghi e porta nella stessa posizione di prima anche il ceppo mms2delta. In ogni buchino abbiamo
mms2delta e il mutante che si trovava in quella posizione nella library. Quando incrocio α e a
ottengo dei diploidi mms2delta/MMS2 wt xxxdelta/xxx wt. Non ho ancora il doppio mutante. Il
problema è che l'incrocio non è efficiente al 100% ma trovo buona parte dei diploidi,tante cellule di
sesso a e tante di sesso α. Ho YFG marcato con nat e xxx marcato con la resistenza a KAN. Le
prime se do il nat sono vive ma se do G418 sono morte,le seconde se do G418 sono vive ma se do
nat sono morte. Se do al diploide G418 vive e se do nat vive. Dico al robot di prelevare alcune
cellule e metterle su una piastra che contiene nat e G418: restano vivi solo i diploidi. Prendo il
diploide e devo fargli fare meiosi. Dico al robot di prendere le cellule e trasferirle su una piastra
senza azoto e ho che le cellule hanno fatto meiosi. Ora ho una colonia ricca di spore e diploidi. I
diploidi sono mms2: nat/mms2 e xxx:kan/xxx. Vediamo come segregano i marcatori quando
facciamo meiosi. Abbiamo mmms2:nat xxx:kan ; mms2:nat XXX (wt); MMS2 (wt) xxx:nat ;
MMS2 (wt) xxx. A me interessa solo mms2:nat e xxx:nat. Se do G418 e nat ho che vive la prima
ma anche il diploide che non ha sporificato e quindi contamina il campione. Devo eliminare il
diploide e lo faccio con un trucco genetico. Le cellule di lievito sono istidina meno cioè non sono
capaci di crescere in assenza di istidina. MATα porta una copia di istidina wt sotto il controllo di
MFA1 che è sensibile al ferormone prodotto dal locus di tipo sessuale. Questo promotore in cellule
α è spento mentre in cellule a è acceso. Il ceppo MATα è ist- e il promotore è spento perchè fanno
α-factor e MATa è ist- e il promotore è acceso. Il diploide è istidina meno perchè è un ceppo aα
quindi il promotore è spento. Alcune spore portano MATα e MATa. Se piastro con G418 e nat e
privo di istidina ho che il diploide essendo ist- non cresce,MATα non cresce perchè non ha espresso
l'istidina mentre MATa cresce. Ho trovato il modo per selezionare solo la spora che mi interessa.
Tutto questo l'ho fatto per tutti i geni usando il robot. Mi aspetto che se la mutazione in xxx non è
letale sintetica con mms2 ho che la spora Mata sta bene e fa colonia. Se invece lo è ho che questa
spora non cresce nemmeno lei. Ottengo un buco ma non so chi è. Vado a vedere sulla piastra della
library e scopro che gene è. Ho quindi trovato i letali sintetici ma devo controllare che lo siano.
Faccio l'analisi delle tetradi: posiziono ogni spora in punti diversi. Uso un microscopio con un ago
sottile e appena tocco l'husky con l'ago e ho che si attacca. Lo metto in un terreno pulito e faccio in
modo di rompere la sua parete. Prendo l'altra spora e la sposto in un'altra posizione. Le faccio
crescere e già so che sono tutte vive o morte. Dipende da che doppio mutante sto cercando: quella
morta è quella che contiene la doppia mutazione. Prendo le spore e le replico su piastre di KAN e
nat. Non devo trovare Kan+ e nat+!! E' possibile trovare buchi anche se non c'è letalità sintetica. La
spora con la doppia resistenza non si forma e quindi tutte le spore sono sensibili a uno dei due
antibiotici. Questo può accadere perchè i geni sono vicini. In un ceppo ho * YFG:NAT e nell'altro
** ho xxx:kan
---------*---------xxx------------YFG-------**--------Questi due geni non possono andare insieme perchè sono strettamente concatenati. Possono andare
insieme solo se ho un evento di ricombinazione in mezzo al cromosoma. Trovo dei buchi intorno a
YFG. Si possono fare mappe di interazione di un gene con un altro: geni con funzioni simili si
trovano tutti nella stessa zona e permettono di scoprire geni con funzioni sconosciute.
Un altro tipo di screening è il chemical genomics: combino mutanti con la molecola di interesse.
Si può usare il robot per fare il doppio ibrido e usare i sistemi di librerie ordinate. Mi costruisco un
plasmide esca e una libreria in cui ci sono cellule di lievito in cui ognuno ha un plasmide preda
diverso. Metto xxx-B42AD in MATa e lexABD-YFG in MATα. Chiedo al robot di fare
l'incrocio,metto su X-gal e vedo quali diventano blu. Trovo subito quali sono gli interattori e in base
alla posizione conosco già la preda. Posso trovare quindi tutte le interazioni fisiche ci sono
all'interno della cellula.
Interazione biochimica
Ci sono alcuni sistemi che servono per confermare il doppio ibrido. I metodi per studiare le
interazioni proteina-proteina di tipo biochimico sono: co-immunoprecipitazione e GST-pulldown.
Immunoprecipitazione significa che ho qualcosa che precipita quando interagisce con l'anticorpo
mentre co-immunoprecipitazione significa che due cose precipitano insieme.
Co-immunoprecipitazione:
Dal doppio ibrido ho scoperto che YFP interagisce con Ddc1. Devo dimostrare che l'interazione
vista con il doppio ibrido ci sia anche a livello della proteina. Prendo l'anticorpo che riconosce
YFP,faccio precipitare il complesso antigene-anticorpo e se la proteina interagisce con YFP1 mi
aspetto che precipiti anche Ddc1. Rompo le cellule e faccio un estratto di proteine (estratti nativi o
denaturanti). Se prendo le proteine,le carico su SDS,le separo x vedere se c'è la proteina o in che
posizione migra è + utile fare l'estratto denaturante. Il vantaggio è che prendo le cellule e nel
momento in cui le rompo denaturo tutte le proteine. Questo è importante perchè la mia proteina
potrebbe essere molto sensibile alle proteasi. Se io mescolo tutte le proteine ho che le proteasi
mangiano la mia proteina. Se invece voglio analizzare l'interazione proteina-proteina è meglio fare
l'estratto nativo. Devo fare in modo che le proteine durante l'estratto continuino ad interagire. Uso
tra 50-100 mM di NaCl e 0,01% di detergente. Sospende le cellule in questo tampone,liso le cellule
e centrifugo. Ottengo andando dall'alto verso il basso: supernatante,strato lipidico,pellet. Tolgo il
supernatante,metto l'estratto in una provetta pulita e metto un anticorpo anti-YFP. Questo anticorpo
va a cercare il suo antigene e si attacca a YFP. Formo quindi un complesso antigene-anticorpo e se
Ddc1 interagisce con YFP ottengo un complesso ternario: anticorpo-antigene-interattore. Questo
complesso è solubile e devo pescare dall'estratto l'anticorpo per vedere cosa gli va dietro. Faccio
l'incubazione per 1h a 4° o in ghiaccio. Aggiungo proteinaA-sefarosio. Il sefarosio è fatto da piccole
palline di resina mentre la proteinaA si attacca in modo specifico alla catena pesante delle
immunoglobuline. Quando mescolo questa cosa ho che la proteinaA è attaccata alla matrice
solida,si attacca all'anticorpo e ho che l'anticorpo si attacca a YFP1 e YFP1 forse è attaccato a Ddc1.
Centrifugo questo complessone e ho che mi ritrovo in fondo alla provetta tutta la mia resina che si è
portata dietro anticorpo-YFP1 e forse Ddc1. Tolgo il supernatante e lo tengo da parte perchè è
composto da tutte le proteine che non sono scese con il sefarosio. Lavo il pellet diverse volte con il
tampone per eliminare le cose non veramente attaccate al sefarosio. Risospendo il pellet in tampone
denaturante che mi serve per caricare un gel di acrilammide. Separo il campione con SDS e mi
aspetto di non trovare sefarosio e proteinaA ma l'anticorpo. Vedrò due bande corrispondenti una alla
catena leggera e una a quella pesante. Mi aspetto di vedere anche YFP e Ddc1. Se coloro il gel con
il blu comassie vedo solo le immunoglobuline (ne ho messe tantissime) ma non YFP e Ddc1 perchè
ce ne sono molto pochi. Faccio il western blotting: trasferisco su filtro di nitrocellulosa e saturo con
la latte in polvere e vado a vedere se ci sono YFP e Ddc1. Se uso gli anticorpi anti-YFP vedo una
banda grande a livello do YFP perchè se l'immunoprecipitazione è avvenuta ho che YFP c'è di
sicuro. Se non c'è YFP,non c'è nemmeno Ddc1. Questo è il mio controllo che mi dice che
l'immunoprecipitazione è avvenuta. Ho due anticorpi αYFP e αDdc1 e trovo la banda delle due
proteine. La banda mi dice che le mie proteine interagicono ma faccio lo stesso un controllo per
verificare che Ddc1 vado giù solo quando interagisce con YFP. Rifaccio tutto l'esperimento con un
anticorpo che non centra nulla con YFP1. Posso usare anche un siero pre-immune (siero tolto dal
topo prima di dargli la proteina per fare l'anticorpo). Incubo e centrifugo. Ho che l'anticorpo antiYFP non scende e non dovrebbe scendere anche Ddc1. Se non c'è la banda so che l'interazione tra
YFP1 e Ddc1. Posso usare questo sistema anche per pescare co-attori.
→ se l'interazione non è molto stabile la co-immunoprecipitazione non funziona
GST-pulldown:
Prendo YFP1 e Ddc1,le mescolo insieme e vedo se si uniscono in vitro. Devo avere un costrutto che
mi produca una proteina di fusione tra YFP e GST. GST è il glutatione s trasferasi e viene sfruttato
per purificare YFP1. Trasformo in coli e ho che quando il costrutto viene espresso produce la
proteina di fusione. Questa è mescolata insieme alle altre proteine di coli. Faccio un estratto nativo
delle proteine. Purifico YFP1 dall'estratto ed è facile perchè prendo una colonna che contiene
glutatione-sefarosio. Quando metto estratto proteico ho che le proteine di coli passano attraverso la
colonna tranne il GST che si attacca alla colonna insieme YFP (poichè YFP è fuso in frame con
GST). Ho che anche altre proteine restano intrappolate sulla colonna quindi lavo la colonna. Eluisco
con glutatione che è il substrato di GST. L'enzima è attaccato al glutatione sulla resina ma se c'è +
glutatione in soluzione ho che il GST si attacca al glutatione in soluzione (c'è competizione). Esce
GST+YFP1 e dalla colonna ottengo GST e YFP1. Prendo il gene che codifica per Ddc1 e lo metto
sotto il controllo del promotore di T7. Si fa fare trascrizione e traduzione in vitro e si mette anche
S35 metionina. La proteina Ddc1 diventa radioattiva. In una provetta metto il tampone con poco
sale poco detergente,YFP1 e Ddc1. Queste due proteine si attaccano? Vado a tirar fuori il complesso
YFP1 e vedere se viene via anche Ddc1. Sfrutto glutatione-sefarosio e ho che il GST si attacca al
glutatione. Quando centrifugo ho che il sefarosio va sul fondo della provetta e si porta dietro anche
GST-YFP1. C'è anche Ddc1 sul fondo della provetta? Lavo il pellet,denaturo e separo su SDS. Mi
aspetto di vedere due specie proteiche: una GST-YFP1 e Ddc1. GST-YFP1 la vedo mentre Ddc1 no.
Metto una lastra auto-radiografica su questo gel e visto che Ddc1 è radioattiva ho che se la proteina
c'è vedo una banda sulla lastra. Faccio un controllo: ripeto tutto l'esperimento ma metto solo GST
anziché GST+YFP1. GST non deve interagire con Ddc1 perchè questa proteina deve essere rimasta
in soluzione. Se vedo la banda su Ddc1 significa che l'interazione non è specifica. Il vantaggio è che
visto che le proteine sono purificata sono in grado di vedere anche le interazione + labili e non c'è
competizione. Gli svantaggi sono che metto dentro così tanta proteina da indurre un complesso
aspecifico e normalmente non interagiscono. Oppure le due proteine interagiscono quando sono da
sole ma non quando ci sono altri pattern in giro. Con questo sistema sto spingendo la formazione
del complesso. Posso fare questo esperimento mettendo anche pezzi di una proteina e identificare
quale parte di una proteina interagisce con un'altra.
Co-sedimentazione:
Si usa un gradiente di glicerolo e saccarosio. Per avere questi gradienti si usa un sistema di vasi
comunicanti in cui c'è un rubinetto e un'uscita. In mezzo c'è un tubo e si ha che all'interno viene
messa una soluzione al 30% e al 5%,sotto si mette una provetta magnetica. Si appoggia il tutto su
un agitatore. I due rubinetti sono pieni di un volume uguale e la somma dei due volumi deve essere
uguale al volume della provetta. Apro i rubinetti e ho che inizia a defluire la soluzione più densa. Il
30% di glicerolo inizia ad andare sul fondo. Quando scende il livello di una parte del vaso deve
scendere anche il livello della seconda parte quindi il 5% passa nella camera a 30%. La provetta lo
mescola e si ha che man mano che il tempo passa il 30% viene diluito dal 5%. Alla fine visto si avrà
che l'ultima goccia del 5% sarà quella ad uscire per ultima. Una volta che ho un gradiente di densità
posso separare proteine o complessi di proteine in base alla densità del complesso semplicemente
centrifugando. Le proteine + pesanti tenderanno ad andare verso il fondo mentre le + leggere sono
rallentate nella parte + alta perchè man mano che la densità del glicerolo aumenta queste fanno +
fatica ad attraversare le regioni dense. Prendo quindi le cellule,faccio un estratto di proteine e lo
deposito sulla superficie del gradiente. Visto che l'estratto è acquoso e sulla superficie c'è il 5% di
glicerolo ho che posso stratificare l'estratto sopra. Metto la provetta in centrifuga. Quando
centrifugo le proteine tendono ad essere spinte verso il fondo della provetta. Quelle + pesanti
riescono ad andare in fondo mentre quelle + leggere si fermano più in alto perchè fanno fatica ad
attraversare gli strati + densi. Le proteine si distribuiscono nella provetta più o meno in base al peso
molecolare. Se questo è l'estratto nativo,sopra separo le proteine all'estratto monomerico ma separo
anche i complessi di proteine. Questi complessi si muovono diversamente dalle subunità singole.
Se centrifugo troppo poco le proteine non si separano mentre se centrifugo troppo ho che le proteine
pesanti si schiantano sul fondo della provetta e le leggere vanno verso il fondo. Serve trovare le
condizioni di centrifugazione adatte. Se nella provetta abbiamo le proteine separate dobbiamo
andare a vedere dove sono finite le proteine che stiamo studiando. Voglio sapere se le due proteine
interagiscono. Mi chiedo se non interagiscono si troveranno da qualche parte nel gradiente perchè
se ne sono andate come subunità singole. Se fanno parte di un complesso si ha che si saranno
spostate di + e saranno quindi andate + in fondo. Faccio un buco con un ago e ho che la provetta
gocciola in una eppendorf. Raccolgo 10 gocce e numero le provette. La 1 corrisponde al fondo del
gradiente cioè al 30% di glicerolo e l'ultima al 5%. Mi chiedo in che provette sono finite le mie
proteine. Faccio un western: prendo un'aliquota dei campioni,faccio un gel,carico le 10 provette e
vado a vedere dove sono finite. Vado su con anticorpi anti-Ddc1 e anti-YFP1. Devo far correre
un'altra provetta con lo stesso gradiente 30% e 5% e su cui ho depositato proteine di dimensione
nota. Posso sapere più o meno dove sono 50kDa 250 kDa o 900 kDa. Vedo due bande con il
western. Trovo le due proteine in due provette diverse: questo significa che non interagiscono. Vedo
anche che le due proteine si trovano in una frazione con le dimensioni compatibili con il monomero.
Se si trovano nella stessa provetta ma con un peso molecolare basso ho che sono monomeri e quindi
non interagiscono. Finiscono insieme solo perchè hanno un peso molecolare simile. Se le trovo
nella stessa provetta e a circa 200 kDa. Ognuna è circa 100 kDa e ho che con il western ho
denaturato le proteine e quindi viaggiano per i fatti loro. Le interazioni non coinvolgono 1000
proteine su 1000. Ci sono sia subunità separate che il complesso. Oppure posso anche trovare bande
sui 900 kDa: significa che le proteine appartengono a + di un complesso multiproteico. Anche in
questo caso è un'analisi di complessi che si formano in vivo. Devo interpretare i gel e possono dire
se co-sedimentano o no. Il vantaggio di questo sistema è che non vado a toccare le proteine cioè non
devo mettere un anticorpo che si attacca ad una subunità e la tira via. Se il complesso è + instabile è
+ probabile vederlo con la co-sedimentazione.
Co-purificazione:
Se due proteine interagiscono ho che quando ne purifico una per via biochimica purifico anche
l'altra.
TAP
Il principio è purificare la proteina di interesse e andare a vedere chi ha legato per spettrometria di
massa. Questa sistema consente una purificazione veloce. Si costruisce una cassetta in modo che
posso fare una fusione in frame tra la cassetta TAP e il gene di interesse. La proteina prodotta YFP
si porta attaccato il TAP. Sfrutto il TAP per purificare la proteina. La purificazione per affinità è
quella + efficiente perchè la proteina ha un'affinità per quello che c'è sulla colonna. Questo sistema
consiste in due passaggi di purificazione per affinità. Il TAP è una cassetta fatta da una sequenza
ZZ,una corta sequenza TEV,una sequenza Cvp. ZZ è il dominio della proteinaA che si attacca alle
regioni costanti delle immunoglobuline. Cvp ha un'affinità forte per la calmodulina. TEV è una
sequenza che codifica per pochi aa che costituiscono un sito di taglio specifico per la proteasi TEV.
La TEV taglia quando c'è una particolare sequenza amminoacidica. Facciamo sintetizzare la
proteina e avremo ZZ-TEV-Cvp e la proteina fusa in frame. Nell'estratto delle cellule avremo che
attaccata alla proteina ci saranno tutti gli interattori. Faccio l'estratto in condizioni native,lo carico
su una colonna che contiene sefarosio e su cui sono attaccate in modo covalente le
immunoglobuline. Quando passo l'estratto ho che la maggior parte delle proteine passano attraverso
la colonna. La mia proteina resta intrappolata nella resina perchè si attacca alle immunoglobuline e
insieme a lei restano intrappolati gli interattori. Faccio dei lavaggi e dovrei avere attaccata solo la
mia proteina. Io voglio recuperare ciò che c'è nella colonna ma non è facile. Ho un'interazione tra le
immunoglobuline e ZZ e devo avere un'eluizione gentile. Nella colonna ho quindi la pallina di
sefarosio con attaccata un'immonoglobulina che interagisce con ZZ che è fuso al resto del TAP e si
porta dietro YFP con tutti gli interattori. Se sulla colonna carico un tampone che contiene la proteasi
TEV,chiudo il rubinetto e incubo a bassa temperatura. La proteasi TEV taglia se trova il sito di
taglio. ZZ resta attaccata alla resina mentre il resto del TAP non è + attaccato alla resina. Faccio
un'eluizione specifica e recupero YFP con gli interattori. Ho quindi un TAP tronco e ho fatto il 1°
passaggio di purificazione. Prendo la proteina e la attacco su una seconda colonna. Preparo una
resina con sefarosio attaccato alla calmodulina. Se faccio passare sulla colonna dovrei vedere che
YFP è trattenuta sulla resina mentre le cose aspecifica passano attraverso. Devo mettere ioni calcio
altrimenti non si attacca nulla. Ciò che è aspecifico passa attraverso,lavo e ho che nella resina c'è
attaccata la proteina con il TAP e gli interattori. Devo recuperare YFP e devo eluirla in modo
gentile. Chelo il calcio cioè passo sulla colonna EGTA che strappa via il calcio dalla soluzione. La
mia proteina si stacca da calmodulina-sefarosio e viene eluita. In due passaggi ho ottenuto una
purificazione elevata. Nella provetta ho la YFP e gli interattori. Devo fare un controllo rifacendo lo
stesso esperimento usando un TAP attaccato a una proteina che non centra nulla. Mi aspetto di
trovare proteine che sono presenti con YFP ma non con il campione che contiene l'altra proteina. Ho
ora la miscela di proteine e voglio fare un'analisi. Posso fare una sedimentazione facendo un
gradiente di glicerolo e vedere come la proteina si distribuisce. A me interessa capire chi sono le
altre proteine e lo faccio con la spettrometria di massa. Si prende la miscela di proteine e si separa
in condizioni denaturanti. Mi aspetto di vedere una banda grossa TAP+YFP più una serie di altre
bande che corrispondono agli interattori. Devo verificare che ci sono bande specifiche e carico
anche la proteina che non centra nulla. Coloro il gel con il silver stain o con il comassie in base a
quanto materiale c'è. Si separano il + possibile le proteine e si ha che ogni banda viene analizzata
nello spettrometro. Se ho ad es. una proteina da 45 kDa e una da 30 kDa lo spettrometro può fare
casino. Si separano le proteine 2 volte e uso separazioni bidimensionali. Si fa una 1° separazione in
base alla carica della proteina e una 2° in base alla massa. Prendo la miscela di proteine e la separo
per via elettroforetica in un sistema in cui queste proteine si muovono a seconda se sono + o –
cariche. Questo sistema usa un gel che è un gradiente di pH stabile. Decido con che pH analizzare
ad es. tra 6 e 10. Carico le proteine su questo gel,applico un voltaggio alto e ho che la proteina si
sposta fino a quando non raggiunge il valore di pH che corrisponde al punto isoelettrico. Prendo le
proteine e ho che le cariche sono diverse se la proteina è ripiegata o meno su se stessa. La proteina
viene denaturata con purea che la fa diventare una strisciolina. Tutte le cariche della proteina sono
esposte. Prendo le proteine denaturate e le metto su un gel isoelettrofocusing in cui le proteine si
focalizzano nel punto in cui pH=pI. Le proteine sono quindi separate in base al punto isoelettrico.
Voglio separare le proteine anche in base alla massa. Prendo il gel,lo giro di 90° e lo inglobo in un
SDS-PAGE. Intingo la striscia nell'SDS in modo che entri dentro questa matrice e copra tutte le
proteine di SDS in modo che assumano tutte una carica negativa. Faccio la seconda dimensione e le
separo in base al peso molecolare. Ad es. la banda che contiene 3 proteine con lo stesso pI ho che
queste proteine si separano. Se separo solo con SDS vedo poche bande cioè separo meglio +
proteine. Prendo lo spot,toglierlo dal gel e metterlo nello spettrometro di massa. Se faccio la stessa
cosa con la proteina non correlata ho che alcuni spot saranno uguali mentre altri diversi e quindi
vado ad analizzare gli spot diversi rispetto a quelli con YFP. In questo modo posso separare
tantissime proteine e quindi posso confrontare la composizione proteica di due cellule ad es. cellula
sana e cellula malata.
Spettrometria di massa
Tecnica chimica che serve per studiare i peptidi. Lo spettrometro determina il rapporto massa-carica
di una molecola. Le sostanze sono trasformate in ioni gassosi e sottoposti a campi elettrici o
magnetici e si va a vedere quanto si muovono quando sono sottoposti a questi campi. La proteina
degli spot viene rotta in tanti pezzi e ciascun peptide è analizzato dallo spettrometro per calcolare il
rapporto massa-carica. Quando faccio un'analisi di restrizione prendo un pezzo di DNA e lo taglio
con diversi enzimi,separo in basse alla massa e ricostruisco la mappa di restrizione di questo
frammento. Qui prendo la proteina,la faccio a pezzi,calcolo la massa di tutti questi pezzi e poi cerco
di rimetterli insieme e capire come era fatta la proteina da cui sono partito. La proteina è fatta in
pezzi tagliandola con una o + proteasi. Ottengo una serie di peptidi diversi che vengono caricati in
una macchina che li separa in base alla massa-carica. Ho una serie di picchi che indicano
l'abbondanza mentre lo spostamento lungo l'asse indica la massa. Questo sistema funziona bene se il
genoma è sequenziato perchè prendo la proteina,la taglio con la tripsina e vedo che peptidi vengono
fuori. Il computer prende il genoma di lievito ad es. e confronta ciascuna ORF con il profilo che ho
ricavato da una certa proteina. Questa cosa funziona bene se il genoma è semplice e se la proteina è
molto pulita. I peptidi tagliati passano attraverso un HPLC che li separa tra di loro in modo che
nella macchina entri un peptidi per volta. Quando il peptide entra viene ionizzato e si vede la sua
carica,passa attraverso il campo magnetico. La corsa del peptide è deviata dal campo magnetico a
seconda della sua carica e la lunghezza della corsa dipende dalla massa. Abbiamo per cui una
separazione di queste molecole e un detector legge quando il peptide ionizzato esce dalla camera di
separazione. In base al tempo che ci ha messo ad uscire e in base alla deviazione che ha avuto ci
dice quale è il rapporto massa-carica. In questo modo sono in grado di determinare quali peptidi
costituiscono la mia proteina. Ci saranno degli errori perchè il sistema è molto preciso ma potrebbe
accadere che un segnale è spostato. Se la proteina ha una modificazione post-traduzionale ho che il
peptide che la porta ha un segnale diverso.
Lo spettrometro analizza la massa dei peptidi e posso calcolare qual'è l'ordine degli aa in una
proteina. Sullo stampato vedo una serie di picchi che hanno un rapporto massa/carica diverso. Per
capire a chi corrisponde la proteina devo confrontare i picchi che tolgo dallo spettrometro di massa
con i picchi teorici per ciascuna delle proteine codificate dal genoma dell'organismo che stiamo
studiando. I picchi mi danno anche idea se le proteine sono modificate a livello post-traduzionale.
Posso vedere ad es. cosa succede quando defosforilo la proteina e vedo che i picchi si spostano di
un tot di Dalton. So chi è la proteina e so su quale polipeptide ha un gruppo fosfato. Conosco il
polipeptide perchè ho la massa precisa (il genoma deve essere già stato sequenziato da qualcuno).
Con la spettrometria di massa in tandem sono in grado di leggere la sequenza della proteina. Ci
sono due spettrometri attaccati uno dietro all'altro: il 1° spettrometro serve per analizzare la
dimensione,c'è una camera di collisione in cui il peptide viene spaccato in diversi punti,il 2°
spettrometro calcola la massa. Se il genoma non è sequenziato risalgo alla sequenza usando la
tandem. Si può digerire il peptide e separare i peptidi ottenuti attraverso l'HPLC. Le diverse frazioni
tirate fuori sono analizzate per spettrometria di massa oppure posso prendere ciascuno dei peptidi e
frammentarli usando la camera di collisione. Il problema è che posso analizzare pochi campioni.
Proteoma
Sono tutte le proteine presenti nella cellula in un determinato momento. Una cellula umana classica
contiene dalle 10 alle 20.000 proteine diverse. Si può valutare l'espressione dei geni a livello
proteico,analizzare le modificazioni post-traduzionali e l'interazione con altri ligandi. I sistemi x
identificare le proteine possono essere applicati su tutto il proteoma ma non c'è un equivalente
dell'ibridazione,il proteoma è complesso e non c'è un sistema per vedere tutte le proteine della
cellula. Quando voglio analizzare il proteoma su un gel bidimensionale posso vedere circa 3000
proteine diverse.
DIGE
Coloro il gel con comassie se ho tanta proteina o con il silver stain se ho poca proteina. Posso anche
usare soluzioni fluorescenti con cui marcare direttamente le proteine ad es. con cy3. Separo
l'estratto su 2D. Quando il gel è guardato con lo scanner vedo dove si trovano i diversi spot. Posso
prendere una cellula diversa,fare tutta la procedura e marcare l'estratto con un fluorocromo diverso
ad es. cy5. Se voglio confrontare cosa c'è di diverso nelle due cellule mescolo i due estratti. Corro
su gel e vado ad acquisire le due immagini alle due diverse lunghezza d'onda di cy3 e cy5. La
separazione è stata identica per i due campioni e posso vedere come una certa proteina si trova in un
punto mentre con cy5 si è spostata. Indica che è molto + espressa e se è la stessa proteina lo
spostamento mi indica che è stata modificata. E' + difficile confrontare due gel indipendenti. Posso
usare questa tecnica per analizzare la differenza tra una cellula sana e una malata. I limiti sono gli
esperimenti sono difficili tecnicamente,sono sbilanciati a favore delle proteine abbondanti,IEF
range non include le proteine acide e le basichee l'SDS range non compre le proteine troppo piccole
o grosse. Il problema della spettrometria di massa è che l'ampiezza tra un peptide e l'altro non è
proporzionale alla quantità del peptide. Questa tecnica non è un sistema quantitativo ma lo può
diventare se si usano dei marcatori isotopici che hanno una massa diversa.
ICAT
In questi sistema si marca un campione con un isotopo pesante e l'altro con un isotopo leggero. Ad
es. è usato quando si ha una cellula sana e una malata. Questo mi consente di fare un analisi
quantitativa dei due campioni. Si usa l'icat che ha un gruppo che reagisce con lo zolfo che si attacca
quando trova una cisteina. Preparo l'estratto delle due cellule,marco l'estratto con l'icat e ho che si
attacca alle cisteine presenti nelle proteine. Sul linker c'è l'idrogeno che può essere o idrogeno
semplice o deuterio. Posso riconoscere le proteine che derivano dallo stato 1 o dallo stato 2 vedendo
con che cosa sono state marcate. Le mescolo insieme e taglio con la tripsina e ottengo i peptidi.
Alcuni peptidi sono marcati dall'icat mentre altri non saranno marcati con l'icat perchè non
contengono cisteina. Voglio isolare dalla miscela tutti i peptidi che hanno l'icat attaccato. Per fare
questo uso la biotina che si lega con avidina. Purifico la biotina usando una resina che lega la
biotina e posso così isolare i peptidi che hanno l'icat attaccato. Questi peptidi sono sparati con lo
spettrometro di massa. Visto che si sa esattamente la massa di icat+deuterio e icat+idrogeno io vedo
una coppia di picchi per ogni proteina: una più leggera e una + pesante. Uno è un peptide della
cellula dello stato 2 e l'altro è lo stesso peptide della cellula nello stato 1.Posso confrontare la
quantità dei due peptidi e in questo caso l'altezza del picco mi dice l'abbondanza del peptide perchè
è lo stesso. Riesco a fare un'analisi quantitativa. Non posso confrontare peptidi diversi tra loro.
Protein microarray
Si usa per rilevare le proteine e seguirne i livelli di espressione ed investigare le interazioni. Questo
sistema è sensibile e si possono analizzare tanti campioni in parallelo. Su un substrato solido posso
attaccarci diverse cose ad es. posso fare un vetrino con attaccate proteine specifiche e poi posso
usarlo x cercare interazioni proteina-proteina. Incubo il vetrino con un estratto di proteine marcate
in modo fluorescente e vado a vedere dove si formare le interazioni. Vado a cercare i pattern
nell'estratto. Oppure posso fare dei vetrini con su anticorpi contro proteine specifiche e chiedermi se
quella proteina si attacca o meno all'anticorpo. Si possono legare antigeni,allergeni,peptidi,piccole
molecole o carboidrati. Devo esprimere le proteine,purificarle e attaccarle sul vetrino. Le proteine
devono essere allo stato nativo (questo è un limite del sistema) e non possono essere amplificate.
Ci sono tre tipi di array:
– functional array: ci sono le proteine immobilizzate e possono essere usati per cercare
ligandi,per interazioni proteina-proteina,per scopi diagnostici
– capture array: anticorpi o altri ligandi immobilizzati in cui si fanno profili di espressione del
genoma
– reverse array: soluzioni complesse di proteine come ad es. estratto di cellule
Es. lievito: si fa un costrutto contenente GST-6His-ORF. Ogni costrutto è stato espresso in ceppi di
lievito diverso in modo da avere una collezione ordinata. Si presume che ciascuna ORF sia
modificata in modo post-traduzionale e ripiegata in modo corretto. Sono stati fatti dei lisati e si sono
purificati usando GST. Le proteine sono state attaccate a un substrato ricoperto di nichel che si
attacca alle 6His. Si deve verificare chi si è attaccato e chi no: si fa un western con gli anticorpi
anti-GST. Il vetrino può essere usato per fare studi di interazione proteina-proteina e si fatto con la
calmodulina biotinilata. Il vetrino è stato incubato con la calmodulina che si va ad attaccare ai suoi
pattern. Devo fare lavaggi per togliere la calmodulina che non si è attaccata. Il problema è che
bisogna trovare condizioni che consentano alla calmodulina di legarsi al suo pattern vero. Bisogna
usare un'astringenza tale da eliminare le interazioni aspecifica. Si mette l'avidina marcata con
fluorocromo e questa si lega alla biotina. Si vedono degli spot verdi che mi dicono dove si è andata
ad attaccare la calmodulina.