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Catalogo delle prestazioni e dei servizi delle
Catalogo delle prestazioni e dei servizi delle piattaforme di Fondazione Filarete DEFINIZIONI Le piattaforme tecnologiche di Fondazione Filarete, gestite da gruppi di ricerca d'avanguardia dell'Università degli Studi di Milano, forniscono servizi per sviluppare, testare e valutare la fattibilità applicativa di soluzioni tecnologiche nel campo delle scienze della vita, creando una rete strettamente interconnessa di competenze scientifiche complementari che fornisce il substrato ottimale per la traslazione della ricerca di base in innovazione. Le piattaforme integrano genomica, proteomica, modelli cellulari e animali, imaging con nano- e microtecnologie per fornire metodologie altamente diversificate ma tutte applicabili alle diverse fasi di drug discovery e drug development. Le varie piattaforme collaborano per formare un unico core tecnologico interdisciplinare e integrato. Le attività delle piattaforme sono condotte e supervisionate dai Responsabili di Piattaforma. PARTNER Fondazione AriSLA ha individuato, quale partner nella realizzazione del servizio, “Fondazione Filarete per le bioscienze e l'innovazione”, con sede legale a Milano, Viale Ortles 22/4, (d’ora innanzi denominata “Filarete”). RESPONSABILE SCIENTIFICO La Convenzione AriSLA è coordinata dal Direttore Scientifico di AriSLA, Dott. Giulio Pompilio e dal Presidente del Comitato Scientifico di Filarete, Dott. Paolo Milani. LA CORE FACILITY La Core Facility, situata presso Filarete, è costituita da 7 piattaforme tecnologiche: Genomica e bioinformatica Imaging molecolare e cellulare Proteomica Patologia Animale Biomateriali Avanzati Modelli cellulari Modelli vegetali ACCESSO AL SERVIZIO 1. L’accesso ai servizi, disciplinati dalla Convenzione AriSLA-Filarete, è gestito da Fondazione AriSLA che ha redatto il “Disciplinare della Convenzione AriSLA-Filarete 2013/2014, per l’accesso e l’utilizzo dei servizi da parte dei gruppi di ricerca” (http://www.alscience.it/#v53), contenente le indicazioni necessarie ai gruppi di ricerca per l’accesso e l’utilizzo della Facility; 2. L’accesso ai servizi per i progetti extra-bando è legato alla valutazione del Comitato Scientifico Interno, che darà priorità a progetti valutati attraverso un processo di peer-review e afferenti a centri di ricerca situati sul territorio nazionale e a ricercatori con comprovato track record di ricerca nel campo della SLA. 3. Per richiedere l’accesso al sevizio è necessario contattare gli uffici di AriSLA ai seguenti indirizzi e-mail: [email protected] o [email protected] Prestazioni e servizi forniti della Convenzione AriSLA -Filarete PIATTAFORMA DI GENOMICA E BIOINFORMATICA Tecnologie disponibili: Sequenziamento con tecnologie di ultima generazione Genome Analyser GAIIX Illumina per le seguenti applicazioni: - sequenziamento di regioni target; sequenziamento di esoma; sequenziamento di mRNA e small RNA. Caratterizzazione genetica genome-wide di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) con array ad alta densità, disponibili per specie diverse. Caratterizzazione genetica di polimorfismi a singolo nucleotide in regioni candidate del genoma con array Illumina custom che permette di genotipizzare da 1500 a 200K SNPs nelle regioni target. Analisi del profilo di metilazione con array Illumina Human 450K. Analisi di espressione genica con array basati su tecnologia Illumina nell’uomo e nel ratto. Per queste applicazioni è disponibile un iScan Illumina, uno scanner che utilizza un laser, è ad alta risoluzione e consente di scannerizzare e raccogliere le immagini dagli array ad alta densità, quali sono quelli disponibili attualmente sul mercato. La piattaforma di genomica e Bioinformatica offre le competenze e numerosi tools bioinformatici per l’analisi dei dati, secondo le diverse applicazioni: sequenziamento: utilizzando software dedicati le sequenze prodotte vengono allineate al genoma/trascrittoma di riferimento. Geni o trascritti vengono annotati, a questo segue l’identificazione delle varianti o la quantificazione dei trascritti; caratterizzazione di SNPs; controllo di qualità relativo ai campioni (analisi di omogeneità del campione ed eventuale correzione mediante analisi delle componenti principali, valutazione del call rate per campione); studi caso-controllo e studi di associazione che utilizzano tratti fenotipici qualitativi o quantitativi; analisi dati di gene expression derivanti da esperimenti su array di espressione: controllo di qualità dei dati, identificazione di trascritti differenzialmente espressi secondo il disegno dello studio e annotazione dei geni al genoma di riferimento; analisi dati di metilazione: controllo di qualità con procedure standardizzate, identificazione di loci/geni differenzialmente metilati secondo il disegno sperimentale e annotazione degli stessi. Altra strumentazione disponibile Tecan Freedom EVO 75 liquid handler Permette di gestire task ripetitivi di trasferimento di liquidi e possiede un sistema configurabile, in grado di supportare molte applicazioni, come: - estrazione degli acidi nucleici; PCR e reazioni di sequenziamento; diluizioni seriali. Applied Biosystems 7500 Real‐Time PCR consente analisi genetiche potenti e sensibili e possono essere utilizzati per una vasta gamma di applicazioni. Tecan CM Infinite® M 200 NanoQuant è un lettore di micropiastre multimodale sviluppato specificatamente per piccoli volumi di campione Questo strumento sensibile è dotato di filtri UV stabili con una sensibilità da 1ng/µl. Può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni come ad esempio la quantificazione del DNA o dell’RNA. Nella configurazione attuale consente di quantificare 16 campioni in contemporanea. Agilent Bioanalyser 2100: una piattaforma di microfluidica per elettroforesi capillare per la quantificazione e il controllo di qualità di DNA, RNA, proteine. PIATTAFORMA DI IMAGING MOLECOLARE E CELLULARE Tecnologie e know-how disponibili: Microscopia a fluorescenza Wide Field Microscopio Diritto Leica DM2500 è lo strumento ideale per esperimenti di patologia, citologia, ematologia anche per applicazioni di ricerca di base. Con la sua potente illuminazione 100 W, e le elevate prestazioni di qualità ottica è particolarmente adatto per studi che richiedono interferenze differenziali di contrasto o alte prestazioni di fluorescenza. Microscopio Invertito Manuale Leica DMI3000 B supporta sia fluorescenza che osservazioni in luce trasmessa (live cell imaging, time-lapse imaging, fluorescenza multicanale, micromanipolazione, etc..) Microscopio Invertito Automatizzato Leica DMI4000 B è l'ideale per l’osservazione e l’imaging di colture cellulari e tessuti. Il filtro interno dotato di un metodo di gestione dell’eccitazione motorizzata e di FIM (Fluorescence Intensity Manager) consente l’eccitazione dei fluorocromi in meno di 20 millisecondi. Il FIM regola l'intensità della luce a cinque livelli fissi e ricorda le impostazioni per ogni filtro. Stereomicroscopio Leica M205 FA possiede un’ottica completamente apocromatica, un potente zoom 20,5: 1, e una risoluzione a 1050 lp/mm. Permette lo studio di organismi viventi e l’acquisizione di una serie di immagini complesse. Marcature multiple in fluorescenza possono essere acquisite e sono istantaneamente riproducibili grazie alla messa a fuoco, lo zoom e il cambio di filtri e diaframmi motorizzati. Microscopia Confocale Spettrale Leica TCS SPE UV (Leica Microsystems GmbH) è un microscopio confocale progettato per imaging in fluorescenza multicanale su campioni fissati, studi di co-localizzazione, acquisizioni xyz e rendering in 3D. E’ montato su un microscopio diritto con obiettivi ACS 10X, 40X e 63X che permettono la correzione delle aberrazioni cromatiche; laser a stato solido (405, 488, 532 e 633 nm). Leica TCS SP5 AOBS (Leica Microsystems GmbH) è un microscopio confocale adatto anche per campioni fissati, ma specificamente progettato per l'imaging in vivo e in time lapse grazie alla presenza di un modulo di scansione veloce (resonant scanner). E’ montato su un microscopio rovesciato (dotato degli obiettivi: 10X, 20X, 40X Planapo, 63X Planapo) con laser a gas e a stato solido (range di eccitazione da 405 a 633nm); 3 canali confocali spettrali, scanner convenzionale e ad alta frequenza (Resonant Scanner); microscopio con camera climatica per eseguire esperimenti di time-lapse in condizioni ambientali controllate e sistema di perfusione (OkoLab). Sistema ideale per studi fisiologici/funzionali: i.e. misurazione di concentrazioni ioniche o dell’attività enzimatica in cellule e tessuti vitali - Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) e Loss of Fluorescence In Photobleaching (FLIP) che forniscono informazioni sulla mobilità e/o velocità di diffusione di molecole e composti fluorescenti in sistemi viventi - Test funzionali per trasportatori di anioni e canali – Microscopia Correlativa (CLEM). Microscopia elettronica a scansione (SEM) ZEISS SIGMA (Carl Zeiss NTS GmbH) (Thermal Field Emission; Resolution: 1.5nm@20kV ‐ 1.7nm@15kV ‐ 3.0nm@1kV; Magnification: 12x – 500000x; dimensione del campione fino a 125 mm x 125 mm) è un microscopio che offre una vista di superficie dell’intera struttura del campione. La preparazione del campione è abbastanza rapida e semplice e il sistema può fornire immagini con un contrasto apprezzabile. Tessuti, organi interi, piccoli organismi, animali e vegetali, ma anche cellule coltivate su una varietà di substrati possono essere visualizzati anche a risoluzioni ed ingrandimenti molto elevati. Microscopia elettronica a scansione e trasmissione (STEM) Lo Zeiss Multi-mode STEM Detection System permette di introdurre nella camera del SEM fino a 12 griglie TEM contemporaneamente. Permettendo l’analisi ultrastrutturale di tessuti e cellule di origine animale e vegetale e l’immunolocalizzazione di proteine e acidi nucleici a livello ultrastrutturale. Microscopia elettronica a scansione con microanalisi chimica Il Bruker Quantax 400 con 30mm2 XFlash silicon drift detector lavora in combinazione con lo Zeiss Sigma SEM in entrambe le modalità di lavoro (SEM e STEM) ed è un sistema modulare e universale per microanalisi EDX qualitativa e quantitativa che permette di determinare le variazioni spaziali della composizione chimica del campione. Il sistema consente la valutazione degli spettri manuale, automatica o interattiva e fornisce risultati affidabili per i campioni con superfici lucide o irregolari, strati sottili e particelle. Un vantaggio del sistema è il rivelatore XFlash che permette un rendimento elevato e il miglioramento delle capacità di rilevazione degli elementi leggeri rispetto ai vecchi sistemi EDX. Il sistema è in grado di produrre mappe di contrasto chimico con risoluzione spaziale submicrometrica. Litografia a fascio di elettroni Il Raith Elphy Quantum è un generatore di pattern interfacciato con il microscopio elettronico a scansione e permette la lavorazione di superfici con risoluzioni submicrometriche attraverso approcci di litografica classica e procedure di lift-off, ecc. I modelli possono essere progettati con il software CAD. I profili forniti in formato elettronico jpeg possono essere trattati e impressi su diversi tipi di materiali tra cui silicio, vetro, polimeri, idrogel, ecc., ed esempio su polimeri per colture cellulari e dispositivi microfluidici. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) FEI TECNAI G2 20 Twin è un microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione che permette la registrazione simultanea di dati attraverso la piena incorporazione STEM, telecamera CCD, vuoto ultra- clean per immagini ad alta risoluzione sia temperature ambiente che crio-TEM. Consente l’analisi morfologica, la tomografia elettronica e la ricostruzione 3D. High Pressure Freezer for Cryofixation Leica EM HPM100 (Leica Microsystems GmbH) è un sistema di congelamento ad alta pressione per la vetrificazione di campioni biologici in sostituzione o in aggiunta alla fissazione chimica degli stessi. Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System Leica EM AFS2 esegue la sostituzione dell’acqua naturalmente presente nei campioni biologici (attraverso la sublimazione del ghiaccio vetroso) con solventi organici che possono contenere mezzi di fissazione secondaria a freddo e tecniche di abbassamento progressivo della temperatura (PLT) per l’infiltrazione a bassa temperatura e la polimerizzazione di resine acriliche polimerizzate con raggi UV. Ultramicrotomia e Crioultramicrotomia Leica EM UC6 e Leica EM UC7+FC7 per la preparazione di sezioni semi- e ultrasottili e superfici lisce perfette di campioni biologici e non biologici per successivo esame con TEM, SEM, microscopia a forza atomica (AFM) e LM a temperatura ambiente e in congelato. PIATTAFORMA DI PROTEOMICA La piattaforma proteomica consiste di: una facility per la preparazione dei campioni e la separazione miscele complesse di proteine mediante tecniche elettroforetiche (1DE e 2DE) e cromatografiche; una facility di caratterizzazione tramite spettrometria di massa e analisi delle sequenze amminoacidiche. 1D e 2D elettroforesi Ettan™ IPGphor™ 3 IEF System (GE Healthcare), PROTEAN II xi | XL Multi‐Cells (Biorad) e Mini‐PROTEAN® Tetra Cell (Biorad) per studi qualitativi e quantitativi di espressione proteica, rilevamento degli stadi di differenziazione cellulare e studi di cicli di crescita, esame comparativo degli stati fisiologici e patologici per la classificazione e la diagnosi di malattia, monitoraggio dell’azione di farmaci e valutazione qualitativa e quantitativa di pattern proteici, determinazione del peso molecolare, composizione e stato di polimerizzazione di una proteina, valutazione della purezza di preparazioni proteiche LC‐ESI Spettrometria di massa ThermoFisher LTQ Orbitrap Velos ETD e Nano HPLC Ultimate 3000 Software disponibili: - - Discoverer Proteome: software completo di proteomica che include motori di ricerca su database per integrare diverse tecniche per l’identificazione di proteine come CID, ETD, e HCD e per la caratterizzazione di modifiche post-traduzionali, la quantizzazione e l’analisi statistica, l’elaborazione dei dati; Sieve: per l’analisi di metaboliti; MaxQuant: per l'analisi di miscele proteiche complesse, shot gun proteomics e analisi quantitativa sia label free che SILAC. Bruker MALDI TOF/TOF autoflex™ III Software disponibili: - BioTools per l’analisi dei dati; FlexImaging per MALDI imaging. Campi di applicazione per LC-ESI e spettrometria di massa MALDI: caratterizzazione qualitativa e quantitativa del proteoma di cellule e tessuti, incluse la valutazione dell'espressione proteica, l’identificazione di proteine specifiche in miscele complesse e la caratterizzazione di modificazioni post-traduzionali; analisi delle interazioni proteina-proteina e complessi; identificazione di nuovi marcatori biologici in campo clinico e farmaceutico e di antigeni per lo sviluppo di nuovi vaccini tramite SERPA (serological proteome approach); identificazione di nuovi bersagli terapeutici per le malattie ad alto impatto sociale come il cancro e le malattie neurodegenerative; profiling di piccole molecole e metaboliti da campioni biologici (metabolomica); screening per i nuovi composti bioattivi funzionali, individuazione e controllo del deterioramento degli alimenti e proteine allergeniche; sviluppo di nuovi protocolli per l'analisi proteomica basata su nuovi nanomateriali; Controllo qualità delle proteine ricombinanti e dei peptidi sintetici. Sequenziamento automatizzato di proteine/peptidi Applied Biosystems Procise 491 permette il sequenziamento di proteine intatte e peptidi mediante degradazione automatica di Edman. Richiede almeno 40 pmol di proteine che possono essere purificate mediante metodi cromatografici convenzionali o mediante elettroforesi seguita da blotting su membrane polyvinylidendifluoruro (PVDF) commercialmente disponibili. E’ compatibile con la maggior parte dei prodotti chimici utilizzati in proteomica. Il numero di amminoacidi identificato è generalmente 10-20, secondo il campione di partenza. Campi di applicazione: caratterizzazione di proteine ricombinanti: la determinazione rapida della sequenza N-terminale della proteina intatta, eventualmente integrata dalla misura del peso molecolare mediante spettrometria di massa, viene utilizzata per il controllo di qualità delle proteine ottenute mediante tecnologie con-DNA ricombinante; caratterizzazione del processamento N-terminale delle proteine: la rimozione della Met Nterminale o di residui amminoacidici dall’N- terminale delle proteine si osservano di frequente sia come risultato di modificazioni post-traduzionali che durante la sovra-espressione e purificazione di proteine ricombinanti. Questo può risultare in micro eterogeneità che devono essere identificate per ottenere la completa caratterizzazione della proteina di interesse; caratterizzazione di proteine da organismi per i quali non sono disponibili dati genomici. La chimica di Edman si basa sempre su un approccio di sequenziamento "de novo " in quanto l'assegnazione della sequenza amminoacidica dai risultati sperimentali è indipendente dal confronto con banche dati; caratterizzazione dei pattern polipeptidici generati mediante proteolisi limitata della proteina di interesse per studiarne l’organizzazione dei domini funzionali, i cambiamenti conformazionali e le interazioni proteina-proteina. Associata alla determinazione dei pesi molecolari basata sulla spettrometria di massa, l‘analisi della sequenza N-terminale di frammenti separati mediante SDSPAGE consente la descrizione completa del pattern proteolitico. Analisi amminoacidica Japan Spectroscopy (Jasco) HPLC richiede la derivatizzazione pre-colonna degli amminoacidi primari con orthophthalaldehyde (OPA) seguita da separazione HPLC e rivelazione in fluorescenza. Il metodo permette di quantificazione un minimo di 10 pmol di ciascun amminoacido, ma la sensibilità può essere incrementata attraverso un attento trattamento preliminare e un’attenta preparazione dei campioni. Campi di applicazione: tutti gli studi che richiedono la determinazione dell'esatto contenuto amminoacidico di una proteina o di amminoacidi liberi presenti in fluidi biologici quali sangue, urine, etc. nonché il contenuto di aminoacidi nel cibo o l’esatta determinazione del contenuto proteico di un campione. Gel Image Analysis Biorad Molecular Imager GS‐800 Calibrated Densitometer Biorad Molecular Imager ChemiDoc XRS System è un avanzato sistema di rilevamento in chemiluminescenza, in fluorescenza e nella regione UV-visibile che include una camera CCD a 16-bit supersensitive, una camera oscura a tenuta di luce compatta, transilluminatore slide-out, un obiettivo motorizzato e fonti di illuminazione software-driven, e un potente software di analisi (Quantity One 1-D). Il ChemiDoc XRS può essere utilizzato per l'imaging in una vasta gamma di applicazioni (western blotting, rilevamento di acidi nucleici, 2-D elettroforesi su gel, dot blotting, densitometria, e conteggio di colonie) con un ampio portafoglio di metodi di rilevamento (Immun-Star HRP e AP in chemiluminescenza così come bromuro di etidio, SYBR Green I, SYPRO Ruby, Cy3, rodamina, Green Fluorescent Protein, Hoechst, argento, rame, e colorazione con Coomassie Blue). Biorad Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System permette l'imaging di alta qualità di una vasta gamma di campioni: gel 1-D e 2-D, blots chemiluminescenti, micropiastre, e autoradiogrammi. Inoltre supporta una vasta gamma di applicazioni: studi di proteomica e genomica; gel proteici (2-D), analisi multicanale tipo DIGE e altre tecniche di elettroforesi; gel imaging di acidi nucleici e proteina (1-D); multiplex gel e blot imaging; imaging di western, northern, e southern blot; immagini quantum dot; conteggio di colonie. La configurazione standard include una CCD camera supersensibile, camera oscura, epi-illuminazione (blu e bianco), transilluminazione (UV), fluorescenza, obiettivo di messa a fuoco e Quantity One 1-D software di analisi. Il VersaDoc MP 4000 è un imager ideale per studi di proteomica che offre la massima flessibilità con la possibilità di ottenere immagini colorimetriche e fluorescenti di gel e blot. Software disponibili: - PD-Quantity One: un pacchetto per l'imaging e l’analisi di gel elettroforetici 1-D, dot blot, e western blot. PD-Quest: un pacchetto per l'analisi e databasing di 2-D gel. Il software offre potenti strumenti di analisi comparativa per rivelare sottili differenze tra i gel in fase di analisi (per esempio, per studiare l'effetto di variabili come condizioni fisiologiche/patologiche, dose-risposta, e time course). PIATTAFORMA DI PATOLOGIA ANIMALE La mission del laboratorio di Patologia Animale (MAPLab) è quella di fornire un servizio di patologia animale integrato e altamente qualificato con particolare attenzione per la patobiologia degli animali da laboratorio utilizzati nella ricerca biomedica. Offrire la propria expertise per sostenere gruppi di ricerca interessati nella generazione, validazione e valutazione di modelli animali che ricapitolano specifiche condizioni umane o utilizzati in studi tossicologici e di efficacia preclinica. I servizi del MAPLab includono: necroscopia di roditori e conigli da laboratorio: raccolta degli organi e peso; fissazione per immersione di campioni rappresentativi di tutti gli organi e tessuti (può essere effettuata anche fissazione per perfusione per la valutazione dei tessuti critici come il sistema nervoso centrale); documentazione immagine digitale di lesioni macroscopiche, e relazione scritta; istologia di tessuti animali: completo ed accurato esame morfologico dei tessuti animali per l'identificazione delle lesioni, su campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina, su campioni colorati con ematossilina e eosina o colorazioni speciali (acido periodico Schiff, Alcian PAS, blu di toluidina, Warthin Starry, Gram, ecc.); immunoistochimica (IHC): colorazioni immunoistochimiche per numerosi marker condotte con un semiautomated staining centre in tessuti animali, in particolare murini; analisi d’immagine: metodi standardizzati e riproducibili di analisi per la valutazione e la quantificazione di specifici parametri morfologici di sezioni di tessuto, mediante l’utilizzo di software specifici per misurare automaticamente parametri quali la forma, il colore, la superficie, il numero di oggetti e altri parametri (quantificazione delle lesioni in studi di efficacia quantificazione delle lesioni negli studi di tossicità, conteggio e misurazione delle strutture di tessuti e cellule, misurazione di positività istochimica e immunoistochimica); altri servizi: - valutazione di singolo caso; - peer-review della valutazione istopatologica; - microfotografie di lesioni istologiche; - formazione pratica di laboratorio tecnico; - preparazione o revisione di articoli scientifici o rapporti interni; - organizzazione di corsi o convegni scientifici; - consulenze su slide istopatologiche di interesse didattico con descrizione istopatologica AFIP style, diagnosi morfologica/interpretazione delle lesioni; - servizio di consulenza nella predisposizione di protocolli sperimentali per studi in vivo in animali di laboratorio in ottemperanza a quanto richiesto dalla legislazione cogente (D.Lvo n. 116/92 e successive modifiche, Linee guida per la sistemazione e la tutela degli animali impiegati a fini sperimentali o altri fini scientifici – Raccomandazione 2007/526/CE) e dalla nuova Direttiva Europea 2010/63/UE (ancora in fase di recepimento malgrado i termini siano scaduti lo scorso settembre). Attrezzature disponibili nel laboratorio - processatore di tessuti per inclusione in paraffina; centro di embedding; microtomo automatico rotativo; centro semiautomatico di colorazione; microscopi ottici con fotocamera digitale collegata a un computer con specifici software; archivi di wet tessues; archivi dei blocchi di paraffina e diapositive; archivio elettronico delle immagini digitali; banca refrigerata di anticorpi primari. Campi di applicazione: istologia e patologia su tessuti animali; fenotipizzazione di modelli di topo geneticamente modificati (GEM); impostazione di modelli animali utilizzati nella ricerca biomedica o in studi preclinici; identificazione e la quantificazione delle lesioni negli studi preclinici di efficacia; identificazione e quantificazione delle lesioni negli studi di tossicità; supporto patologico durante i programmi di sorveglianza sanitaria nelle animal facility; individuazione delle condizioni patologiche "spontanee" negli animali da laboratorio; Rilevamento in sezioni istologiche di proteine strutturali (es. citocheratine), ormoni (es. prolattina, insulina, calcitonina), recettori (recettori per gli estrogeni, recettore del progesterone, c-Kit), marcatori di proliferazione cellulare (es. Ki67, PCNA), marcatori di apoptosi (es. Caspase3), oncogeni e prodotti genici di soppressori tumorali (es. HIF-1 alfa, p53, β-catenina), marcatori di differenziazione dei leucociti (es. CD3, CD79alpha, CD18), antigeni microbici (es. Helicobacter spp., Leptospira spp.); quantificazione delle lesioni in studi di efficacia; quantificazione delle lesioni in studi di tossicità; conteggio e la misurazione di strutture tissutali e cellule; misurazione di positività istochimica e immunoistochimica. PIATTAFORMA DI BIOMATERIALI AVANZATI Micro e Nano-fabbricazione - Modifica e Funzionalizzazione di Superfici Cleanrooms: la piattaforma è dotata di un ambiente di 70m2 con un livello controllato di polveri. Sono presenti stanze differenti con diversi livelli di contaminazione (tra ISO8 e ISO5) e una camera per fotolitografia con idonee luci gialle. Spin coater model WS650Sz‐6NPP‐Lite (Laurell Technologies Corporation) ha la capacità di rivestire fino a 6 "di diametro (150 mm) superfici wafer o 4" (100 mm) di substrati quadrati, supporti standard per vetrini da microscopio. Lo strumento è dotato di un Digital Processor Controller e collegamento in remoto a un PC. Velocità di rotazione tra 100 e 12000 RPM (risoluzione> 0.5 RPM). Accelerazione selezionabile fino a 13KRPM/sec. Programmi di archiviazione con capacità illimitata. NanoOnSi nanostructured thin films deposition system (Tethis) è un sistema per la deposizione di film sottili di materiali nanostrutturati mediante la tecnica Supersonic Cluster Beam Deposition (SCBD). E’ composto da due camere a vuoto: la camera di espansione per la generazione del fascio supersonico e la camera di deposizione per la raccolta delle nanoparticelle sui substrati. L'apparecchio è dotato di un PMCS™ (Pulsed Microplasma Cluster Source) che è in grado di produrre metallo e nanoparticelle di metalloossidi. Un holder robotico per la manipolazione substrati è posto nella camera di deposizione. Il sistema è in grado di ricoprire in modo omogeneo strato superfici fino a 200x200mm2 ed è interfacciato con la cleanroom, consentendo la produzione di film sottili in ambiente controllato. Box coater TECNA per deposizione di film sottili che monta Ferrotec e‐beam evaporation source: questo sistema è specificamente progettato per la deposizione di film sottili multistrato. Il sistema è interfacciato alla struttura cleanroom permettendo la produzione di film sottili in ambiente altamente controllato ed è in grado di gestire supporti con diametro fino a 10 millimetri. Grazie ad una fornace IR, la temperatura del substrato può essere aumentata fino a 600° C. La pressione durante il processo di deposizione può essere più bassa di 10-8mbar. Il cuore del sistema è la Ferrotec EV‐M6 multipocket e‐beam source in grado di depositare sequenze di 4 diversi materiali (metalli o ossidi metallici) ed è adatto per una vasta gamma di applicazioni, tra cui semiconduttori, film sottili e rivestimenti ottici. Plasma System Colibrì (Gambetti) è un desk-top plasma system semplice e facile da usare, progettato per chi deve pulire, modificare o attivare superfici di metallo, plastica, ceramica o materiali cartacei o altro. L'alimentatore funziona in regime di RF a 13,56 MHz, 200 W. La camera del plasma è cilindrica con un diametro di 100 mm e una profondità di 260,5 mm. Il sistema è controllato da un microcomputer e utilizza due controller di flusso di massa (MFC) per regolare la percentuale di ogni singolo gas. Atomic Force Microscopy (AFM). Sono disponibili due strumenti AFM: - Multimode‐Nanoscope IV (Veeco Instruments, USA), dotato di un pre-amplificatore di low current fatto in casa per la caratterizzazione elettrica dei campioni su scala; - Bioscope II‐Nanoscope V (Veeco Instruments, USA) integrato in un microscopio rovesciato per la caratterizzazione simultanea AFM e ottica di campioni biologici, compresa la microscopia a fluorescenza. Surface science facility: UHV apparatus Leybold LHS 10/12 dotato di: - X‐ray Photoemission Spectroscopy (XPS); - Ultraviolet Photoemission Spectroscopy (UPS); - Auger Electron spectroscopy (AES); - Electron Energy Loss Spectroscopy (EELS). Fotoluminescenza e spettroscopia Raman dotato di: - quattro fonti di eccitazione: un laser continuo Argon BeamLok series 2065‐7S (Spectra Physics): lines 514.5nm/2600mW, 488nm/1900mW, 364nm/250mW, 351nm/250mW; un laser continuo HeCd IK5352 R‐D series (Kimmon): lines 441.6nm/50mW, 325nm/10mW; un laser continuo He‐Ne R‐30991 (Newport) 633nm/5mW; un laser pulsato Nd:Yag Laser Giant G790‐20 (Quanta System).at 532 nm (9ns @ 20Hz max): lines 1064nm (1600mJ/pulse), 532nm (750mJ/pulse), 355nm (400mJ/pulse), 266nm (120mJ/pulse). - monocromatore (Acton SP‐2558‐9N, Focal length = 500 mm) dotato di tre griglie ((68x68 mm con 300 linee/mm (blazing 500nm), 600 linee/mm (blazing 300nm) e 1200 linee/mm (blazing 500 nm). - CCD Spec10: 400B/LN (Roper‐Princeton Instrument), raffreddamento ad azoto liquido, retro illuminazione, 1340x400 pixel, 20x20 pixel, Campo spettrale 200-950 nm, dotato di unità di controllo ST133A con convertitore A / D da 16 bit a 1 MHz e 100KHz. Spettroscopia di fluorescenza: fluorimetro Fluorolog-3 (Jobin Yvone) dotato di lampada allo xeno e rivelatore CCD. Angolo di Contatto: First Ten Angstroms FTA200 sistema dotato di telecamera per misure di angolo di contatto, tensione superficiale e all’interfaccia, bagnabilità e assorbimento. Il software dedicato può misurare o calcolare Angolo di contatto statico o all’equilibrio, L’analisi, effettuata con il software dedicato, è basata sulla forma e sulla dimensione della goccia, i risultati possono essere visualizzati direttamente con grafici o esportati per successive elaborazioni. Profilometro: strumento dotato di uno stilo con raggio di raccordo da 2 o 12,5 μm è ha la possibilità di acquisire mappe topografiche 3D e misurare spessori. Utile per la caratterizzazione superfici e microstrutture. Spotter: strumento per la realizzazione di ad-hoc microarray, dotato di nozzle con il quale è possibile depositare gocce dal volume dell’ordine dei picolitri (pL) sulle superfici da caratterizzare o funzionalizzare. Scan Array reader: Lettore in fluorescenza di microarray su slide di vetro, nitrocellulose e superfici riflettenti. Presenta una risoluzione tra i 2 e i 40 micron/pixel. Microarray scanner a 2 canali con laser nel verde e nel rosso accoppiato con filtri di emissione per eccitazione e detection dei fluorofori comunemente usati. Sintesi, Modifica e Caratterizzazione chimico-fisica e biologica di molecole organiche, materiali polimerici e sistemi nanostrutturati per applicazioni biotecnologiche Strumentazione standard per sintesi chimica organica: cappe aspiranti, palloni incamiciati, sistemi di raffreddamento, evaporatore rotante, colonne cromatografiche, bilancia analitica (1x10-5 g) ecc. Liofilizzazione: liofilizzatore Telstar Cryodos 50, capacità 2 litri di ghiaccio in 24 ore. Spettroscopia FT-IR: Spettrometro IR Jasco FT/IR-300E equipaggiato per misure in trasmissione (es. pastiglia KBr, NaCl) e in riflessione con accessorio ATR-FTIR. Spettroscopia di assorbimento UV-VIS: Spettrofotometro UV-VIS. Jasco UV / VIS 7850. Cromatografia ad alte prestazioni: sistema HPLC con rivelatore UV-Visibile per la separazione e determinazione di miscele di composti organici a basso peso molecolare. Sistema SEC (Size Exclusion Chromatography) per la determinazione dei pesi medi molecolari di composti polimerici (solvente organico o acquoso). Dynamic light scattering (DLS): Nanosizer Nano ZS 90 dotato di laser He-Ne (633 nm, 4 mW). E’ in grado di determinare con accuratezza il diametro di micro-/nanoparticelle in soluzione nell’intervallo di 3nm-3µm. Analisi meccanica statica: Dinamometro MP Strumenti ETM503A (5 kN) equipaggiato per test in compressione, trazione, taglio e flessione, anche a ciclo continuo su campioni di qualsiasi materiale. Inoltre sono opzionalmente disponibili vari accessori per test meccanici in ambiente acquoso e/o termostatato. Calorimetria Differenziale a Scansione (DSC): Perkin Elmer DSC 8000. Termogravimetria (TGA): Perkin Elmer TGA 4000. Reometria: Reometro rotazionale TA Instruments ARES-G2. Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare: Bruker Advance 400 MHz (1HNMR, 13CNMR). Strumenti standard per camere di coltura: autoclavi, thermoshaker, centrifughe (fino a 80.000 giri/min) agitatori, microscopi ottici, incubatori per coltura cellulare; cappe chimiche e cabinet a flusso orizzontale e verticale; camere fredde a +4°C, congelatori a +4°C, -20°C, -80°C e -190°C (dewar con azoto liquido). PIATTAFORMA DI MODELLI CELLULARI Imaging del Calcio La tecnica dell'imaging del calcio consente di visualizzare e misurare variazioni della concentrazione dello ione calcio a livello subcellulare tramite l'uso di specifici indicatori fluorescenti. Questi indicatori attraversano la membrana cellulare e sono trattenuti all’interno della cellula, normalmente nel citoplasma, dove legano in modo reversibile gli ioni calcio. Il legame allo ione calcio causa una variazione della fluorescenza dell’indicatore, che viene utilizzata come indice della variazione della concentrazione dello ione. Il nostro laboratorio utilizza l’indicatore fluorescente FURA2 per analizzare le variazioni di calcio citoplasmatico in singole cellule. L’acquisizione e l’analisi delle immagini delle cellule caricate con l’indicatore fluorescente viene effettuata tramite programma Workbench Imaging 6 (IW6), un programma collaudato per l’acquisizione e l'analisi dinamica multicanale di immagine in fluorescenza, con un preciso controllo del cambiamento di lunghezze d'onda. Il software è installato su un microscopio verticale Leica DMI6000 B dotato di una telecamera Andor iXonEM CCD ultraveloce, altamente sensibile e dei seguenti obiettivi: 10X, 63X, e un obiettivo APO Lambda BLU 40X, specificamente progettato per l'imaging con Fura. Utilizziamo come sorgente luminosa il monocromatore Polychrome V. Elettrofisiologia - single cell patch clamp Il set up di patch clamp permette la misurazione di voltaggio e/o corrente attraverso la membrana neuronale ed è costituito dal sistema Multiclamp 700B, un amplificatore ad alta velocità, e dal sistema di acquisizione dati Digidata 1440, un digitalizzatore a basso rumore per la registrazione dei dati su un computer Windows. L'intero set-up è montato su un microscopio invertito Leica DM3000B su un tavolo antivibrante con gabbia di Faraday, che impedisce l'ingresso o l'uscita del campo elettromagnetico. Il sistema di perfusione per lo screening di farmaci è fornito dal sistema Six Channel Perfusion Valve Control (VC-6; Instruments Warner). Il sistema è dotato anche di una cameretta modificata con due elettrodi per effettuare stimolazioni di campo da utilizzare per protocolli di plasticità sinaptica o per saggi di rilascio vescicolare di neurotrasmettitori. Applicazioni: eEsperimenti di elettrofisiologia in configurazione voltage clamp per registrare le correnti postsinaptiche eccitatorie o inibitorie spontanee e in miniatura, al fine di valutare l'attività sinaptica e i processi di rilascio vescicolare di neurotrasmettitori ed indagare le proprietà biofisiche e l'espressione dei canali voltaggio dipendenti durante lo sviluppo neuronale. Queste analisi sono effettuate in modelli murini di malattie neurodegenerative in vitro e per effettuare screening di farmaci neuroprotettivi o neurotossici; registrazioni in current clamp per registrare i potenziali di azione ed indagare le proprietà fisiche dei canali voltaggio dipendenti e studiare le proprietà passive e l’eccitabilità dei neuroni; protocolli di stimolazione di campo per la valutazione della plasticità sinaptica. ROCHE ‐ xCELLigence System. Il sistema Roche-xCELLigence utilizza un sensore microelettronico per controllare eventi cellulari in tempo reale e senza incorporazione di marcatori. Le cellule vengono piastrate su speciali e-Plates sul cui fondo sono integrati microelettrodi interdigitati, connessi ad un’unità di controllo, registrazione ed analisi. La misura dell'impedenza attraverso i microelettrodi fornisce informazioni quantitative sullo stato biologico delle cellule, quali il numero di cellule, la vitalità e la morfologia, permettendo di monitorare le colture in modo continuo e prolungato. La piattaforma inoltre offre i seguenti servizi: - - - preparazione di colture primarie di neuroni, astrociti o microglia, purificate o mantenute in cocoltura, allestite da roditori (ratto e topo, wild-type o transgenici) da varie aree cerebrali (corteccia, ippocampo, cervelletto); protocolli per trasfezione e silencing di proteine in colture primarie neuronali; caratterizzazione e quantizzazione dei contatti sinaptici e analisi morfologica delle spine dendritiche; valutazione dell’eso-endocitosi delle vescicole sinaptiche tramite saggio immunocitochimico; preparazione di frazioni sinaptosomiali e vescicole sinaptiche; determinazione dei livelli di ATP extracellulare con saggio di luciferasi. PIATTAFORMA DI MODELLI VEGETALI Microdissezione Laser (ML) Il sistema Leica LMD6000 consente la purificazione di singole cellule e tipi cellulari da preparazioni istologiche (organi e tessuti complessi). Tale tecnologia permette di aumentare la risoluzione degli studi di genomica e trascrittomica a livello di singolo tessuto e singola cellula. E’ dotato di messa a fuoco automatica, movimento laser ottico e non meccanico, un’ampia gamma di obiettivi e CCIC automatizzato (1.25x - 150x), live cell‐cutting module. Possiede una precisione di scansione di 2 μm e la raccolta del campione avviene per gravità (microscopio in posizione verticale). Il servizio offerto include: - preparazione istologica dei campioni; micro-dissezione dei tessuti o cellule target; estrazione di DNA genomico e/o RNA totale; analisi quantitativa e qualitativa degli acidi nucleici; preparazione di cDNA; amplificazione dell’RNA totale per analisi trascrittomiche; analisi di espressione tramite Real Time-PCR.
