Cryptococcus e Criptococcosi - E-learning

Cryptococcus e Criptococcosi : Storia
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Cryptococcus e Criptococcosi
Dr. Gabriella Pini
Dipartimento di Sanità Pubblica
sez. Microbiologia
Università degli Studi di Firenze
1894:Sanfelice in succo di pesca Saccaromyces neoformans
1894: Busse (Buschke) da lesione umana
1901: Vuillemin
1914: Verse
S. hominis
genere Cryptococcus
pubblicazione primo caso meningoencefalite
1950 e anni successivi
accordo sul nome C. neoformans
Inquadramento Tassonomico
Principali caratteristiche del genere Cryptococcus
Utilizzo non fermentativo degli idrati di carbonio
Assimilazione di Inositolo
Produzione di ureasi
Forma sessuata in vitro
Filobasiella neoformans Basidiomicete
39 Specie conosciute
Cryptococcus neoformans
unica specie riconosciuta come
patogena
Rare segnalazioni per C. albidus, C. curvatus e C. laurentii
Caratteristiche Morfologiche
Basidi con basidiospore
Riproduzione sessuata osservata soltanto “in vitro” fra
mating-type diversi (a e )
Budding yeast
Cryptococcus neoformans
Cellule lievitiformi, ovali o rotonde,
spesso gemmanti (ellittiche nella var. gattii)
Dimensioni 3-8 micrometri di diametro
Capsula polisaccaridica di
5-20 micrometri di spessore
1
Caratteristiche della Capsula
Glucoronoxilmannano(GXM) 90%
Galattoxilmannano (GalXM)
Mannanoproteina (MP)
Composizione chimica
Effetti sul sistema immunitario
X400
Aspetto morfologico su Corn Meal Agar o Sabouraud Agar
Colonie convesse bianco crema
Protezione dalla fagocitosi
Interferenza con la risposta di tipo infiammatorio
Inibizione diretta della migrazione dei leucociti
Riduzione della proliferazione linfocitaria
Cellule rotonde spesso gemmanti, assenza di pseudoife,
cellule distanziate fra di loro ad indicare la presenza della
capsula che non è visibile
Stipite isolato da CSF
Altre Caratteristiche
Sierotipi
(storicamente
anticorpi policlonali
di coniglio)
Varietà di
C. neoformans
Stato Sessuato
(osservato soltanto
“in vitro”)
D
neoformans
Filobasidiella
neoformans
var.
neoformans
BeC
gattii
A
grubii
Filobasidiella Filobasidiella
neoformans
neoformans
var.
var.
neoformans
bacillispora
Fattore di virulenza
Proprietà
biochimiche
varietà
neoformans
varietà
gattii
varietà
grubii
Sensibilità alla
canavanina (CGB
medium) Canavanina-Glicina-
si
no
si
no
si
no
si
si
no
si
Blu di bromotimolo
Assimilazione della
glicina (CGB o GCP
medium) GlicinaCicloeximide-rosso Phenol
Assimilazione della
timina (CDBT medium)
Creatinina-Destrosio-Blu di
bromotimolo-Timina
(cambiamento (cambiamento
colore
colore bluarancio)
verde)
Assimilazione della
D-prolina
no
no
Ecologia delle Varietà di
Cryptococcus neoformans
Varietà
Habitat
Varietà sul terreno GCP (Salkin e Hurd)
A-D Cryptococcus neoformans var neoformans
B-C Cryptococcus neoformans var gattii
neoformans
Sierotipo D
Suolo
contaminato
con guano di
piccioni e di
altri uccelli
gattii
Sierotipo
BeC
grubii
Sierotipo A
Alberi di
eucalipto
Suolo
contaminato
con guano di
(legno in
decomposizione) piccioni e di
altri uccelli
Area
Distribuzione Mondiale
Mondiale
geografica (predominante tropicale e
in Europa)
sub-tropicale
2
Criptococcosi Umana
Fino agli anni ’80
malattia ubiquitaria e sporadica
malattia opportunistica con
prevalenza del 2-10% in Europa e
USA, superiore al 15% in Africa e
Sud-Est asiatico
Comparsa HIV+
Letalità
3-20% negli HIV+
0-12% negli HIV-
(12%: Pappas, Perfect; 2001)
Fattori di Rischio per la Criptococcosi
Infezione da HIV
Corticosteroidi (prednisone >20mg)
Trapianti di organo
Criptococcosi Umana
Situazione attuale
Nei paesi sviluppati diminuzione dell’incidenza
della criptococcosi fra i pazienti AIDS per la
profilassi con fluconazolo e HAART
Aumento dell’incidenza della malattia nei paesi
dove gli individui HIV+ non hanno la
possibilità di accedere a profilassi e HAART
Fra i soggetti HIV- nessuna variazione
significativa dell’incidenza della malattia
(0,5-5 casi per milione di abitanti)
Manifestazioni Cliniche
Forme polmonari
Forma cronica
può dare noduli o masse,
cavità, linfoadenopatia
Linfomi, leucemie croniche, cancro polmonare
Malattia polmonare cronica ostruttiva
Diabete
Spesso asintomatica
Infezione acuta
Sarcoidosi, cirrosi, Lupus erythemat. sistemico
Artrite reumatoide, gravidanza
Rara, più frequente nei
pazienti AIDS
Si presenta con febbre, tosse, dispnea
Manifestazioni Cliniche
Forme disseminate
Sistema
Nervoso
Centrale
Cute
Altro
Meningoencefalite, raramente masse fungine
intracerebrali singole o multiple (Alterazioni psichiche)
Lesioni poco doloranti tipo papule, placche,
ulcere, masse sottocutanee
Endoftalmite, corioretinite, congiuntivite, otite,
sinusite, miocardite, pericardite, epatite, artrite,
endocardite, gastroduodenite, colecistite, peritonite,
ascessi renali, osteomielite, linfoadenite, prostatite
Radiografia polmonare: infezione criptococcica, lobo
superiore destro
3
Risonanza magnetica del cervello: visibili diverse
masse bianche corrispondenti a criptococcomi
Lesione nodulare cutanea
Papule sul volto
Lesioni cutanee ulcerate in individui HIV+
A large tumour-like plaque with central ulceration and small
satellite papulonodular lesions resembling those of molluscum
contagiosum. Cutaneous Cryptococcus laurentii infection in a
immunodeficiency virus-negative patient
Diagnostica di Laboratorio
Esame diretto dei campioni
Preparati a fresco
Istopatologia
Metodi colturali
Indagini sierologiche
Ricerca di anticorpi
Ricerca di antigeni
Sonde specifiche
Metodi di biologia molecolare
Amplificazione genomica
mediante PCR o nested-PCR
4
Esame Diretto dei Campioni
Esame microscopico del liquor con Inchiostro di China
Sensibilità: 80% in pazienti HIV+
50% in pazienti HIV-
(103- 104 cellule/ml)
Vantaggi: Test rapido e semplice
Svantaggi: sensibilità limitata soprattutto in HIVfalsi positivi
persistenza della positività
( lieviti scarsamente capsulati)
Istopatologia
Colorazioni aspecifiche: Papanicolau, Ematossilina-Eosina
Colorazioni specifiche: Calcofluor white (chitina)
impregnazione argentica (Gomori)
Colorazioni per la capsula: Mucicarminio
acido periodico-Schiff…..
Utile per lesioni localizzate soprattutto cute e polmone
L’esame dell’aspirato percutaneo di noduli polmonari o del BAL
può esser utile per la diagnosi precoce in AIDS
Polmone: Criptococchi con grossa capsula
Cellule lievito capsulate in tessuto cerebrale
Colorazione Mucicarminio
5
Tessuto cerebrale: impregnazione argentica
secondo Gomori
Metodi colturali
Optimum di temperatura di sviluppo 37°C o
leggermente inferiore (non tollera temperature
superiori a 40°C)
pH del terreno 5-7 (non tollera pH superiore a 7,6)
Tempo minimo di incubazione 48 ore (superiore
per la var. gattii)
Histological picture (periodic acid-Schiff staining) showing
numerous organisms in the cystic formations (gelatinous form); the
yeast cells stained positively red.
Coltura di 48 ore su
SDA
Colonie bianco crema convesse tendenti a scurire
col tempo, possono avere anche aspetto mucoso se
gli stipiti sono dotati di grossa capsula
Metodi colturali
Coltura di CSF
Sensibilità: 103- 107CFU/ml di CSF
Normali terreni per micologia come Sabouraud
dextrose agar
Emocoltura
Vecchia coltura
su SDA
Sensibilità: scarsa in HIV-, 35-68% in HIV+
Con metodi radiometrici (BACTEC) è
consigliato subcolturare
La lisicentrifugazione aumenta la sensibilità
6
Metodi colturali
Altri materiali (escreato, urine ecc.)
Sensibilità: scarsa
( escreato spesso negativo anche in caso di criptococcosi
polmonare)
E’ consigliato l’uso del terreno di Staib all’estratto di
semi di Guzotia abissinica (colonie brune) per
differenziare da altri lieviti
E’ utile l’aggiunta di antibatterici ma non di cicloeximide
che lo inibisce
Identificazione presuntiva
Aspetto e colore delle colonie
Osservazione microscopica di lieviti capsulati (da
HIV+ sono stati isolati lieviti privi di capsula o con capsula
molto sottile)
Crescita a 37°C
Produzione di ureasi (sono descritti casi dovuti a ceppi
ureasi negativi)
Sviluppo di colonie brune su Staib-agar
(Produzione di fenolossidasi)
Identificazione di specie
Determinazione del profilo biochimico di
assimilazione delle fonti di azoto e di carbonio
Micrometodi commerciali che impiegano test biochimici
convenzionali opportunamente modificati. Tempo minimo
di incubazione 24 ore
ID 32C e API 20C AUX (Bio Mérieux)
Minitek System (BBL)
Auxacolor (Bio Rad)
Fungichrom I e Fungifast I Twin (International Microbio,
distrib. DID)
Vitek Yeast Biochemical Card , sistema automatizzato
(Bio Mérieux)
Identificazione di specie
Identificazione di specie
Determinazione del profilo biochimico di
assimilazione delle fonti di azoto e di carbonio
Metodi di biologia molecolare
Ricerca di enzimi preformati mediante substrati
cromogeni. Tempo di incubazione medio 4 ore
Microscan rapid Yeast Identification
Sonde genomiche
Sonda a DNA marcata con estere di acridinio che emette
un segnale chemioluminescente, specifica per rRNA
(AccuProbe Bio Mérieux)
Fongiscreen 4H (Bio Rad)
RapID Yeast Plus system
Remel
distribuito da DID
100% di sensibilità e specificità
partendo da una sola colonia prelevata dalla coltura (1993)
7
Identificazione di specie
Metodi di biologia molecolare
Metodi basati su PCR
Multiplex-PCR con set di primer per le regioni ITS
(Internal Trascribed Spacer) del gene per rRNA delle più
comuni specie fungine responsabili di micosi profonde,
(CN4 e CN5 per C.neoformans)
100% sensibilità e specificità
(Luo, Mitchell, 2002)
Multiplex-PCR con primer per la regione ITS1 fra il gene
per rRNA 18S e 5,8S per identificare lieviti in emocolture
positive, 100% specificità, 97% sensibilità
(Chang et al., 2001)
Identificazione di specie
Metodi di biologia molecolare
Metodi basati su PCR
Multiplex-PCR con reverse primer universale per funghi
(regione 26S rRNA) e 8 forward primers per le regioni
ITS 1 e 2 (Internal Trascribed Spacer) del gene per rRNA
specifici per le più comuni specie di Candida e
C.neoformans (CN)
Utilizzata per l’identificazione di miceti in emocolrure
positive
Identificazione in 6 ore
Li YL et al, 2003
Sierotipizzazione
Non rilevante per la diagnosi
Iportante per studi epidemiologici
Crypto Check Kit (Iatron Laboratories, Tokio)
Impiega anticorpi monoclonali diretti contro gli
antigeni capsulari
Altri metodi sperimentali
es. sierotipizzazione
basata sull’analisi diretta del supernatante colturale
con la tecnica dot enzyme assay
(Belay et al., 1996)
Sierologia
Ricerca di anticorpi
Possibile ma poco utile a
scopo diagnostico
Agglutinazione al latex
Ricerca antigene polisaccaridico capsulare solubile
mediante ac specifici che ricoprono particelle di lattice
(Bloomfield et al.1963)
Ricerca di antigeni
SIERO
Agglutinazione al Latex
Sensibilità e Specificità
CSF
Fluidi polmonari
Diagnosi rapida di criptococcosi
Urine
Molto usata a scopo
diagnostico
Metodi immunoenzimatici
93-100% per CSF
83-97% per siero
Sensibilità inferiore per altri
materiali
(rileva in media 10ng di polisaccaride per ml
di fluido)
8
Kit diagnostici commerciali
Latex-Crypto antigen detection system
IMMY, Immuno-Mycologics, Norman, OK, USA
Pastorex Cryptoplus
Bio-Rad (solo sierotipi A e D)
Kit diagnostici commerciali
Murex Cryptococcus
Remel, USA, distribuito da DID
Calas Cryptococcal Ag Latex Agglutin. System
Meridian Bioscience Europe
CryptoLA
Wampole, USA, distribuito da Bouty
Serodirect Eiken Cryptococcus
Eiken Chemical; Tokyo, Japan
Possibili cause di risultati falsi positivi
Fattore reumatoide
Pretrattamenti per ridurre il
numero di risultati falsi positivi
Agenti riducenti (2- -mercaptoetanolo)
Infezioni da Trichosporon spp ed altri
microrganismi cross-reagenti col polisaccaride
criptococcico (Stomatococcus mucilaginosus)
Bollitura per 5 minuti con EDTA
Contaminazione con frammenti di agar o con
talco dei guanti
(In genere sono necessari per il siero,
raramente per CSF)
Enzimi proteolotici (Pronasi)
Lavaggio di vetrini con sapone o disinfettanti
Uso di idrossietilamido (HES) a basso peso
molecolare per ricostituire il volume intravascolare
Possibili cause di risultati falsi negativi
Effetto prozona
Presenza di immunocomplessi
Bassa carica micotica
Infezione dovuta a stipiti scarsamente
capsulati
Pretrattamenti per ridurre il numero
di risultati falsi negativi
Diluizione del siero per eliminare l’effetto
prozona
Stessi trattamenti indicati per ridurre i falsi
positivi
Test effettuato nelle fasi molto precoci
dell’infezione
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Test Immunoenzimatici
Premier Cryptococcal Antigen
Meridian Bioscience Europe
Ricerca l’antigene glucuronoxilmannano in siero e CSF
madiante ac monoclonali
Test Immunoenzimatici
Non presenta effetto prozona
Non dà falsi positivi con fattore reumatoide
Non necessita di trattamento con pronasi
Ha sensibilità maggiore rispetto ad
agglutinazione al Latex
Ha la stessa specificità di agglutinazione al Latex
Metodi di biologia molecolare
Metodi di biologia molecolare
Metodi basati su PCR con primer panfungini
Sonde genomiche
Sonda a DNA per rRNA (AccuProbe Bio Mérieux)
100% di specificità; usata raramente per ricerca del
fungo nei tessuti
Sonde a DNA specifiche per la sequenza di rRNA 18S
e 28S di 5 microrganismi lievitiformi in sezioni di tessuti
inclusi in paraffina; specificità 100% sensibilità 83% <
di GMS (96%)
(Hayden et al. 2001)
Altre sonde con specificità per la specie, la varietà o il
sierotipo sono riportate in letteratura ma non sono
descritte le loro applicazioni in diagnostica
Metodi di biologia molecolare
Metodi basati su PCR con primer panfungini
primer per il frammento ERG11 del gene della
lanosterolo 14 -dimetilasi (citocromo P-450);
identificazione dell’amplificato con sonde specie-specifiche,
tecnica utilizzata per siero e CSF.
Sensibilità 20fg, equivalente a due cellule.
Primer omologhi a una sequenza del gene 28S
dell’rRNA, identificazione degli ampliconi mediante sonde
specie-specifiche per la regione variabile di questo gene,
utilizzato per campioni di sangue venoso. Sensibilità 2-10
cellule/ml di sangue
(Evertsson et al. 2000)
Primer panfungini per regione ITS, cattura
dell’amplificato con sonde specifiche e identificazione con
sequenziatore automatico, tecnica utilizzata per campioni
di tessuto.
(Hendolin et al. 2000)
Metodi di biologia molecolare
Metodi basati su PCR con Primer specie-specifici
PCR semplice
Primer CPL1 e CPR4 specifici per il gene di 18S rRNA
sensibilità di 1pg corrispondente a 5 cellule/ml di CSF
specificità 100%
(Prariychatigul et al. 1996)
Nested PCR
Primer ITS1 e CN-4 primo step
primer CN-5 e CN-6 secondo step
sensibilità 10 cellule/ml di CSF
specificità 100%
(Rappelli et al. 1998)
Posteraro et al. 2000
10
Metodi di biologia molecolare
Metodi basati su PCR con Primer specie-specifici
PCR semplice
Primer CN4 eCN5 specifici per i 4 sierotipi
Specificità 100%
Sensibilità 1 cellula/ml di CSF
Abbinata ad un metodo di estrazione rapido ed efficace
come quello con guanidina tiocianato può aumentare
l’efficienza diagnostica quando le tecniche convenzionali
risultano inadeguate
(Paschoal 2004)
Metodi di biologia molecolare
Vantaggi
Svantaggi
Elevata sensibilità
Stadio sperimentale
Elevata specificità
Costi elevati
Rappresenta molto
probabilmente il futuro
della diagnostica
Mancanza di metodi
standard riconosciuti a
livello internazionale
Metodi di biologia molecolare
scopi epidemiologici
PCR fingerprinting
Sequenze semplici ripetute (GACA)4 o parte
minisatellite fago M13
Dimensioni: > 10 nucleotidi
Originariamente usate come sonde per rilevare
sequenze ipervariabili e ripetute (minisatellite e
microsatellite) in vari campioni di DNA
Utilizzabili come singoli primers in reazioni PCR per
generare differenti profili elettroforetici
Temperatura di annealing 50°C
Metodi di biologia molecolare
scopi epidemiologici
sorgente di infezione
catena infettiva
riattivazione
reinfezione
Variabilità genomica
intraspecifica
Metodiche:
RAPD
PCR-fingerprintig
cariotipaggio
sequenziamento
………..
Dimostrata in:
P. carinii
C. albicans
C. neoformans
A. fumigatus
………...
Caratterizzazione intraspecifica
C.neoformans
Pini G. e coll - J. Micol. Méd. 1998
Amplificazione di tutti gli stipiti:
bande comprese fra 1976 e 435 pb
Presenza della banda A:
distingue il sierotipo A dal D
Bande A, D, F, N, O, P
identificano10 profili: 7 per il sierotipo A e 3
per il sierotipo B
Contributo epidemiologico
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Caratterizzazione intraspecifica C. neoformans
CONTRIBUTO EPIDEMIOLOGICO
Pini G. e coll - J. Micol. Méd. 1998 – Medical Mycology
2001
Profili identici di stipiti isolati contemporaneamente
dallo stesso paziente
Profili identici di stipiti isolati dallo stesso paziente
in tempi diversi: riattivazioine dell’infezione?
Profili diversi di stipiti isolati dallo stesso paziente
in tempi diversi: reinfezione ambientale?
Profili identici di stipiti isolati dal paziente e
dall’ambiente: catena epidemiologica !
Pini G. e coll - Medical Mycology 2001
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