sICAM-1 ELISA - IBL international

Istruzioni per l’Uso
sICAM-1 ELISA
Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa
di ICAM-1 umana solubile nei supernatanti di colture cellulari,
siero, plasma, liquido amniotico e urina da minzione spontanea e bile.
BE59011
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N
Flughafenstrasse 52a
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
A L
G M B H
[email protected]
www.IBL-International.com
sICAM-1 ELISA (BE59011)
ITALIANO
INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE
1.
USO PREVISTO
2
2.
SOMMARIO
2
3.
PRINCIPIO DEL TEST
4
4.
REAGENTI FORNITI
5
5.
ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE
6
6.
PRELIEVO DEI CAMPIONI
6
7.
MATERIAL NECESSARI MA NO FORNITI
6
8.
PRECAUZIONI PER L’USO
7
9.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
8
10. PROCEDURA DEL TEST
10
11. CALCOLO DEI RISULTATI
12
12. LIMITI DELLA PROCEDURA
14
13. PERFORMANCE
14
14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
17
15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI
18
16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST
19
17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
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1.
ITALIANO
Uso Previsto
Il sICAM-1 umana ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo
della sICAM-1 umana. Il sICAM-1 umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per
procedure terapeutiche.
2.
Sommario
La Molecola-1 di Adesione Intracellulare (ICAM-1) fa parte della superfamiglia delle molecole di adesione di
tipo immunoglobulinico ed è il ligando per l’Antigene 1 associato alla funzione linfocitaria (LFA-1), un
complesso alfa-beta che fa parte della famiglia dei recettori cellula-cellula e cellula-matrice delle integrine
dei leucociti. Questa famiglia è costituita dalla glicoproteina di adesione dei leucociti LFA-1, che media
l’adesione linfocitaria, dalla proteina MAC-1 che media l’adesione dei granulociti e dalla molecola p150,95.
L’ICAM-1 è una glicoproteina a singola catena con un core polipeptidico di 55 kD, che può essere espressa
su cellule non-ematopoietiche di molti lineaggi, come cellule endoteliali vascolari, cellule epiteliali timiche,
altre cellule epiteliali e fibroblasti e cellule ematopoietiche come macrofagi tissutali, T-linfoblasti stimolati con
mitogeni, cellule B dei centri germinali e cellule dendritiche nelle tonsille, linfonodi e placche di Peyer.
L’ICAM-1 è inducibile nei fibroblasti e nelle cellule endoteliali tramite mediatori infiammatori come IL-1, TNF
ed IFNγ entro poche ore ed è correlato all’infiltrazione di linfociti nelle lesioni infiammatorie. L’ICAM-1
sembra essere il marcatore iniziale di reazioni infiammatorie ed è espresso prima e in misura maggiore
rispetto all’HLA-DR.
Il ruolo dell’ICAM-1 quale marcatore di patologie è stato dimostrato in varie indicazioni e situazioni
patologiche diverse.
L’up-regulation dell’ICAM-1 nelle infiammazioni allergiche delle vie aeree è responsabile del reclutamento
di leucociti attivati e della patogenesi della rinite allergica.
Nella dermatite allergica da contatto l’ICAM-1 sui cheratinociti è stato indotto già 4 ore dopo l’applicazione
del patch test allergico.
Nel cancro della vescica esiste una correlazione diretta tra l’espressione costitutiva dell’ICAM-1 ed il grado
istopatologico del tumore. I sieri dei pazienti malati di cancro GI con metastasi epatica presentano livelli di
sICAM-1 decisamente più elevati rispetto ai pazienti senza metastasi. L’ICAM-1 è espresso sulle cellule
maligne nel caso di patologie mieloidi e patologie linfoidi maligne di tipo B. Nella malattie
linfoproliferative l’ICAM-1 è correlate al grado di malignità. Nella mielopatia associata all’HTLV-1 e nella
leucemia delle cellule T degli adulti, I livelli di siero sICAM-1 sono elevati.
I pazienti con melanoma maligno hanno livelli di sICAM-1 nel siero molto elevati, il che è rilevante a scopo
diagnostico.
Concentrazioni molto alte di sICAM-1 sono state rilevate negli individui infettati da HIV-1.
Nella malaria tropicale l’ICAM-1 favorisce l’adesione degli eritrociti infetti alle cellule endoteliali dei vasi
capillari; quest’evento è rilevante nella patogenesi della malaria cerebrale.
Il sICAM-1 è un buon parametro prognostico per valutare la responsività dell’infezione da epatite B alla
terapia IFNγ.
L’ICAM-1 sembra fornire il meccanismo fondamentale di rigetto dell’allotrapianto corneale.
L’espressione dell’ICAM-1 aumenta anche durante la fase di rigetto sulle cellule endoteliali dei vasi capillari,
sulla membrana miocardica e l’endocardio del cuore trapiantato.
I livelli sICAM-1 nel siero risultano significativamente aumentati con rigetto acuto di trapianto renale. La
misurazione del sICAM-1 è utile per distinguere il rigetto dall’intossicazione del rene trapiantato da
Ciclosporina-A.
Un’espressione forte dell’ICAM-1 è visibile anche in pazienti con rigetto acuto, contrariamente a pazienti con
trapianti di fegato stabili o pazienti senza complicazioni di rigetto.
Si è rilevato che i livelli di ICAM-1 circolante nel siero and L-selectina erano elevati nel diabetes mellitus
insulinodipendente (IDDM) e nei soggetti a rischio di IDDM.
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Un aumento significativo di ICAM-1 nel siero è stato dimostrato nell’uveite anteriore, nell’uveite media e nei
pazienti con sarcoidosi. Nelle prime 12-24 ore di monitoraggio dell’infarto miocardico acuto si misura un
calo del sICAM-1. Questo può attribuire al sICAM-1 un significato dal punto di vista prognostico anche per
l’ischemia miocardica e la riperfusione.
L’incrementata espressione glomerulare dell’ICAM-1 si vede in casi precoci di varie forme di
glomerulonefrite e l’espressione tubolare de novo dell’ICAM-1 presenta una forte correlazione con l’attività
della patologia.
Nell’asma l’ICAM-1 è up-regolato sull’epitelio delle vie aeree infiammate e sull’endotelio bronchiale,
mediando in questo modo l’adesione degli eosinofili. Il sICAM-1 è molto elevato nel siero con fibrosi
polmonare idiopatica o sarcoidosi. Il sICAM-1 è un marker affidabile per i processi infiammatori
nell’ambito del sistema nervoso centrale che sono associati al sangue: Disordini della barriera CSF.
L’ICAM-1 solubile non è rilevabile nella maggior parte di campioni di fluido amniotico del secondo trimestre
di gravidanza, ma quando è presente, è significativamente correlato ad un ritardo della crescita
intrauterina e ad elevati livelli di alfa fetoproteina nel siero materno nel corso del secondo trimestre. Livelli
elevati di sICAM-1 sono correlati all’attività dell’artrite reumatoide.
Nella psoriasi l’ICAM-1 sui cheratinociti mostra una forte correlazione con la gravità della patologia e
diminuisce sotto l’effetto di una terapia mirata. Prima del trattamento i livelli di sICAM-1 sono molto elevati
se paragonati a controlli in buono stato di salute.
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Principio del Test
Figura 1
Un anticorpo di rivestimento sICAM-1 anti-umana viene fatto
assorbire dai micropozzetti.
Micropozzetto rivestito
Anticorpo di rivestimento
Figura 2
Prima Incubazione
La sICAM-1 umana presente nel campione o nello standard si
lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti e vi viene aggiunto
l’anticorpo sICAM-1 anti-umana coniugato con l’HRP, che si lega
alla sICAM-1 umana catturata dal primo anticorpo.
Standard o Campione
Coniugato HRP
Figura 3
Dopo l’incubazione, la sICAM-1 anti-umana coniugato all’HRP e
non legato viene rimosso con una fase di lavaggio e ai pozzetti
viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all’HRP.
Seconda Incubazione
Substrato
Figura 4
In proporzione alla quantità di sICAM-1 umana presente nel
campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La
reazione viene terminata aggiungendo l’acido e l’assorbanza si
misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 5
diluizioni standard di sICAM-1 umana e si determina la
concentrazione della sICAM-1 umana.
Substrato post-reazione
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4.
Reagenti Forniti
1
busta d’alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale sICAM-1 umana
1
flaconcino (100 µL) di anticorpo HRP-Coniugato (anticorpo monoclonale sICAM-1 umana)
2
flaconcini (500 µL) Standard sICAM-1 umana, 100 ng/mL
1
flaconcino di Controllo basso, liofilizzato
1
flaconcino di Controllo alto, liofilizzato
1
flaconcino (12 mL) con Diluente dei Campioni
1
flaconcino (5 mL) con Tampone di Dosaggio Concentrato 20x
(PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA)
1
bottiglia (50 mL) con Tampone di Lavaggio Concentrato 20x
(PBS con 1 % Tween 20)
1
flaconcino (15 mL) di Soluzione di Substrato (tetrametilbenzidina)
1
flaconcino (15 mL) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M)
2
Copripiastra Adesivi
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5.
ITALIANO
Istruzioni di Conservazione
Conservare i reagenti del kit a 2-8 °C eccetto i controlli. Conservare i controlli liofilizatti a -20 °C. Subito
dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 °C e i controlli a -20 °C. La scadenza del kit e
dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo
se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato
contaminato durante la prima manipolazione.
6.
Prelievo dei Campioni
Con questo dosaggio sono stati testati il supernatante delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA,
citrato, eparina), il liquido amniotico, urina da minzione spontanea e bile.
Per questo dosaggio potrebbero essere idonei anche altri campioni biologici. Rimuovere il siero o il plasma
dal coagulo o dalle celle prima possibile dopo la coagulazione e la separazione.
Fare attenzione ad un possibile “Effetto Gancio” dovuto ad alte concentrazioni nei campioni (vedi
capitolo 11).
I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio.
Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici.
I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20°C, per evitare la perdita di sICAM-1 umana
bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra
2° ed 8°C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5).
Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelatodev’essere
portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela.
Per misurare lo sICAM-1 umana nell’urina da minzione spontanea usare campioni non diluiti.
I terreni di coltura cellulare senza componenti del siero non sono idonei alla determinazione dello sICAM-1
umana con ELISA.
7.
Material Necessari Ma No Forniti
- Pipette graduate 5 mL e 10 mL
- Micropipette adattabili da 5 µL a 1000 µL a canale singolo, con punte usa e getta
- Micropipette adattabili da 50 µL a 300 µL con punte usa e getta
- Serbatoio per micropipette multicanale
- Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti
- Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema
di lavaggio automatico)
- Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm
(opzionale: 620 nm lunghezza d’onda di riferimento)
- Acqua distillata o deionizatta
- Calcolatore statistico con programma che esegua l’analisi di regressione
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Precauzioni per l’Uso
-
Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò,
l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze
alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali.
Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi,
immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli.
-
I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico.
-
Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza.
-
Non usare i kit dopo la data di scadenza.
-
Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce.
-
Non pipettare utilizzando la bocca.
-
Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni.
-
Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose.
-
Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni.
-
Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo.
-
Evitare schizzi o produzione di aereosol.
-
Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che
invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso.
-
Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato.
-
L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato.
-
Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti.
-
La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo.
-
Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè
potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per
minimo 1 ora a 121.5 °C.
-
Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio
ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione.
Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido.
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Preparazione dei Reagenti
Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a
temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tampone presenta
cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli.
9.1. Tampone di Lavaggio (1x)
Versare l'intero contenuto (50 mL) del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato
pulito da 1000 mL. Portare il volume finale a 1000 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata.
Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 °C e 25 °C. Il
Tampone di Lavaggio è stabile per 30 giorni.
Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tavola seguente:
Numero di strisce
1-6
1 - 12
Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) (mL)
25
50
Acqua distillata (mL)
475
950
9.2. Tampone di Dosaggio (1x)
Versare l'intero contenuto (5 mL) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato
pulito da 100 mL. Portare il volume finale a 100 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata.
Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
Conservare a temperatura compresa fra 2 °C e 8 °C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni.
Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tavola seguente:
Numero di strisce
1-6
1 - 12
Tampone di Dosaggio
Concentrato (20x) (mL)
2.5
5.0
Acqua distillata (mL)
47.5
95.0
9.3. Coniugato-HRP
Il Coniugato-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione.
Il Coniugato-HRP deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita
secondo la tavola seguente:
Numero di strisce
1-6
1 - 12
24.11.14 (26)
Conuigato-HRP (mL)
0.03
0.06
Tampone di Dosaggio (1x) (mL)
2.97
5.94
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9.4. Standard sICAM-1 Umana
La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c) o oppure nei tubi (vedi
9.4.1).
9.4.1. Diluizione Esterna degli Standard
Etichettare 4 tubi, uno per ogni punto dello standard.
S2, S3, S4, S5
Preparare diluizione seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo:
Pipettare 225 µL Diluente dei Campioni nei tubi S2-S5.
Pipettare 225 uL di standard non diluito (serve come standard più alto S1, concentrazione dello standard 1
= 100 ng/mL) nel primo tubo, etichettato S2, e mescolare (concentrazione dello standard 2 = 50.0 ng/mL).
Ripetere le 3 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere Figura 5).
Diluente dei Campioni serve come bianco.
Figura 5
Transferire 225 µL
S2
Standard
sICAM-1 Umana
non diluito (S1, 500 µL)
S3
S4
Diluente dei Campioni
225 µL
S5
Buttare
225 µL
9.5. Controlli
Solubilizzare aggiungendo 100 µL di acqua distillata al controlli liofilizzati. Permettere al controlli di riposare
per 10-30 minuti. Agitare o mescolare delicatamente per assicurare una solubilizzazione completa ed
omogenea. In seguito considerare i controlli allo stesso modo dei campioni del dosaggio. Per il range dei
valori del controllo si rimanda al certificato di analysis o all'etichetta presente sulla fiala. Conservare i
controlli ricostituiti in aliquote a -20 °C. Evitare ripetuti cicli di scongelamento.
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Procedura del Test
a.
Stabilire il numero di strisce dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di
campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e i campioni
di controllo opzionali devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip
micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante,
mantenendole a 2-8 °C e perfettamente sigillate.
b.
Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µL di Tampone di Lavaggio per
pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere
al Soluzione Tampone di Lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa 10-15 secondi prima
dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare
le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in
eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida
per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti.
c.
Diluizione dello Standard in micropozetti
(Alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi – vedi 9.4.1)
Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato a pozzetti standard B1/2-E1/2, lasciando
A1/A2 vuoti. Pipettare 200 µL standard non diluito (vedi preparazione dello standard 4.4.1,
concentrazione dello standard 1, S1 = 100 ng/mL) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1).
Trasferire 100 µL ai pozzetti B1 e B2 (concentrazione dello standard 2, S2 = 50 ng/mL). Mescolare il
contenuto dei pozzetti B1 e B2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni e trasferire 100 µL,
rispettivamente, nei pozzetti C1 e C2 (vedere Figura 6). Fare attenzione a non graffiare la parte
interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 2 volte, creando due colonne di standard in
diluizione con concentrazione da 100.0 a 6.3 ng/mL. Buttare 100 µL del contenuto degli ultimi
pozzetti (E1 e E2).
Figura 6
Transferire 100 µL
S1
Standard
sICAM-1 Umana
non diluito
(= S1, 200 µL)
24.11.14 (26)
S2
S3
Diluente dei Campioni
100 µL
S4
S5
Buttare
100 µL
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In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.4.1) pipettare 100 µL di queste diluizioni standard
(S1-S5) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1.
Tavola 1
Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti:
1
2
Standard 1
(100.0 ng/mL)
Standard 2
(50.0 ng/mL)
Standard 3
(25.0 ng/mL)
Standard 4
(12.5 ng/mL)
Standard 5
(6.3 ng/mL)
Standard 1
(100.0 ng/mL)
Standard 2
(50.0 ng/mL)
Standard 3
(25.0 ng/mL)
Standard 4
(12.5 ng/mL)
Standard 5
(6.3 ng/mL)
F
Bianco
G
H
A
B
C
D
E
3
4
Campione 2
Campione 2
Campione 3
Campione 3
Campione 4
Campione 4
Campione 5
Campione 5
Campione 6
Campione 6
Bianco
Campione 8
Campione 8
Campione 1
Campione 1
Campione 9
Campione 9
Campione 2
Campione 2
Campione 10
Campione 10
d.
Dispensare 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco.
e.
Dispensare 90 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni.
f.
Dispensare 10 µL di campione in duplicato ai pozzetti dei campioni.
g.
Preparare la Coniugato-HRP (consultare la sezione Coniugato-HRP 9.3 sulla Preparazione dei
Reagenti).
h.
Dispensare 50 µL di Coniugato-HRP a ciascun pozzetto.
i.
Coprire con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora utilizzando, se
disponibile, un vortex a 400 rpm.
j.
Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce dei pozzetti 3 volte come descritto in
punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo.
k.
Pipettare 100 µL di Soluzione Substrato TMB in tutti i pozzetti, inclusi quelli del bianco.
l
Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 °C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione
diretta a luci intense.
È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del
substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di
essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo
del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro.
Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più elevato ha sviluppato un
colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA
a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore
delle D.O. di 0.9 - 0.95.
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m.
Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µL di Soluzione Bloccante in
ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda
rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I
risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora
se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 °C.
n.
Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come
lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da
610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del
produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli
standard di sICAM-1 umana.
Annotazione: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno
essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi.
11.
Calcolo dei Risultati
-
Calcolare i valori medi dell’assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati
devono rientrare nel 20 % del valore medio.
-
Creare una curva standard segnando l’assorbanza media di ogni concentrazione standard
sull’ordinata contro la concentrazione di sICAM-1 umana sull’ascissa. Disegnare una curva di best-fit
congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri).
-
Per determinare la concentrazione di sICAM-1 umana circolante per ogni campione, trovare prima il
valore medio di assorbanza sull’ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard.
Nel punto d’intersezione estendere una linea verticale fino all’ascissa e leggere il valore
corrispondente della concentrazione di sICAM-1 umana.
-
Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in
proporzione 1:10 (10 µL di campione + 90 µL di Diluente dei Campioni), la concentrazione
letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 10).
-
Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per
risultato livelli scorretti e bassi di sICAM-1 umana (Efetto Gancio). Questi campioni
richiedono un’ulteriore pre-diluizione esterna, secondo i valori stimati della sICAM-1 umana,
con un Diluente per Campioni, in modo da quantificare con precisione i livelli reali di sICAM-1
umana.
-
Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione
di sICAM-1 umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i
valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non
essere validi.
-
La Figura 7 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per
dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strip
per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.
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sICAM-1 ELISA (BE59011)
ITALIANO
Figura 7
Curva standard rappresentativa per il sICAM-1 umana ELISA. La sICAM-1 umana è stato diluito in 2 fasi
seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard
dev’essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.
sICAM-1 ELISA
OD (450 nm)
10
1
0.1
0.01
1
10
100
ng/m L
Tavola 2
Dati tipi del sICAM-1 umana ELISA
Lunghezza d’onda: 450 nm
Lunghezza d’onda di riferimento: 620 nm
1
Conzentrazione
sICAM-1 Umana
(ng/mL)
100.00
2
50.00
3
25.0
4
12.5
5
6.3
Bianco
0
Standard
D.O.
(450 nm)
D.O. Media
(450 nm)
C.V.
(%)
1.737
1.806
1.114
1.087
0.570
0.546
0.247
0.235
0.110
0.100
0.004
0.006
1.772
2.8
1.101
1.7
0.558
3.0
0.241
3.5
0.105
6.7
0.005
20.0
I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad
es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può
influenzare l’attività enzimatica e quindi l’intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi.
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sICAM-1 ELISA (BE59011)
12.
ITALIANO
Limiti della Procedura
-
Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva
standard per ogni esecuzione del test.
-
La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione
crociata tra reagenti può casusare risultati erronei.
-
Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili
devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell’uso.
-
Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi
negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la soluzione di lavaggiofresca, riempire con
il tampone di lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non
permettere che si asciughino per periodi prolungati.
-
L’uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi
umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali
murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle
immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le
immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono
aggiunti al campione.
13.
Performance
13.1. Sensibilità
Il limite di rilevamento della sICAM-1 umana definito come la concentrazione dell’analita, risultante in
un’assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni
standard), è stato determinato di 2.2 ng/mL (media di 6 dosaggi indipendenti).
13.2. Recupero
13.2.1. Intra-Dosaggio
La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 2 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è
stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sICAM-1 umana.
Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione
media di sICAM-1 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente
complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 4.1 %.
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sICAM-1 ELISA (BE59011)
ITALIANO
Tavola 3
La concentrazione media di sICAM-1 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione.
Campione
Esperimento
1
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
2
3
4
5
6
7
8
Concentrazione Media
sICAM-1 umana (ng/mL)
330.1
385.3
169.4
187.3
518.9
560.1
939.7
1054.0
378.2
404.1
318.3
349.4
213.5
231.3
149.6
164.8
CV (%)
7.8
2.4
4.1
3.4
7.2
6.8
7.1
2.2
2.5
4.2
2.1
2.3
2.7
3.3
3.4
4.4
13.2.2. Inter-Dosaggio
La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell’ambito di un laboratorio è stata valutata in 2 esperimenti
indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse
concentrazioni di sICAM-1 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di
seguito illustrano la concentrazione media di sICAM-1 umana ed il coefficiente di variazione calcolato su 18
determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo
calcolato era del 7.7 %.
Tavola 4
La concentrazione media di sICAM-1 umana ed il coefficiente di variazione di ogni campione
Campione
1
2
3
4
5
6
7
8
Concentrazione Media
sICAM-1 umana (ng/mL)
376.3
184.6
529.1
934.7
363.2
323.4
217.7
154.2
CV (%)
11.1
7.2
5.1
8.2
9.6
7.5
5.8
6.8
13.3. Test di Recupero
Il test di recupero è stato valutato addizionando 4 livelli di sICAM-1 umana al Diluente dei Campioni (matrice
del siero). I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. Il
recupero rientrava in un range dal 82 % al 109 % con un recupero medio complessivo dell’99 %.
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sICAM-1 ELISA (BE59011)
ITALIANO
13.4. Parallelismo di Diluizione
4 campioni di siero con diversi livelli di sICAM-1 umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e
con 4 replicati l’uno.
Il recupero rientrava in un range dal 80 % al 102 % con un recupero medio complessivo del 93 % (vedi
Tavola 5).
Tavola 5
Campione
1
2
3
4
Diluzione
1:10
1:20
1:40
1:80
1:10
1:20
1:40
1:80
1:10
1:20
1:40
1:80
1:10
1:20
1:40
1:80
Concentrazione
attesa di sICAM-1
Umana (ng/mL)
-184
92
46
-82
41
21
-265
133
66
-301
151
75
Concentrazione
misurata di sICAM-1
Umana (ng/mL)
368
148
82
46
163
76
40
17
530
238
125
67
602
296
135
74
Recupero di
concentrazione attesa
di sICAM-1 Umana (%)
-80
89
100
-93
98
85
-90
94
102
-98
89
99
13.5. Stabilità dei Campioni
13.5.1. Stabilità di Congelamento - Sgelo
Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 °C e scongelate 5
volte e sono stati determinati i livelli di sICAM-1 umana. Con il congelamento e lo scongelamento non si è
rilevata una perdita significativa di immunoreattività della sICAM-1 umana.
13.5.2. Stabilità di Conservazione
Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 °C, 2-8 °C, a
temperatura ambiente (TA) ed a 37 °C e il livello di sICAM-1 umana ne è stato determinato dopo 24, 48 e 96
ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di
immunoreattività della sICAM-1 umana.
13.6. Comparazione di Siero e Plasma
Di tre individui sono stati valutati il siero e l’EDTA, il citrato ed il plasma eparinato ottenuti nello stesso
momento temporale. I livelli di sICAM-1 umana non erano molto diversi e quindi tutte queste preparazioni
del sangue sono idonee alle determinazioni dello sICAM-1 umana.
13.7. Specificità
L’interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in
concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero sICAM-1 umana positivo. Non si è constatata alcuna
reattività crociata con sTNF-R (60 kDa), sTNF-R (80 kDa), IL-8/NAP-1, TNFα, TNFβ, IFNγ, IFNα2C, IFNω,
IL-6, IL-2R, ELAM-1 e L-selectina.
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sICAM-1 ELISA (BE59011)
ITALIANO
13.8. Valori Attesi
Per lo sICAM-1 umana è stato testato un pannello di 40 campioni di siero, EDTA, citrato e plasma eparinato
di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). Per i livelli di
sICAM-1 umana misurati vedi la Tavola 6.
Tavola 6
Matrice di
Campione
Siero
Plasma
(EDTA)
Plasma
(Citrato)
Plasma
(Eparina)
14.
Numero di Campioni
Valutati
40
Intervallo
(ng/mL)
302-1115
Media
(ng/mL)
504
Deviazione Standard
(ng/mL)
171
40
249-966
543
168
40
59-529
305
103
40
133-623
385
122
Informazioni per gli Ordini
Per gli ordini, si prega di contattare:
Vedi ultima pagina.
Per informazioni tecniche si prega di contattare:
e-mail: [email protected]
www.IBL-International.com
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15.
ITALIANO
Sommario di Preparazione dei Reagenti
15.1. Tampone di Lavaggio (1x)
Agguingere 50 mL del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) a 950 mL di acqua distillata.
Numero
di strisce
1-6
1-12
Tampone di Lavaggio
Concentrato (mL)
25
50
Acqua
Distillata (mL)
475
950
15.2. Tampone di Dosaggio (1x)
Agguingere 5 mL di Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) a 95 mL de acqua distillata.
Numero
di strisce
1-6
1-12
Tampone di Dosaggio
Concentrato (mL)
2.5
5.0
Acqua
Distillata (mL)
47.5
95.0
15.3. Coniugato-HRP
Fare una diluzione 1:100 di Coniugato-HRP nel Tampone di Dosaggio Concentrato (1x):
Numero
di strisce
1-6
1-12
Coniugato-HRP
(mL)
0.03
0.06
Tampone di Dosaggio (1x)
(mL)
2.97
5.94
15.4. Controlli
Agguingere 100 µL di acqua distillata al controlli liofilizzati.
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ITALIANO
Sommario di Procedura del Test
1.
Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesti.
2.
Lavare due volte le strisce micropozzetti con Tampone di Lavaggio.
3.
Diluizione dello standard in micropozetti: Agguingere 100 µL di Diluente dei Campioni, in duplicati
a tutti pozetti standard lasciando gli primi pozzetti vuoti. Pipettare 200 µL standard non diluito nei
primi pozzetti e creare diluzioni standard da transferire 100 µL da pozzetto per pozzetto.
Buttare 100 µL degli ultimi pozzetti.
Alternativamente diluizione standard esterna in tubi (vedi 9.4.1): Pipettare 100 µL di questi diluizioni
standard nei strisce degli micropozzettil.
4.
Agguingere 100 µL di Diluente dei Campioni, in duplicati, nei pozzetti bianchi.
5.
Agguingere 90 µL di Diluente dei Campioni nei pozzetti di campioni.
6.
Agguingere 10 µL dei campioni in duplicati nei pozzetti di campioni.
7.
Preparare il Coniugato-HRP.
8.
Agguingere 50 µL di Coniugato-HRP a tutti gli pozzetti.
9.
Coprire i pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-25 °C).
10.
Svuotare e lavare gli pozzetti 3 volte con Tampone di Lavaggio.
11.
Agguingere 100 µL della Soluzione Substrato TMB a tutti gli pozzetti.
12.
Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 °C) per circa 10 minutos.
13.
Agguingere 100 µL della Soluzione Bloccante a tutti gli pozzetti.
14.
Azzerare il spettofotomettro e leggere l’assorbanza a 450 nm.
Annotazione: Se le istruzioni in questo protocollo sono stati seguiti, i campioni sono stati diluiti 1:10
(10 µL di campione, 90 µL di Diluente dei Campioni), la concentrazione dalla curva standard
risultante deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 10).
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17.
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Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
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