metodi biochimici esercizi d`esame 2002 – 2006

METODI BIOCHIMICI
ESERCIZI D’ESAME 2002 – 2006
(by NewSgrunt)
A) SPETTROSCOPIA UV/vis, LAMBERT-BEER, STUDIO DELLE PROTEINE
1A) Il Citocromo c è caratterizzato dai seguenti coefficienti di estinzione molare:
ε280 = 28500 mol-1cm.1
ε415 = 96300 mol-1cm-1
Una soluzione di citocromo c in una cuvetta da 1 ml assorbe
A280 = 0.17
A415 = 0.4
- Calcolare la concentrazione della proteina.
- Perché i valori ottenuti utilizzando i 2 coefficienti non sono uguali?
- Se il Citocromo c pesa 12300 Da, quanti mg sono presenti in 1ml?
2A) Trovare la concentrazione di NAD+ e NADH in una soluzione miscelata basandosi sui
seguenti dati ottenuti in una cuvetta da 1 cm. I coefficienti di estinzione molare a 260 nm
sono 1.5 x 104 mol-1dm3cm-1per il NADH e 1.84 x 104 mol-1dm3cm-1 per il NAD+. A 340 nm solo il
NADH assorbe con ε di 6.22 x 103 mol-1dm3cm-1. La soluzione miscelata da assorbanze di 1.36 e
0,382 a 260 e 340 nm, rispettivamente.
3A) Il coefficiente di estinzione molare a 420 nm dell'enzima catalasi isolato da Aspergillus niger è
pari a 150mM-1cm-1. Sapendo che il peso molecolare della proteina è pari a 385000 Da, calcolare
quanti mg di proteina sono presenti in una soluzione la cui assorbanza a 420 nm è pari a 1,5 in una
cuvetta con un cammino ottico di 0.5 cm.
4A) Il coefficiente di estinzione molare a 420 nm dell'enzima catalasi isolato da Aspergillus niger è
pari a 150mM-1cm-1. Qual’è la concentrazione molare di una soluzione dell'enzima la cui
assorbanza a 420 nm è pari a 1.8 una cuvetta con un cammino ottico di 1 cm?
Sapendo che il peso molecolare della proteina è pari a 385000 Da, calcolare quanti mg/ml di
proteina sono presenti in soluzione?
5A) Quale di questi residui aminoacidici fornisce più importante contributo all'assorbimento delle
proteine a 280 nm?
- Prolina
- Fenilalanina
- Lisina
- Metionina
Spiegare quali caratteristiche chimiche di questo aminoacido spiegano la sua capacità di interagire
con la luce ultravioletta?
6A) Determinare la concentrazione di una proteina che, analizzata in una cuvetta con un cammino
ottico pari a 0.5 cm, assorbe 0,54 a 280 nm, sapendo che il suo ε280 è pari a 2x105, quanti mg di
proteina sono presenti in 1 ml se la proteina pesa 32 kDa?
7A) Se una soluzione contenente ATP in una cuvetta da 1 cm ha un'assorbanza di 0.45 e un
coefficiente di estinzione molare 1.54x104 mol-1cm-1, determinare:
- La concentrazione della soluzione di ATP
- L'assorbanza di una soluzione di ATP 2.5x10-2 M in una cuvetta da 0,5 cm
1
8A) Per ciascuna coppia di lunghezze d'onda elencate di seguito, specificare quale è ad energia più
alta e spiegare la ragione della risposta:
(a) 280 nm (UV); 360 nm (VIS)
(b) 200000 nm (microonda); 800 nm (VIS)
9A) Determinare la concentrazione di una proteina che, analizzata in una cuvetta con un cammino
ottico pari a 0.5 cm, assorbe 0,84 a 280nm, sapendo che il suo ε280 è pari a 2x103.
Quanti mg di proteina sono presenti in 1 ml se la proteina pesa 32 kDa?
10A) Sulla base dei seguenti dati sperimentali, ottenuti in un saggio con il metodo di Lowry,
calcolare il valore della concentrazione (in mg/ml) del campione X.
Assorbanza
BSA 1mg/ml
Campione X
diluito 1:8
5 μL
0.175
10μL
0.072
0.370
20μL
0.143
40μL
0.268
60μL
0.395
11A) (2007) Il coefficiente di estinzione molare a 280nm di una proteina X è pari a 15400 M-1cm-1
in una cuvetta da 1cm. Calcolare:
- L’assorbanza a 280nm di una soluzione 0.5M.
- Dato che gli spettrofotometri convenzionali danno risultati significativi con assorbanze che vanno
da 0 a 2, quanto diluireste la proteina perché si abbia un valore accettabile?
- Se la proteina pesa 13400Da quanti mg sono presenti in 1 ml di una soluzione che assorbe 0.74 a
280nm?
B) DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA PROTEICA
1B) Supponete di analizzare tramite SDS-PAGE una proteina purificata all’omogeneità, il cui peso
molecolare determinato per gel-filtrazione è pari a 62000 Da. L'analisi elettroforetica, dopo
denaturazione del campione in assenza di agenti riducenti, evidenzia la presenza di due bande del
peso molecolare pari a circa 30000 e 15000 Da, rispettivamente Lo stesso campione analizzato
dopo denaturazione in presenza di ditiotritolo evidenzia una singola banda di peso pari a circa
15000 Da.
- Quale potrebbe essere la struttura quaternaria della proteina e come potrebbero unite tra loro le
diverse subunità?
- Quale tecnica alternativa utilizzereste per calcolare il peso molecolare assoluto della proteina ?
2B) Supponete di analizzare tramite SDS-PAGE una proteina purificata all'omogeneità. L'analisi
elettroforetica dopo denaturazione del campione in assenza di agenti riducenti, evidenzia la
presenza di una singola banda del peso molecolare pari a circa 120000 Da. Lo stesso campione
analizzato dopo denaturazione in presenza di ditiotritolo evidenzia due bande di peso pari a circa
36000 e 12000 Da, rispettivamente.
- Quale potrebbe essere la struttura quaternaria della proteina e come potrebbero essere unite tra
loro le diverse subunità?
- Il peso molecolare di questa stessa proteina determinato tramite gel filtrazione è pari a circa
180000 Da. Come potreste spiegare questa discrepanza?
3B) Spiegare la funzione di ciascuno dei seguenti composti chimici usati nell’elettroforesi su gel
delle proteine:
- Acrilammide
- Temed
2
- Blue coomassie
4B) Spiegare la funzione di ciascuno dei seguenti composti chimici usati nell'elettroforesi
denaturante su gel delle proteine:
- Metylen-bis-acrilammide
- Sodio dodecil solfato
- Blue di bromofenolo
5B) Supponete di analizzare tramite SDS-PAGE una proteina altamente purificata il cui peso
molecolare determinato tramite gel filtrazione sia pari a circa 85000 Dalton. L’analisi
elettroforetica, dopo denaturazione del campione in presenza di ditiotritolo, evidenzia la presenza
di due catene polipeptidiche di massa molecolare pari a circa 30000 e 13000 Da, rispettivamente.
Lo stesso campione analizzato in seguito a denaturazione in assenza di agenti riducenti evidenzia
due bande di peso pari a circa 30000 e 26000 Da, rispettivamente.
- Quale potrebbe essere la struttura quaternaria della proteina e come sono unite tra loro le diverse
subunità?
6B) Schematizzare un esperimento per determinare se un enzima purificato è monomerico o
composto da subunità, ed eventualmente se è composto da subunità uguali o diverse.
7B) Da quale dei seguenti fattori è influenzata la velocità di migrazione di una molecola in un gel di
poliacrilammide denaturante (SDS-PAGE)?.
- coefficiente frizionale
- peso molecolare
- forma della molecola
- campo elettrico applicato
- presenza di agenti riducenti
- forza ionica del tampone
- punto isoelettrico
8B) Quali frammenti vengono prodotti dal trattamento con bromuro di cianogeno (CNBr) del
seguente peptide: Val-Lys-Glu-Met-Ser-Trp-Arg-Ala
- Val-Lys + Glu-Met-Ser-Trp-Arg-Ala
- Val-Lys-Glu-Met-Ser-Trp + Arg-Ala
- Val-Lys-Glu-Met + Ser-Trp-Arg-Ala
- Val-Lys-Glu + Met-Ser-Trp-Arg-Ala
- Val-Lys-Glu-Met-Ser + Trp-Arg-Ala
C) METODI CROMATOGRAFICI
1C) La carica di una resina scambiatrice cationica è:
- Positiva
- Negativa
- Neutra
Sapendo che gli analizzatori automatici di aminoacidi sono strumenti che separano
automaticamente gli amino acidi tramite, cromatografia per scambio cationico, predire l'ordine di
eluizione (dal primo all'ultimo) per i seguenti aminoacidi a pH 4.0:
Glicina, Acido aspartico, Istidina
3
2C) Spiegare il principio della cromatografia per interazione idrofobica. In che modo viene
comunemente favorito il legame delle proteine solubili alle resine utilizzate in questo tipo di
cromatografia?
3C) Definite il concetto di coefficiente di ripartizione in cromatografia
4C) Quale/i delle seguenti tecniche si potrebbero utilizzare per purificare le proteine contenute nella
seguente miscela :
Mioglobina di cavallo (PM 16.9 kD; pI 7.0) + Citocromo c (PM 11.7 kD; pI 10.6) + Albumina (PM
68 kD; pI 4.9)
- Colorazione secondo il metodo di Lowry
- SDS-PAGE + colorazione secondo Coomasie
- Isoelectrofocusing
- Cromatografia in scambio ionico
- Cromatografia in gel filtrazione
- Immunoprecipitazione
Spiegare perchè e quale tecnica ha maggiore probabilità di successo.
5C) Determinare il peso molecolare approssimativo di una proteina che eluisce da una colonna
cromatografica per gel filtrazione (eluita a flusso costante) con tempo di ritenzione tR = 40 min,
sulla base dei seguenti dati sperimentali su proteine utilizzate come standard:
PM proteina (D)
78000
54000
37000
20000
13000
tR (min)
10
22
36
45
60
6C) Quali tecniche si potrebbero utilizzare per purificare le 3 proteine (di cui è riportata la
composizione aminoacilica) contenute nella seguente miscela:
1) Ala 10%, Gly 20%, Asp 20%, Glu 15%, Pro 5%, Ser 20 %, Cys 10%
2) Ala 30%, Gly 20%, Asn 5%, Glu 20%, Ser 10 %, Val 10%, Thr 5%
3) Ala 20%, His 10%, Lys 10%, Ser 10%, Vai 10%, Thr 5%, Arg 10%.
Non disponendo di anticorpi contro la proteina 3?
Spiegare perchè e quale tecnica ha maggiore probabilità di successo.
7C) (2007) Una proteina eluisce da una colonna cromatografica per gel filtrazione (eluita a flusso
costante), viene usato un Tampone generico (pH 8.0, TRIS) ed ha VR di 24 min. La stessa proteina
eluita allo stesso modo ma con un tampone contenente NaCl 0.3 M ha un VR di 41 min. Non sono
rilevate variazioni nella forza ionica. Sulla base dei seguenti dati sperimentali su proteine utilizzate
come standard
PM proteina (D)
78000
54000
37000
20000
13000
VR (min)
10
22
36
45
60
(a) Calcolare i PM ai VR rispettivi
(b) Spiegare la differenza di eluizione dalla colonna.
4
D) TECNICHE CENTRIFUGATIVE
1D) Spiegare il principio della centrifugazione in gradiente di densità ed illustrare alcune delle sue
applicazioni nella ricerca biochimica.
2D) Descrivere brevemente l'utilizzo di tecniche centrifugative per la concentrazione di soluzioni
proteiche
E) METODI CHE UTILIZZANO ANTICORPI
1E) Spiegare brevemente il principio del dosaggio ELISA
2E) Descrivere brevemente una tecnica immunochimica utilizzabile per la localizzazione di un
antigene in un tessuto
3E) Spiegare brevemente il metodo che si utilizza per generare anticorpi monoclonali
4E) Descrivete brevemente il principio del Radio Immuno Assay (RIA)
5E) (2007) Descrivere brevemente il principio del Western blotting
F) PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI
1F) Quale(i) di queste affermazioni è corretta?
- Le proteine prodotte in E.coli non possiedono legami disolfuro;
- Le proteine prodotte in E.coli non possiedono modificazioni glucidiche;
- Le proteine di mammifero devono essere espresse necessariamente in cellule in coltura perché nei
batteri non riescono ad avvolgersi nella loro conformazione tridimensionale corretta:
- Produrre proteine di mammifero in E.coli è conveniente perché ci sono meno proteasi:
- La produzione di proteine da organismi superiori in E.coli può essere complicata da un diverso
uso del codice genetico.
2F) Produrre una proteina come fusione con un'altra sequenza aminoacidica può essere utile per:
- Ottenere la proteina nella conformazione corretta
- Facilitare la purificazione della proteine ricombinante
- Indirizzare la proteina nel periplasma batterico
- Stabilizzare proteine di basso peso molecolare altrimenti degradate nei batteri
- Rendere possibile la formazione di legami disolfuro in un ambiente riducente
3F) Indicate schematicamente un protocollo da seguire per produrre una proteina ricombinante in
E.coli a partire dall’RNA messaggero per tale proteina
4F) A cosa serve il gene per la resistenza ad un antibiotico in un vettore di clonaggio ?
(Spiegare brevemente la risposta):
- Permette al vettore di replicarsi
- E’ un marcatore di selezione
- Consente la crescita dei batteri
5F) Disegnate in modo schematico la mappa di un plasmide per l'espressione di una proteina
periplasmatica in E. coli. Quali elementi deve contenere ? In che ordine ?
5
6F) Per quale di queste ragioni può essere conveniente produrre una proteina ricombinante nel
periplasma piuttosto che nel citoplasma di E.coli?
- la produzione della proteina è sempre più abbondante
- nel periplasma le proteine non aggregano formando i corpi di inclusione
- il periplasma è un ambiente ossidante che favorisce la formazione di legami disolfuro
- nel periplasma non ci sono proteasi
- il numero di proteine presenti nel periplasma è basso, rendendo quindi più facile la
purificazione della proteina d’interesse
G) PURIFICAZIONE, CONCENTRAZIONE, CARATTERIZZAZIONE DELLE
PROTEINE
1G) Spiegare il principio della purificazione frazionata delle proteine con solfato d'ammonio. Per.
quale motivo la precipitazione frazionata con sali viene generalmente utilizzata nelle prime fasi
della purificazione delle proteine?
2G) Spiegare brevemente il principio su cui si basa la spettrometria di massa
3G) Le tecniche di spettroscopia ESR consentono:
- Di identificare metalli presenti nella proteina
- Misurare l'attività catalitica delle proteine
- Di identificare il tipo di strutture secondarie presenti nelle proteine
- Identificare protoni che interagiscono tra di loro
- Misurare la produzione di radicali liberi
H) ANALISI DELLA STRUTTURA 3D DELLE PROTEINE
1H) Le tecniche NMR di tipo bidimensionale consentono:
- Di identificare metalli presenti nella proteina
- Misurare l'attività catalitica delle proteine
- Di identificare il tipo di strutture secondarie presenti nelle proteine
- Identificare protoni che interagiscono tra di loro
- Misurare la produzione di radicali liberi
2H) Discutere i vantaggi e gli svantaggi dell'utilizzo dell'NMR nella determinazione della struttura
tridimensionale delle proteine rispetto alla cristallografia a raggi X.
3H) Spiegare brevemente il principio della risonanza magnetica nucleare (NMR). Che tipo di
proteine sono analizzabili mediante questa tecnica? Che informazioni fornisce?
I) GENOMICA E PROTEOMICA
1I) Descrivere in modo schematico e sintetico le diverse fasi di un esperimento di analisi di
espressione genica che utilizzi dei microarray.
L) ENZIMI
1L) Calcolo della Vmax e KM. I seguenti dati sperimentali sono stati raccolti durante lo studio
dell’attività catalitica di una peptidasi intestinale capace di idrolizzare il dipeptide glicilglicina:
Gligilglicina + H2O -> 2 Glicina
6
[S] (mM)
1.5
2
3
4
8
16
Prodotto Formato / Velocità (μmol/min)
0.21
0.24
0.28
0.33
0.4
0.45
Da questi dati determinate tramite un’analisi in grafico i valori di Vmax e di KM per questa
preparazione enzimatica e per questo substrato.
2L) La cinetica allo stato stazionario di un enzima viene studiata in presenza ed assenza di un
inibitore. La velocità è data in funzione della concentrazione di substrato nella tabella riportata:
[S] (mM)
0.625
0.83
1.15
2.5
5.0
V0 Senza Inibitore
1.72
2.04
2.63
3.33
4.17
V0 Inibitore 5mM
1.01
1.26
1.72
2.56
3.49
V0 Inibitore 3mM
1,25
1,54
2,0
2,86
3.70
(a) Calcolare i valori di Vmax e KM in assenza di inibitore
(b) Di che tipo di inibitore si tratta?
3L) Purificazione di un enzima. Supponiamo che abbiate purificato un enzima seguendo le tappe
descritte nella tabella di purificazione riportata qui sotto.
Calcolare dopo ogni tappa della procedura di purificazione:
- l’attività specifica (U/mg) della soluzione enzimatica
- la resa dell’enzima
- il livello di purificazione dell’enzima (è una misura di quanto aumenta l’attività specifica nei
vari passaggi)
Riportate i dati in tabella
7
Quale tra le procedure utilizzate è risultata, a vostro giudizio, più efficace? E perché?
Quale tra le procedure utilizzate è risultata, a vostro giudizio, la meno efficace? E perché?
Dai dati mostrati in tabella vi sono indicazioni che dopo l’ultima tappa di purificazione l’enzima sia
allo stato puro?
4L) Purificazione di un enzima. Supponiamo che abbiate purificato un enzima seguendo le tappe
descritte nella tabella di purificazione riportata qui sotto.
Calcolare dopo ogni tappa della procedura di purificazione:
- l’attività specifica (U/mg) della soluzione enzimatica
- la resa dell’enzima
- il livello di purificazione dell’enzima (è una misura di quanto aumenta l’attività specifica nei
vari passaggi)
Riportate i dati in tabella
Quale tra le procedure utilizzate è risultata, a vostro giudizio, più efficace? E perché?
Quale tra le procedure utilizzate è risultata, a vostro giudizio, la meno efficace? E perché?
Dai dati mostrati in tabella vi sono indicazioni che dopo l’ultima tappa di purificazione l’enzima sia
allo stato puro?
8
M) GENERICHE
1M) Quale tra le tecniche elencate può essere utilizzata per gli obiettivi indicati? È possibile
indicare anche più di una tecnica.
2M) Descrivere schematicamente il procedimento per determinare il peso molecolare di una
proteina
9
N) LABORATORIO DI METODI BIOCHIMICI
1N) L’enzima superossido dismutasi da Haemophilus ducreyi è caratterizzato dai seguenti
coefficienti di estinzione molare:
ε280 = 28500 M-1cm-1
ε408 = l00000 M-1cm-1
Il coefficiente di estinzione a 280 nm è essenzialmente dovuto alla parte proteica, mentre quello a
408 nm è attribuibile alla presenza del cofattore eme.
A partire da una preparazione dell'enzima ottenuta tramite cromatografia di affinità caratterizzata
dai seguenti valori di Assorbanza:
A280 = 0.63 , A408= 1.33
Determinare:
- La concentrazione molare della proteina
- La percentuale di molecole che legano il cofattore eme
- La concentrazione in mg/ml della proteina, sapendo che il suo peso molecolare è 34300 Da.
2N) L'enzima superossido dismutasi da Haemophilus ducreyi è caratterizzato dai seguenti
coefficienti di estinzione molare:
ε280 = 28500 M-1cm-1
ε408 = l00000 M-1cm-1
Il coefficiente di estinzione a 280 nm è essenzialmente dovuto alla parte proteica, mentre quello a
408 nm è attribuibile alla presenza del cofattore eme.
A partire da una preparazione dell'enzima ottenuta tramite cromatografia di affinità, caratterizzata
dai seguenti valori di Assorbanza:
A280 = 0.44 , A408= 1.28
Determinare:
- La concentrazione molare della proteina
- La percentuale molecole che legano il cofattore eme
- La concentrazione di mg/ml della proteina sapendo che il suo peso molecolare è 34300 Da.
Dalle dispense del 2007….
3N) Come può essere purificata una proteina in un solo passaggio cromatografico?
4N) E’ possibile modificare le proteine per favorirne la purificazione?
5N) Come si può controllare il successo della procedura?
6N) Come è possibile verificare la purezza di una proteina purificata?
7N) Come è possibile determinarne il PM approssimativo?
8N) Come è possibile determinare la composizione in subunità di una proteina?
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