vegf-a elisa - IBL international

Istruzioni per l’Uso
VEGF-A ELISA
Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa
di Fattore di Crescita dell’Endotelio Vascolare-A (VEGF-A) umana nel
siero e plasma e nei supernatanti delle colture cellulari umani.
BE55101
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
G M B H
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 [email protected]
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com
VEGF-A ELISA (BE55101)
ITALIANO
INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE
1.
USO PREVISTO
2
2.
SOMMARIO
2
3.
PRINCIPIO DEL TEST
3
4.
REAGENTI FORNITI
4
5.
ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE
5
6.
PRELIEVO DEI CAMPIONI
5
7.
MATERIAL NECESSARI MA NO FORNITI
5
8.
PRECAUZIONI PER L’USO
6
9.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
7
10.
PROCEDURA DEL TEST
9
11.
CALCOLO DEI RISULTATI
11
12.
LIMITI DELLA PROCEDURA
12
13.
PERFORMANCE
13
14.
INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
15
15.
SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI
16
16.
SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST
17
17
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
18
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VEGF-A ELISA (BE55101)
1.
ITALIANO
USO PREVISTO
Il VEGF-A umano ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo
del VEGF-A umano. Il VEGF-A umano ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure
terapeutiche.
2.
SOMMARIO
La normale funzione del tessuto dipende da un regolare flusso di ossigeno attraverso i vasi sanguigni.
Nell’ultimo decennio la ricerca ha compiuto enormi sforzi per capire come si formano i vasi sanguigni.
La vasculogenesi nell’embrione è il processo attraverso il quale vengono generati ex novo nuovi vasi
sanguigni da cellule precursori primitive. L’angiogenesi è il processo di formazione di nuovi vasi sanguigni
da vascolarizzazioni preesistenti. Gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo, nella crescita di tessuto
normale, nella guarigione da ferite, nel ciclo riproduttivo femminile (sviluppo della placenta, ovulazione,
corpo luteo) oltre che in varie malattie. Particolare interesse è riposto nella crescita tumorale, in quanto la
crescita dei tumori non può aumentare di qualche millimetro di dimensione senza poi sviluppare un nuovo
flusso sanguigno. Questo processo è descritto come angiogenesi tumorale, che è anche essenziale nella
diffusione e nella crescita della metastasi di cellule tumorali. Una delle molecole chiave per l’angiogenesi e
per la sopravvivenza dell’endotelio è il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF-A). Si tratta di un
mitogeno specifico delle cellule endoteliali e di un forte fattore di permeabilità vascolare (VPF). La VEGF-A
è una glicoproteina che si lega all’eparina, secreta da diversi tipi di cellule sotto forma di omodimero di
45 kDa. La VEGF-A provoca anche la vasodilatazione attraverso il percorso di sintàsi dell’ossido nitrico
nelle cellule endoteliali e può attivare la migrazione dei monociti. Sono state descritte molte varianti di
splicing della VEGF-A, ma la VEGF165 è la proteina predominante e si ancora alla matrice extracellulare e
al solfato eparinico con il suo dominio legante l’eparina. Negli ultimi anni sono stati clonati diversi altri
membri della famiglia delle VEGF, comprese VEGF-B, -C- e -D. In termini di angiogenesi vascolare, che è
regolata principalmente dalla VEGF-A, la linfoangiogenesi è regolata principalmente da VEGF-C e -D.
La trascrizione della VEGF-A è superattivata dall’ipossia e da oncogeni come l’H-ras e diverse tirosin
chinasi transmembrana, come il recettore del fattore di crescita epidermico e l’ErbB2. Insieme, questi
percorsi rappresentano una marcata up-regulation della VEGF-A in tumori confrontati con tessuti normali e
spesso sono di importanza e rilevanza prognostica. La VEGF-A può essere individuata in campioni sia di
plasma sia di siero dei pazienti, con livelli molto più elevati nel siero. Livelli estremamente elevati possono
essere individuati nel fluido cistico cerebrale di pazienti con tumore al cervello o nel fluido ascitico dei
pazienti. Le piastrine rilasciano la VEGF-A in aggregazione e potrebbero costituire un’altra fonte importante
di rilascio di VEGF-A nei tumori. Molti altri studi hanno mostrato che l’associazione di livelli alti di VEGF-A
nel siero con pazienti dalla prognosi di cancro infausta potrebbe essere collegata ad un conteggio elevato di
piastrine. I tumori possono rilasciare citochine e fattori di crescita che stimolano la produzione di
megacariociti nel midollo ed aumentare il conteggio di piastrine. Questo può risultare in un altro, indiretto
aumento del rilascio di VEGF-A nei tumori. Inoltre, la VEGF-A è coinvolta in diverse altre condizioni
patologiche associate ad angiogenesi avanzata o permeabilità vascolare avanzata. Esempi di dove la
VEGF-A gioca un ruolo importante sono la psoriasi e l’artrite reumatoide, così come la sindrome di
iperstimolazione ovarica. La retinopatia diabetica è associata ad alti livelli intraoculari di VEGF-A e
l’inibizione della funzione della VEGF-A, nel bloccare la funzione del corpo luteo, può portare all’infertilità. La
diretta dimostrazione dell’importanza della VEGF-A nella crescita tumorale è stata raggiunta usando
recettori di VEGF dominanti negativi per bloccare la proliferazione in-vivo, oltre che bloccando gli anticorpi
anti VEGF o inibitori di uno dei recettori di VEGF. Per questo l’interferenza con la funzione della VEGF-A è
divenuta di grande interesse per la creazione di farmaci che blocchino l’angiogenesi e la metastasi. Più di
110 case farmaceutiche in tutto il mondo sono coinvolte nella creazione di tali antagonisti. I loro approcci
includono antagonisti della VEGF-A o i suoi recettori, inibitori selettivi della tirosino-chinasi, individuazione di
farmaci e tossine per i recettori di VEGF e terapia genetica regolata dallo stesso percorso ipossico che
controlla la produzione di VEGF-A. Mirare alla segnalazione del VEGF può essere di grande importanza
terapeutica per molte malattie e serve come base per la progettazione di futuri trattamenti (anti)angiogenici.
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3.
ITALIANO
PRINCIPIO DEL TEST
Figura 1
I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento
VEGF-A anti-umano.
Micropozzetto Rivestito
Anticorpo di Rivestimento
Figura 2
Prima Incubazione
Il VEGF-A umano presente nel campione o nello standard si lega
agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti.
Standard o Campione
Figura 3
Vi si aggiunge un anticorpo anti-umano VEGF-A coniugato alla
biotina, che si lega con il VEGF-A umano catturato dal primo
anticorpo.
Seconda Incubazione
Standard o Campione
Coniugato di Biotina
Figura 4
Dopo l’incubazione l’anticorpo VEGF-A coniugato alla biotina non
legato viene rimosso durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la
streptavidina-HRP che si lega all’anticorpo VEGF-A coniugato
alla biotina.
Terza Incubazione
Streptavidina-HRP
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ITALIANO
Figura 5
Dopo l’incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene
rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una
soluzione dei substrato reattiva all’HRP
Quarta Incubazione
Substrato
Figura 6
In proporzione alla quantità di VEGF-A umano presente nel
campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La
reazione viene terminata aggiungendo l’acido e l’assorbanza si
misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7
diluizioni standard di VEGF-A umano e si determina la
concentrazione del campione di VEGF-A umano.
Substrato post-reazione
4.
REAGENTI FORNITI
1
busta d’alluminio con una Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo policlonale
VEGF-A anti-umano
1
flaconcino (120 µL) di Coniugato di Biotina (anticorpo policlonale VEGF-A anti-umano)
1
flaconcino (150 µL) di Streptavidina-HRP
2
flaconcini di Standard di VEGF-A umano, liofilizzato, 2 ng/mL dopo ricostituzione
1
flaconcino di Controllo alto, liofilizzato
1
flaconcino di Controllo basso, liofilizzato
1
flaconcino (12 mL) Diluente dei Campioni
1
flaconcino (5 mL) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x
(PBS con l’1 % di Tween 20 e 10 % di BSA)
1
bottiglia (50 mL) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x
(PBS con l’1 % di Tween 20)
1
flaconcino (15 mL) di Soluzione Substrato (Tetrametilbenzidina)
1
flaconcino (15 mL) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M)
6
Copripiastra adesivi
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5.
ITALIANO
ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE – KIT ELISA
Conservare i reagenti del kit ad una temperatura tra 2 °C ed 8 °C, eccetto per i controlli. Conservare i
controlli liofilizzati a -20 °C. I reagenti rimanenti, immediatamente dopo l’uso, devono essere riposti e
conservati al freddo (tra 2 °C ed 8 °C). La data di scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette.
La scadenza delle componenti del kit può essere garantita solo se le componenti sono conservate in modo
corretto e se, in caso di uso ripetuto di un componente, questo reagente non è stato contaminato nel corso
delle manipolazioni precedenti.
6.
RACCOLTA DEI CAMPIONI ED ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE
Con questo dosaggio sono stati testati il supernatante delle colture cellulari, il siero*, il plasma (EDTA ed
eparina) ed il liquido amniotico. Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all’uso per questo
dosaggio. Dopo la coagulazione, rimuovere il siero dal coagulo non appena possibile.
I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio.
Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici.
I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 °C, per evitare la perdita di VEGF-A
umano bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una
temperatura tra 2 °C ed 8 °C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5).
Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev’essere
portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela.
* Prestare attenzione ad un livello di siero eventualmente elevato di VEGF-A umano dovuto al rilascio di
VEGF-A da parte delle piastrine durante l’attivazione piastrinica (processo di campionamento).
7.
MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
-
Pipette graduate da 5 mL e 10 mL
-
Micropipette adattabili da 5 µL a 1000 µL a canale singolo, con punte usa e getta
-
Micropipette adattabili da 50 µL a 300 µL, multicanale con punte usa e getta
-
Serbatoio per micropipette multicanale
-
Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti
-
Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema di
lavaggio automatico)
-
Lettore di strisce per micropozzetti in grado di leggere a 450 nm (620 nm come lunghezza d’onda
riferimento opzionale)
-
Acqua distillala in vetro o deionizzata
-
Calcolatore statistico con programma che esegua l’analisi di regressione
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8.
ITALIANO
PRECAUZIONI PER L’USO
-
Tutte le sostanze chimiche sono da considerarsi potenzialmente pericolose. Raccomandiamo quindi che
il prodotto venga maneggiato esclusivamente da personale debitamente istruito alle tecniche di
laboratorio e che venga usato secondo i principi della buona pratica di laboratorio. Indossare indumenti
di protezione idonei, come camici da laboratorio, occhiali e guanti di protezione. Evitare il contatto con la
pelle o gli occhi. In caso di contatto con pelle o occhi lavare immediatamente con acqua. Consultare
lascheda di sicurezza o dichiarazioni di sicurezza del prodotto per indicazioni più specifiche.
-
L’uso dei reagenti è inteso solo per uso diagnostico in vitro e non dev’essere usato per procedure
terapeutiche.
-
Non mescolare o sostituire i reagenti con quelli di altri lotti o di diversa provenienza.
-
Non usare i reagenti dei kit oltre la data di scadenza indicata sull’etichetta.
-
Durante il magazzinaggio o l’incubazione non esporre i reagenti del kit a luce intensa.
-
Non pipettare con la bocca.
-
Non mangiare o fumare nelle aree di manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni.
-
Evitare il contatto della pelle o delle membrane mucose con i reagenti dei kit o i campioni.
-
Durante la manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni indossare guanti di gomma o di lattice usa e
getta.
-
Evitare il contatto della soluzione di substrato con agenti ossidanti e metalli.
-
Evitare schizzi o generazione di vapori (aerosol).
-
Usare punte di pipette e/o pipette usa e getta per evitare la contaminazione microbica o la
contaminazione crociata dei reagenti o dei campioni, che potrebbero invalidare il test.
-
Usare vassoi puliti e dedicati per distribuire il coniugato ed il reagente del substrato.
-
L’esposizione agli acidi inattiva il coniugato.
-
Per la preparazione del reagente deve essere usata acqua distillata in vetro o deionizzata.
-
Prima dell’uso la soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente.
-
Decontaminare e eliminare i campioni e tutti i materiali potenzialmente contaminati in quanto potrebbero
contenere agenti infettivi. Il metodo preferenziale per la decontaminazione è l’autoclavaggio per minimo
un’ora a 121.5 °C.
-
I rifiuti liquidi che non contengono acidi e i rifiuti neutralizzati possono essere mescolati con ipoclorito di
sodio in volumi tali che la miscela finale contenga l’1.0 % di ipoclorito di sodio. Per una reale
decontaminazione sono necessari 30 minuti. I rifiuti liquidi contenenti acidi devono essere neutralizzati
prima dell’aggiunta d’ipoclorito di sodio.
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9.
ITALIANO
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Gli Concentrati dei Tamponi di Reagenti devono essere portati a temperatura ambiente e diluiti prima di
iniziare la procedura del test. Se si formano cristalli nei Concentrati dei Tamponi, riscaldarli gradualmente
al punto che si dissolvano completamente.
9.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)
Versare tutto il contenuto (50 mL) della Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) in un cilindro
graduato pulito da 1000 mL. Portare al volume complessivo di 1000 mL con acqua distillata in vetro o acqua
deionizzata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio.
Trasferire in una bottiglia di lavaggio pulita e conservare a temperatura tra 2 °C e 25 °C. Tenere in
considerazione che il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni.
Il Tampone di Lavaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella:
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) (mL)
25
50
Acqua Distillata (mL)
475
950
9.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)
Versare tutto il contenuto (5 mL) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro pulito e
graduato da 100 mL. Portare al volume complessivo di 100 mL con acqua distillata. Mescolare con cautela
per evitare lo schiumaggio.
Conservare a una temperatura tra 2 °C e 8 °C. Tenere in considerazione che la Soluzione Tampone di
Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni.
Il Tampone di Dosaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella:
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (20x) (mL)
2.5
5.0
Acqua Distillata (mL)
47.5
95.0
9.3. Coniugato di Biotina
Tenere in considerazione che il Coniugato di Biotina deve essere usato entro 30 minuti dalla sua
diluizione.
Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Coniugato di Biotina con il Tampone di
Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella:
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
13.03.15 (27)
Coniugato di Biotina (mL)
0.06
0.12
Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (mL)
5.94
11.88
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VEGF-A ELISA (BE55101)
ITALIANO
9.4. Streptavidina-HRP
Tenere in considerazione che la Streptavidina-HRP deve essere usata entro 30 minuti dalla sua
diluizione.
Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Streptavidina-HRP con il Tampone di Dosaggio
(1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella:
Numero di Stisce
1–6
1 - 12
Streptavidina-HRP (mL)
0.06
0.12
Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (mL)
5.94
11.88
9.5. Standard VGEF-A Umano
Ricostituire lo standard VEGF-A umano aggiunendo acqua distillata.
Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta del flaconcino dello standard. Girare o mescolare
gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard
ricostituito = 200 pg/mL). Lasciare lo standard a ricostituire per 10-30 minuti. Prima di fare le diluizione
mescolare bene.
Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato.
La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi
(vedi 9.5.1).
9.5.1. Diluizione Standard Esterna
Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto standard.
S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.
Quindi preparare diluizioni seriali 1:2 per la curva standard come segue:
Pipettare 225 µL di Diluente dei Campioni in ogni tubo.
Pipettare 225 µL di standard ricostituito (concentrazione = 2 ng/mL) nel primo tubo, etichettato come S1, e
mescolare (concentrazione dello Standard 1 = 1 ng/mL).
Pipettare 225 µL di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mescolare accuratamente prima del
trasferimento seguente. Ripetere le diluizioni seriali altre 5 volte creando così i punti della curva standard
(vedi Figura 7).
Il Diluente dei Campioni serve come bianco.
Figura 7
Transferire 225 µL
S1
VEGF-A Umano
Standard Ricostituito
13.03.15 (27)
S2
S3
Diluente dei Campioni
225 µL
S4
-
S7
Scartare
225 µL
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9.6. Controlli
Solubilizzare aggiungendo 500 µL di acqua distillata al controlli liofilizzati. Permettere al controlli di riposare
per 10-30 minuti. Agitare o mescolare delicatamente per assicurare una solubilizzazione completa ed
omogenea. In seguito considerare i controlli allo stesso modo dei campioni del dosaggio. Per il range dei
valori del controllo si rimanda al certificato di analisi o all'etichetta presente sulla fiala. Conservare i controlli
ricostituiti in aliquote a -20 °C. Evitare ripetuti cicli di scongelamento.
10.
PROTOCOLLO DI TEST
a.
Determinare il numero di strisce micropozzetti necessario a testare il numero desiderato di campioni,
oltre al numero idoneo di pozzetti necessari per eseguire i bianchi e gli standard. Ogni campione,
standard, bianco e campione di controllo opzionale dev’essere dosato in duplicato. Rimuovere dal
supporto le strisce micropozzetti non usate e conservarle insieme all’essiccante fornito nella bustina
metallica, chiusa ermeticamente a una temperatura di 2-8 °C.
b.
Lavare le strisce micropozzetti due volte con un Tampone di Lavaggio di circa 400 µL per ogni
pozzetto; aspirare completamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l’altro. Prima di
aspirare, lasciare il tampone di lavaggio all’interno dei pozzetti per circa 10–15 secondi prima
dell’aspirazione. Fare attenzione a non scalfire la superficie dei pozzetti.
Dopo l’ultima fase di lavaggio, svuotare i pozzetti e picchiettare le strisce micropozzetti su carta
assorbente o su una salvietta di carta per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Usare le
strisce micropozzetti immediatamente dopo il lavaggio. In alternativa, le strisce micropozzetti
possono essere collocate capovolte su una carta assorbente bagnata per non oltre 15 minuti. Non
lasciar asciugare i pozzetti.
c.
Diluizione standard sulla piastra per micropozzetti
(In alternativa, la diluzione standard si può preparare in tubi - vedi 9.5.1):
Aggiungere 100 µL Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti degli standard. Pipettare
100 µL di standard preparato (vedi Preparazione dello Standard 9.5, concentrazione = 2000 pg/mL),
in duplicato, nei pozzetti A1 ed A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2
aspirando ed espellendo ripetutamente (concentrazione dello standard 1, S1 = 1000 pg/mL) e
trasferire 100 µL rispettivamente nei pozzetti B1 e B2 (vedi Figura 8). Fare attenzione a non scalfire
la superficie interna dei pozzetti. Ripetere la procedura 5 volte creando due serie di diluizioni
standard di VEGF-A umano con un range da 1000.0 a 15.6 pg/mL. Scartare 100 µL del contenuto
degli ultimi micropozzetti (G1, G2) usati.
Figura 8
Transferire 100 µL
S1
VEGF-A Umano
Standard Ricostituito
13.03.15 (27)
S2
S3
Diluente dei Campioni
100 µL
S4
-
S7
Scartare
100 µL
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ITALIANO
Nel caso di una diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1), pipettare 100 µL di queste diluizioni dello
standard (S1 to S7) nei pozzetti dello standard, come da Tavola 1.
Tavola 1
La tavola descrive un esempio dell’organizzazione dei bianchi, degli standard e dei campioni nelle strisce
dei micropozzetti.
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
Standard 1
(1000.0 pg/mL)
Standard 2
(500.0 pg/mL)
Standard 3
(250.0 pg/mL)
Standard 4
(125.0 pg/mL)
Standard 5
(62.5 pg/mL)
Standard 6
(31.3 pg/mL)
Standard 7
(15.6 pg/mL)
Standard 1
(1000.0 pg/mL)
Standard 2
(500.0 pg/mL)
Standard 3
(250.0 pg/mL)
Standard 4
(125.0 pg/mL)
Standard 5
(62.5 pg/mL)
Standard 6
(31.3 pg/mL)
Standard 7
(15.6 pg/mL)
Bianco
Bianco
3
4
Campione 1
Campione 1
Campione 2
Campione 2
Campione 3
Campione 3
Campione 4
Campione 4
Campione 5
Campione 5
Campione 6
Campione 6
Campione 7
Campione 7
Campione 8
Campione 8
d.
Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti del bianco.
e.
Aggiungere 50 µL di Diluente dei Campioni ai pozzetti del campione.
f.
Aggiungere 50 µL di ogni campione in duplicato ai pozzetti del campione.
g.
Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 2 ore; se è disponibile un
vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una
performance ottimale del test.)
h.
Preparare il Conjugato di Biotina (vedi 9.3 Preparazione del Coniugato di Biotina).
i.
Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 6 volte come da
punto b. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente.
j.
Aggiungere 100 µL Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti.
k.
Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora; se è disponibile un
vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una
performance ottimale del test.)
l.
Preparare la Streptavidina-HRP (fare riferimento alla preparazione della Streptavidina-HRP 9.4).
m.
Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 6 volte come da
punto b. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente.
n.
Aggiungere 100 µL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco.
o.
Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora; se è disponibile un
vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una
performance ottimale del test.)
p.
Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte come da
punto b. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente.
q.
Pipettare 100 µL di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti.
13.03.15 (27)
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VEGF-A ELISA (BE55101)
r.
ITALIANO
Incubare le strisce dei micropozzetti a temperatura ambiente (18-25 °C) per circa 30 minuti. Evitare
l’esposizione diretta a luce intensa.
Lo sviluppo cromatico sulla piastra dev’essere monitorato e la reazione del substrato
dev’essere bloccata (vedi prossimo punto di questo protocollo) prima che i valori dei pozzetti
positivi non siano più correttamente registrabili. Il periodo ideale di tempo necessario per lo
sviluppo del colore dev’essere determinato individualmente per ogni dosaggio.
Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più alto ha raggiunto un
colore blu scuro. In alternativa, lo sviluppo del colore può essere monitorato con il lettore ELISA a
620 nm. La reazione del substrato dev’essere bloccata non appena lo Standard 1 ha raggiunto un
DO di 0.9 – 0.95.
s.
Bloccare la reazione dell’enzima pipettando velocemente 100 µL di Soluzione Bloccante in ogni
pozzetto. E’ importante che la Soluzione Bloccante venga distribuita velocemente ed uniformemente
su tutti i pozzetti per inattivare completamente l’enzima. I risultati devono essere letti
immediatamente dopo l’aggiunta della Soluzione Bloccante, o entro 1 ora se le strisce dei
micropozzetti sono conservate al buio e ad una temperatura di 2-8 °C.
t.
Leggere l’assorbanza di ogni micropozzetto con uno spettrofotometro usando 450 nm. come
lunghezza d’onda primaria (in alternativa, 620 nm. come lunghezza d’onda di riferimento; da 610 nm
a 650 nm. il valore è accettabile). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore
e usando i pozzetti del bianco. Determinare l’assorbanza sia dei campioni, sia degli standard.
11.
CALCOLO DEI RISULTATI
- Calcolare i valori medi dell’assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono
rientrare nel 20 % del valore medio.
- Creare una curva standard segnando l’assorbanza media di ogni concentrazione standard sull’ordinata
contro la concentrazione di VEGF-A umano sull’ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i
punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri).
- Per determinare la concentrazione di VEGF-A umano circolante per ogni campione, trovare prima il
valore medio di assorbanza sull’ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel
punto d’intersezione estendere una linea verticale fino all’ascissa e leggere il valore corrispondente della
concentrazione di VEGF-A umano.
- Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in
proporzione di 1:2 (50 µL di campione + 50 µL Diluente dei Campioni), la concentrazione letta
dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 2).
- Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato
livelli scorretti e bassi di VEGF-A umano. Questi campioni richiedono un’ulteriore pre-diluizione
esterna secondo i valori stimati del VEGF-A umano, con un Diluente dei Campioni in modo da
quantificare con precisione i livelli reali di VEGF-A umano.
- Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di
VEGF-A umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori
ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi.
- La Figura 9 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne
risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per
micropozzetti su cui si fa il dosaggio.
Figura 9
Curva standard rappresentativa per il VEGF-A umano ELISA. Il VEGF-A umano è stato diluito in 2 fasi
seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard
dev’essere eseguita per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.
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VEGF-A ELISA (BE55101)
ITALIANO
VEGF-A ELISA
10.00
1.00
0.10
0.01
10
100
1000
10000
( pg/ m L)
Tavola 2
Dati tipici relativi all’uso del VEGF-A umano ELISA
Lunghezza d’onda: 450 nm
Lunghezza d’onda di riferimento: 620 nm
1
Concentrazione di
VEGF-A Umano (pg/mL)
1000.0
2
500.0
3
250.0
4
125.0
5
62.5
6
31.3
7
15.6
Bianco
0.0
Standard
D.O.
(450 nm)
2.201
2.308
1.244
1.327
0.766
0.775
0.409
0.429
0.258
0.258
0.162
0.163
0.112
0.093
0.066
0.073
D.O.
Media
2.254
C.V.
(%)
2.4
1.286
3.2
0.771
0.6
0.419
2.5
0.258
0.1
0.163
0.3
0.102
9.4
0.069
4.9
I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad
es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può
influenzare l’attività enzimatica e quindi l’intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi.
12.
LIMITI DELLA PROCEDURA
-
Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva
standard per ogni esecuzione del test.
-
La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione
crociata tra reagenti può casusare risultati erronei.
-
Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili
devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell’uso.
-
Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi
negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire
con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o
non permettere che si asciughino per periodi prolungati.
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13.
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CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
13.1. Sensibilità
Il limite di rilevamento del VEGF-A umano definito come la concentrazione dell’analita, risultante in
un’assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni
standard), è stato determinato di 7.9 pg/mL (media di 6 dosaggi indipendenti).
13.2. Riproducibilità
13.2.1. Intra-dosaggio
La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è
stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di VEGF-A umano.
Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione
media di VEGF-A umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente
complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 6.2 %.
Tavola 3
La concentrazione media di VEGF-A umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione
Campione
Esperimento
1
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
2
3
4
5
6
7
8
13.03.15 (27)
Concentrazione Media
VEGF-A Umano (pg/mL)
1596
1496
1507
881
853
888
439
452
469
897
849
844
119
118
130
85
78
83
256
295
304
371
350
352
Coefficiente di
Variazione (%)
3.7
2.9
1.8
2.6
7.7
5.3
3.5
6.2
10.3
7.1
6.5
5.7
11.7
13.3
7.8
8.3
8.7
2.6
5.2
9.9
3.1
3.9
4.2
6.2
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VEGF-A ELISA (BE55101)
ITALIANO
13.2.2. Inter-dosaggio
La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell’ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti
indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse
concentrazioni di VEGF-A umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di
seguito illustrano la concentrazione media di VEGF-A umano ed il coefficiente di variazione calcolato su
18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo
calcolato era del 4.3 %.
Tavola 4
La concentrazione media di VEGF-A umano ed il coefficiente di variazione di ogni campione:
Concentrazione Media di
Coefficiente di
Campione
VEGF-A Umano (pg/mL)
Variazione (%)
1
1533
3.6
2
874
2.1
3
453
3.4
4
864
3.4
5
122
5.2
6
82
4.6
7
285
8.9
8
358
3.1
13.3. Test di Recupero
Il test di recupero è stato valutato addizionando 3 livelli di VEGF-A umano al siero, plasma e supernatanti di
colture cellulari. I recuperi sono stati determinati nel corso ognuno con 4 replicati.
La quantità di VEGF-A umano endogeno in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test.
Vedi Tavola 5 per i dati di recupero.
Tavola 5
Matrice del
Campione*
Siero
Plasma (EDTA)
Plasma (Citrato)
Plasma (Heparina)
Supernatanti di
colture cellulari
Test Alto (%)
Test Medio (%)
Test Basso (%)
88
77
92
106
85
77
90
88
81
79
94
64
98
92
88
13.4. Parallelismo della Diluizione
4 campioni di siero con diversi livelli di VEGF-A umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e
con 4 replicati l’uno.
Vedi Tavola 6 per i dati di recupero.
Tavola 6
Matrice di
Campione*
Siero
Plasma (EDTA)
Plasma (Citrato)
Plasma (Heparina)
Supernatanti di
colture cellulari
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Recupero dei Valori Attesi
Intervallo (%)
Media (%)
76-104
90
93-147
110
83-99
90
98-119
108
72-103
91
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ITALIANO
13.5. Stabilità del Campione
13.5.1. Stabilità a Congelamento-Scongelamento
Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 °C e scongelate 5
volte e sono stati determinati i livelli di VEGF-A umano. È stata individuata una diminuzione significativa di
immunoreattività VEGF-A umana. Per questo motivo i campioni devono essere conservati in parti a -20 °C e
scongelati solo una volta.
13.5.2. Stabilità della Conservazione
Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 °C, 2-8 °C, a
temperatura ambiente (TA) ed a 37 °C e il livello di VEGF-A umano ne è stato determinato dopo 24 ore.
Durante la conservazione a -20 °C ed a 2-8 °C non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività
dello VEGF-A umano. Una significativa perdita di immunoreattività VEGF-A umana è stata individuata
durante l’immagazzinamento a temperatura ambiente e a 37 °C dopo 24 ore.
13.6. Specificità
Il dosaggio rileva il VEGF-A umano sia naturale, sia ricombinante. L’interferenza dei fattori circolanti del
sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti
ad un siero positivo di VEGF-A umano.
Non è stata rilevata alcuna reattività crociata con VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e PfGF umani. L’interferenza
è stata individuata per VEGF-R1 a concentrazioni > 200 pg/mL e non per VEGF-R2.
13.7. Valori Attesi
Per il VEGF-A umano è stato testato un pannello di 40 campioni di siero e EDTA, citrato e plasma eparinato
di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). I livelli misurati
possono variare con la raccolta di campioni usata. Vedi Tavola 7 per i livelli di VEGF-A umano.
Tavola 7
Matrice di
Campione
Siero
Plasma
(EDTA)
Plasma
(Citrato)
Plasma
(Eparina)
Numero di Campioni
Valutati
40
Intervallo
(pg/mL)
nd* - 42.6
Media
(pg/mL)
2.5
Deviazione Standard
(pg/mL)
--
40
nd* - 128.9
7.5
45.7
40
nd* - 66.2
7.5
47.3
40
nd* - 311.4
7.5
144.3
*nd = non-detectable (non rilevabile), i campioni misurati sotto il punto standard più basso sono stati
considerati non rilevabili.
14.
INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
Per gli ordini contattare:
Vedi ultima pagina.
Per informazioni tecniche contattare:
e-mail: [email protected]
www.IBL-International.com
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VEGF-A ELISA (BE55101)
15.
ITALIANO
SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI
15.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)
Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 mL) a 950 mL di acqua distillata.
Numero di
Strisce
1-6
1-12
Soluzione Tampone di
Lavaggio Concentrata (mL)
25
50
Acqua Distillata
(mL)
475
950
15.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)
Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 mL) a 95 mL di acqua distillata.
Numero di
Strisce
1-6
1-12
Soluzione Tampone di
Dosaggio Concentrato (mL)
2.5
5.0
Acqua Distillata
(mL)
47.5
95.0
15.3. Coniugato di Biotina
Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x):
Numero di
Strisce
1-6
1-12
Coniugato di Biotina
(mL)
0.06
0.12
Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)
(mL)
5.94
11.88
15.4. Streptavidina-HRP
Fare una diluizione 1:100 di Streptavidina-HRP nella Soluzione Tampone di Dosaggio (1x):
Numero di
Strisce
1-6
1-12
Streptavidina-HRP
(mL)
0.06
0.12
Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)
(mL)
5.94
11.88
15.5. Standard VEGF-A Umano
Reconstituire il standard VEGF-A umano liofilizzato con acqua distillata.
(Il volume di ricostituzione è dichiarato sull’etichetta del flaconcino dello standard.)
15.6. Controlli
Aggiungere 500 µL di acqua distillata ai controlli liofilizzati.
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VEGF-A ELISA (BE55101)
16.
ITALIANO
SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST
1.
Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto.
2.
Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio.
3.
Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni,
in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µL di standard preparato nei primi pozzetti e
creare diluizioni di standard trasferendo 100 µL da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µL dagli ultimi
pozzetti.
Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.5.1.): Pipettare 100 µL di queste
diluizioni dello standard nei micropozzetti.
4.
Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni, in duplicato, ai pozzetti del bianco.
5.
Aggiungere 50 µL Diluente dei Campioni ai pozzetti dei campioni.
6.
Aggiungere 50 µL di campioni in duplicato ai pozzetti per i campioni designati.
7.
Coprire le strisce dei micropozzetti ed incubare per due ore (18-25 °C). (Agitazione è assolutamente
necessario per una performance ottimale del test.)
8.
Preparare il Coniugato di Biotina.
9.
Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con il Tampone di Lavaggio.
10.
Aggiungere 100 µL di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti.
11.
Coprire le strisce dei micropozzetti ed incubare per 1 ora (18-25 °C). (Agitazione è assolutamente
necessario per una performance ottimale del test.)
12.
Preparare la Streptavidina-HRP.
13.
Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio.
14.
Aggiungere 100 µL di Streptavidina-HRP diluta a tutti i pozzetti.
15.
Coprire le strisce dei micropozzetti ed incubare per 1 ora (18-25 °C). (Agitazione è assolutamente
necessario per una performance ottimale del test.)
16.
Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con il Tampone di Lavaggio.
17.
Aggiungere 100 µL di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti.
18.
Incubare le strisce di micropozzetti per circa 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C).
19.
Aggiungere 100 µL di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti.
20.
Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l’intensità del colore a 450 nm.
Annotazione: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in
proporzione 1:2 (50 µL di campione + 50 µL Diluente dei Campioni), la concentrazione letta dalla
curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x2).
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17.
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Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto
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permeability factor in human granulosa cells: importance in ovarian hyperstimulation syndrome.
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J. C.. Annexin V autoantibodies in rheumatoid arthritis. Ann.Rheum.Dis. 1996; 55:895-900.
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Flynn, E.; Parangi, S.; Byers, H. R.; Folkman, J.. Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two
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Bonoldi, E.; Boracchi, P.; Gatti, C.; Suzuki, H.; Tominaga, T.. Prognostic significance of vascular
endothelial growth factor protein in node-negative breast carcinoma. J.Natl.Cancer Inst. 1997; 89:139147.
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factor receptors in vascular development. Curr.Top.Microbiol.Immunol. 1999; 237:133-158.
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determination of life/death decisions in B lymphocytes. Int.Rev.Immunol. 1997; 15:5-31.
9. Weindel, K.; Moringlane, J. R.; Marme, D.; Weich, H. A.. Detection and quantification of vascular
endothelial growth factor/vascular permeability factor in brain tumor tissue and cyst fluid: the key to
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10. Senger, D. R.; Galli, S. J.; Dvorak, A. M.; Perruzzi, C. A.; Harvey, V. S.; Dvorak, H. F. Tumor cells
secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science 1983;
219:983-985.
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18/18
Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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