Monog.IL V (Page 47) - Instrumentation Laboratory SpA
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COAGULAZIONE F. D’Agostino, S. Brambilla, G. Cambié, D. Fugazza, L. Acquistapace, M.L. Nardella, T. Tondini, G. Sterza, S. Cerliani L’Eparina implicazioni diagnostiche, cliniche e terapeutiche IV F. D’Agostino, S.Brambilla, G.Cambie’, D.Fugazza, L.Acquistapace, M.L. Nardella, T. Tondini, G.Sterza, S.Cerliani*. Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale Ospedale Maggiore di Lodi * Instrumentation Laboratory Marketing DCI, Milano L’EPARINA: IMPLICAZIONI DIAGNOSTICHE, CLINICHE E TERAPEUTICHE INDICE Introduzione Cenni storici Struttura e biosintesi Attività biologiche Origini Farmacocinetica Uso clinico e complicanze Monitoraggio Riferimenti bibliografici Introduzione ’eparina é un mucopolisaccaride fortemente acido, ad elevata carica elettronegativa, con peso molecolare variabile tra 3500 e 35000 Daltons a seconda del grado di polimerizzazione della struttura di base, costituita da un acido uronico (L-iduronico e/o L-glicuronico) e una esosamina (D-glucosamina o D-galattosamina). Il numero delle unità disaccaridiche é proporzionale all’attività anticoagulante dell’eparina. Essa infatti possiede un’azione inibente sul meccanismo della coagulazione e interagisce sul sistema emostatico sia a livello endoteliale che piastrinico. Il suo principale meccanismo d’azione consiste nel catalizzare la reazione tra Antitrombina III e alcuni fattori attivati della coagulazione (Xa, IIa, XIIa, XIa, IXa, callicreina). Il sito eparinico di interazione con l’AT III é rappresentato da una unità pentasaccaridica. Il complesso eparina-trombina-AT III coinvolge nella sua formazione almeno 18 unità monomeriche. Se le unità monomeriche dell’eparina sono in numero inferiore a 18, si ha solamente un’attività anti-F Xa e non antitrombinica. A questo proposito é opportuno ricordare come l’inattivazione di ogni unità di F Xa neutralizzi la formazione di 50 unità di trombina. Ne deriva che eparine a diverso peso molecolare hanno diversa attività, pertanto il loro uso può essere a fini prettamente antitrombotici (anti Xa) oppure anticoagulanti. Ad alte concentrazioni infine, l’eparina ha un effetto addizionale sulla velocità di inibizione della trombina per l’intervento del cofattore eparinico II (30). L Cenni storici Furono necessari diversi studi prima di giungere alle eparine oggi comunemente usate. Nel 1908 Jay Mac Lean, partendo dal fegato di cane, ottenne una frazione solubile in alcool con caratteristiche simili alle cefaline ricavate da altri organi, ad azione procoagulante, e una insolubile in alcool bollente che chiamò “heparphosphatide” che, al contrario della prima, possedeva un’azione anticoagulante. Nel 1916 questa stessa sostanza venne ribattezzata da Howell con il termine “anti-protrombina” e solo due anni dopo venne chiamata “heparine” perché estratta dal fegato. Nel 1922 Howell abbandonò l’estrazione con etere e passò ad un’estrazione acquosa in cloruro di sodio in mezzo alcalino: l’eparina fu da allora commercializzata dalla società Hynson Westcott Dunning e titolata in Unità Howell (5U/mg). Successivamente si cercò di produrre eparina in quantità maggiore a costi minori. Iniziò così nel 1933 la sua estrazione dal polmone di bue che ne rappresentò la fonte primaria per oltre trent’anni. Nel 1935 lo svedese Eric Jorpes definì la struttura chimica dell’eparina, confermando la presenza di acidi uronici, di solfati e di glucosamina. Infine, nel 1960 dopo gli studi condotti dall’inglese J.E.Scott, venne adottato un metodo moderno di produzione dell’eparina estratta dall’intestino di maiale e di bue mediante ammoni quaternari. Pertanto, nonostante la sua scoperta risalga a molti decenni fa, l’eparina é ancora oggi oggetto di numerose ricerche, indirizzate a definirne la struttura chimica in rapporto alla sua attività e le sue interferenze con i processi coagulativi. Negli anni ‘70 gli studi di Wesser e Yin, seguiti poi dalle ricerche cliniche di Kakkar (1973) hanno permesso un più razionale uso terapeutico diversificato dell’eparina, non solamente come farmaco anticoagulante, ma anche antitrombotico, grazie alla dimostrazione di recettori per l’eparina, presenti sulla superficie delle cellule endoteliali, responsabili della regolazione del processo coagulativo. Ne deriva l’indicazione alla terapia eparinica anche nelle condizioni cliniche di ipercoagulabilità e negli stati pretrombotici. 3 Struttura e biosintesi L’eparina appartiene alla famiglia dei glicosaminoglicani (GAG), mucopolisaccaridi acidi solforati ad elevata carica elettronegativa a loro volta formati da unità disaccaridiche: una esosamina (aminozucchero N-acetilato; D-glucosamina o D-galattosamina) e un acido uronico (D-glucuronico o L-iduronico). Sono stati evidenziati sette glicosaminoglicani differenziati in base al tipo di legame tra i residui, al numero e alla posizione dei gruppi solfato (10) (vedi Fig.1). Caratteristiche PESO MOLECOLARE Glucosaminoglicani Acido ialuronico Condroitin-4solfato Condroitin-6solfato Dermatansolfato Eparansolfato Eparina Cheratansolfato da 4000 a 8x106 5000-50000 5000-50000 15000-40000 5000-12000 6000-25000 4000-19000 acido D-glucuronico acido D-glucuronico acido D-glucuronico acido D-glucuronico acido L-iduronico acido D-glucuronico acido L-iduronico D-galattosio UNITÀ DISACCARIDICA (A-B) Monosaccaride A acido D-glucuronico Monosaccaride B N-acetilD-galattosamina N-acetilD-galattosamina N-acetilD-galattosamina N-acetilD-galattosamina N-acetilD-galattosamina N-acetilD-galattosamina N-acetilD-galattosamina GRUPPI SOLFATO PER UNITÀ DISACCARIDICHE 0 0.2-1.0 0.2-2.1 1.0-2.0 0.2-3.0 2.0-3.0 0.9-1.8 - + + + + + + ALTRI COMPONENTI GLUCIDI 0 D-galattosio D-xilosio D-galattosio D-xilosio D-galattosio D-xilosio D-galattosio D-xilosio D-galattosio D-xilosio D-galattosamina D-mannosio D-fucosio acido sialico DISTRIBUZIONE NEI TESSUTI vari tessuti connettivi, umore vitreo, cartilagine, liquido sinoviale cartilagine, cornea, osso, cute, arterie cornea, osso, cute, arterie cute, vasi sanguigni, cuore, valvole cardiache polmoni, vasi sanguigni polmoni, fegato cute, mastociti cartilagine, cornea, disco invertebrale LEGATI ALLE PROTEINE Fig.1 I glucosaminoglicani (tratto da “Molecular cell biology” 1986). 4 ACIDI URONICI GLUCURONICO IDURONICO Esosamine Ioni Solfato N-Acetili Eparina Eparansolfato + ++ ++ + Glucosamina " ++ + Tracce + Condroitin4-Solfato Condroitin6-Solfato Dermatansolfato ++ + Galattosamina + + ++ + " + + + ++ " + + Glucosamina - + " + + Acido Ialuronico Cheratansolfato + D-galattosio anziché acidi uronici Fig .2 Composizione dei mucopolisaccaridi (tratto da “L’Héparine” J.P. Duclos, 1984). I GAG presentano, a differenza dell’acido ialuronico, unità disaccaridiche diverse associate a strutture più complesse, catene con meno di 300 residui monosaccaridici, legami di tipo covalente con proteine per la formazione dei cosiddetti proteoglicani (vedi Fig. 2). Questi ultimi furono scoperti da Gross nel 1959 il quale evidenziò la componente proteica e la componente glucidica con l’uso di sostanze radioattive. Si definì così la struttura del proteoglicano caratterizzata da un asse centrale di natura proteica e da lunghe catene laterali non ramificate di GAG (vedi Fig. 3). 100 nm Asse proteico Glicosaminoglicani non ramificati Fig.3 Proteoglicano tipico (tratto da “Molecular cell Patology” 1986). 5 La biosintesi dei proteoglicani si attua a livello dei mastociti. Nell’ergastoplasma si verifica la sintesi dell’asse proteico e quindi della matrice polipeptidica, caratterizzata da una sequenza aminoacidica di glicina e serina (vedi Fig. 4-6-7). Sull’ossidrile (OH) della serina si forma quella regione cerniera intermediaria tra l’asse proteico e i GAG. Chimicamente la regione cerniera é caratterizzata da tre glucidi neutri ed un acido uronico ed é chiamata zona di legame eparino-polipeptide (vedi Fig. 5). OH OH Ser Gly OH Ser Gly Gly Ser Gly Fig.4 La matrice polipeptidica (tratto da “L’Héparine” J. P. Duclos). Polipeptide Gly Catena Principale O COOH O OH O CH2OH OH O OH GlcUA (ac. D-Glicuronico) OH Gal (D-Galattosio) O CH2OH OH O O OH OH O OH Gal (D-Galattosio) Xyl (D-Xilosio) O Ser Gly Polipeptide Fig.5 Struttura della zona di legame eparino-polipeptide (tratto da “L’Héparin” J. P. Duclos). I mastociti presentano inoltre un corredo enzimatico per la successiva operazione di assemblaggio della parte disaccaridica, che si verifica a livello dell’apparato di Golgi e prima di essere stoccata nei granuli subisce varie modificazioni che conferiscono al polimero una struttura completamente diversa. Glucosio Acidi Parte Proteica Amine Enzima Ergastoplasma 6 Parte Glucidica App. di Golgi Granuli (Stoccaggio) Secrezione Fig.6 Biosintesi dei Proteogliani (tratto da “L’Héparine” J. P. Duclos). Il processo di caratterizzazione del polimero si verifica in cinque tappe: 1) desacetilazione. La maggior parte delle funzioni aminiche viene desacetilata; a livello dei mastociti polmonari la desacetilazione avviene completamente, mentre a livello dei mastociti intestinali solo il 10-25 % delle funzioni aminiche subisce tale processo (vedi Fig. 7). CH2OH O OH CH2 OH O OH (N-Desacetilasi) + NH3 NH-CO-CH3 N-Acetil Glucosamina Glucosamina Fig.7 Desacetilazione della Glucosamina (tratto da “L’Héparine” J. P. Duclos). 2) N-sulfatazione. + I gruppi NH 3 subiscono un processo di sulfatazione attraverso un consumo di energia fornita dall’ATP, con formazione di solfati attivati e successivamente, mediante l’intervento dell’enzima N-sulfotransferasi, si fissano al gruppo aminico della glucosamina (vedi Fig. 8A e 8B). N2 O N = = O ATP PP ATP SO4= APS Solfato Adenosina -5'fosfosolfato = – HO - S - O - P - O - CH2 O OH N N N O OH OPO3H ADP PAPS 3' Fosfoadenosina -5'fosfosolfato Fig.8A Formazione del solfato attivo (PAPS). CH2OH O OH PAPS (N-Sulfotransferasi) + NH 3 Glucosamina Fig.8B N-sulfatazione della glucosamina. CH2 OH O OH NH 3H NH-SO Glucosamina N-Solfato 7 3) epimerizzazione. Questo processo interessa l’acido glucuronico e si verifica in due tappe: inizialmente si ha il basculamento di un carbossile in posizione 5 che passa dalla forma D (destrogira) alla forma L (levogira); successivamente si ha l’anomeria, ossia la rotazione dell’OH in posizione 1 dal sito beta in alfa (vedi Fig. 9). Serie D Anomero ß COOH 5 O OH Serie L Anomero α 5 O COOH OH (5-Epimerasi) OH OH ac. α-L-Iduronico ac. ß-D-Glucuronico Fig.9 Epimerizzazione dell'acido Glucuronico (tratto da “L’Héparine” J. P. Duclos). 4) sulfatazione. Avviene a livello dell’idrossile (OH) del carbonio (C) in posizione 2 dell’acido iduronico (vedi Fig. 10). COOH OH O 2 PAPS (O-Sulfotransferasi l) COOH OH OH O OSO3H ac. α-L-Iduronico ac. α-L-Iduronico 2-Solfato Fig.10 Processo di Sulfatazione dell'acido Iduronico (tratto da “L’Héparine” J. P. Duclos). 5) sulfatazione della glucosamina. Si verifica a carico dell’idrossile in posizione 6 (vedi Fig. 11). CH 2OH O OH PAPS (O-Sulfotransferasi lI) CH2OSO3H O OH NH-R (R=CO-CH3 o SO3H) 8 Fig.11 Processo di O-Sulfatazione della Glucosamina (tratto da “L’Héparine” J. P. Duclos). NH-R COOH O COOH O CH2 OH O O O O NHAc COOH O O COOH O O O O O O O COOH O O O S O COOH O O NH S O COOH COOH O Epimerizzazione e sulfatazione dell'ac. Glucuronico ( ac. Idu. Sulfato) CH2 OH O O O O NH S COOH O CH2 OH O O NHAc O NH S CH2 OH O O Epimerizzazione dell'ac. Glucuronico ( ac. Iduronico) CH2 OH O O NHAc CH2 OH O COOH O O O NH S OS O COOH O O NH S NHAc CH2 OH O O N-Sulfatazione della Glucosamina CH2 OH O O O CH2OH O NH S O COOH COOH O CH2 OH O O O NH3 NHAc CH2 OH O O N-Desacetilazione della Glucosamina CH2 OH O O O O NH S COOH O COOH O CH2OH O COOH O O NHAc NHAc CH2 OH O O O O NH3 COOH O CH2OH O O NHAc CH2 OH O O COOH O CH2 OH O O O-Sulfatazione della Glucosamina CH2 OH O O O NH S Fig.12 Biosintesi dell'Eparina: fasi del processo di modificazione della catena principale (tratto da Jacobsson 1980; Lindahl 1977 ab). L’ultima trasformazione biochimica é caratterizzata dal distacco delle catene polisaccaridiche dall’asse proteico per mezzo di una peptidasi e la successiva depolimerizzazione per mezzo di una endoglicosidasi che dà origine a catene con peso molecolare compreso fra i 5000 e i 25000 Daltons. Riassumendo, pertanto, l’eparina é rappresentata da una famiglia di glicosaminoglicani di cui il 60-90% é costituito da sequenze ripetitive di un disaccaride nel quale l’acido L-iduronico (o il suo epimero acido glicuronico) e la D-glucosamina sono connessi da legami glicosidici alfa 1,4. L’acido glucuronico o iduronico possono essere ester-solfatati in posizione 2 (CH - SO3). La glucosamina può essere N-solfatata o N-acetilata, oppure avere il gruppo aminico libero; i suoi gruppi in posizione C3 e C6 possono essere immodificati oppure essere esterificati sotto forma di ester-solfati. Un residuo essenziale ed unicamente presente nell’eparina é la glucosamina con un residuo solfatato in posizione C3; la sua mancanza nella sequenza saccaridica abolisce l’effetto anticoagulante. L’attività anticoagulante della sequenza pentasaccaridica dell’eparina é legata infatti alla sua struttura tridimensionale. La presenza di una unità di glucosamina trisolfato determina una distorsione dell’unità iduronica, facendo assumere al pentasaccaride una configurazione essenziale per il binding con l’AT III (vedi Fig. 13 e 14). 9 O CH2 OSO3 O OH CO 2 O O OH O CH2OSO 3 O SO3 O NH OH NH CO2 O OH AC/SO 3 O CH2 OSO3 O OH O NH OSO3 SO3 SO3 Fig.13 Sito attivo per l’Antitrombina III (tratto da “L’Héparine” J. P. Duclos). O S 2 AT III O O O 6 S O O O S O I A NS, 6S O G O S O 2 3 O A+NS, 3, 6S I 2S A NS, 6S Fig.14 Interazione tra Antitrombina III (AT III) e la sequenza pentasaccaridica specifica del sito attivo dell’eparina (tratto da “Eparina ‘84” B. Casu). L’associazione dell’AT III con l’eparina é molto specifica, inoltre quest’ultima favorisce la deformazione spaziale di AT III e trombina determinando così l’adattamento dell’AT III nel sito attivo serinico della trombina (23). 10 Trombina Antitrombina III ❴ Eparina n=5 n = 18 Fig.15 Complesso ternario fra Eparina, Antitrombina III e Trombina (tratto da “Eparina ‘84” B. Casu). Possono partecipare alla formazione del complesso ternario anche i fattori IXa e XIa, mentre il Fattore Xa fa eccezione: é sufficiente infatti la sua associazione con l’AT III perché si abbia un effetto acceleratore della reazione stessa (17) (Fig. 16). Eparina Antitrombina III Fattore Xa Fig.16 Complesso Eparina Antitrombina III - Fattore Xa. 11 Principale proprietà biologica dell’Eparina Affinché si verifichi la triplice interazione eparina-AT III-proteasi, é necessaria la formazione di un complesso intermedio costituito rispettivamente da eparina-AT III, eparina-proteasi, AT III-eparina-proteasi. In ogni caso il risultato finale é l’accelerazione del legame AT III-proteasi che porta all’inattivazione irreversibile di quest’ultima, mentre la molecola di eparina si rende disponibile per la formazione di un altro complesso. La presenza di un sito ad alta affinità per l’AT III non sembra essere l’unico requisito per l’attività anticoagulante dell’eparina. Infatti, ricerche effettuate su sistemi che permettono lo studio separato dell’inattivazione della trombina da quella del F Xa, hanno mostrato una diversa attività, prevalentemente antitrombinica o anti Xa, a seconda del peso molecolare dell’eparina. Ne deriva che per l’inattivazione della trombina é necessaria una seconda struttura eparinica, oltre a quella richiesta per il legame con l’AT III; l’inattivazione del F Xa invece é possibile con il semplice legame eparina-AT III. In condizioni fisiologiche questa serie di reazioni avviene quasi esclusivamente a livello della superficie endoteliale perché l’AT III trova grandi concentrazioni di glicosaminoglicani eparino-simili. Tali reazioni però, possono anche svolgersi nel plasma qualora la concentrazione di eparina circolante aumentasse fino a superare la capacità di legame da parte dell’endotelio e di neutralizzazione ad opera dei meccanismi a ciò preposti, come accade in corso di terapia eparinica. La regolazione della sua attività anticoagulante avviene a differenti livelli. Il suo legame con la trombina é inibito dal frammento 2 della protrombina. L’inattivazione del F Xa in presenza di fosfolipidi é molto meno rapida di quella del Xa isolato; addirittura il F Xa legato alle piastrine non é inattivato dall’AT III, mentre quest’ultima inibisce l’aggregazione piastrinica indotta dal F Xa. La vitronectina, conosciuta da tempo come proteina S del complemento (proteina regolatrice che inibisce il complesso complementare di attacco alla membrana), annovera numerose attività tra cui l’induzione dell’adesione di varie cellule in coltura e l’interazione con i complessi trombina-AT III e FXa-AT III. In particolare, il legame con il primo complesso induce nella vitronectina una modificazione conformazionale che le fornisce un’aumentata avidità per l’eparina oltre che per il collagene e per alcuni recettori cellulari. In tal modo essa agisce come un inibitore non competitivo dell’inattivazione della trombina e del F Xa da parte dell’AT III e si differenzia dalle altre proteine circolanti capaci di neutralizzare l’eparina in quanto é l’unica che richiede, per questa funzione, una modificazione strutturale. Inoltre l’affinità che la vitronectina acquisisce per i recettori di adesione di alcune linee cellulari (piastrine, cellule endoteliali e fibroblasti) potrebbe favorire l’endocitosi del complesso trombina-AT III con una sua conseguente rapida clearance. Infine l’interazione con l’eparina aumenta notevolmente la suscettibilità alla proteolisi sia della vitronectina che della stessa AT III: un’azione enzimatica svolta principalmente dalla stessa trombina e che potrebbe spiegare la riduzione della concentrazione plasmatica di AT III in corso di terapia eparinica. L’azione anticoagulante dell’eparina si avvale anche di cofattori plasmatici differenti dall’AT III, tra i quali il cofattore eparinico II, una proteina di origine epatica con azione inibente la trombina, ma non il F Xa. 12 Altre proprietà biologiche dell’eparina Oltre ai ben noti effetti anticoagulante ed antitrombotico, l’eparina é in grado di inibire la funzionalità piastrinica e di aumentare la permeabilità delle pareti vasali. Inoltre essa inibisce la proliferazione delle cellule muscolari lisce a livello della parete del vaso (é questa una proprietà antiaterosclerotica dell’eparina, indipendente dalla sua attività anticoagulante); interviene nella regolazione dei processi di angiogenesi ed esercita un’influenza significativa a livello del sistema immunitario. Azione dell’eparina sulle piastrine L’eparina é in grado di diminuire l’iperadesività piastrinica che compare durante gli interventi chirurgici. Sembra determinare un aumento dell’aggregazione da ADP ed adrenalina, ed una diminuizione dell’aggregazione indotta dal collagene e dalla trombina. In corso di trattamento eparinico, in una percentuale considerevole di pazienti (dall’1 al 30%), può verificarsi una trombocitopenia. Nella maggio parte dei casi si tratta di una riduzione modesta (conta piastrinica tra 100000 e 150000/mm3), che insorge da cinque a dieci giorni dopo l’inizio del trattamento senza conseguenze cliniche. E’ rapidamente reversibile con la sospensione del farmaco. Il meccanismo patogenetico non é completamente conosciuto. Tuttavia, in un ridotto numero di casi, la trombocitopenia può essere più marcata (conta piastrinica inferiore a 100000/mm3) e, in alcuni casi, può associarsi a trombosi arteriose acute (coronariche, cerebrali, periferiche) talora fatali, o a coagulazione intravascolare disseminata fulminante. Generalmente il calo nella conta piastrinica si rende manifesto entro venti giorni dall’inizio della terapia; secondo recenti acquisizioni sembra non correlare in alcun modo con l’origine estrattiva dell'eparina, con le dosi o con la via di somministrazione. In passato, invece, la provenienza da polmone bovino, le dosi elevate e la via endovenosa sembravano essere le principali responsabili della trombocitopenia. Gli studi sulla trombocitopenia da trattamento eparinico hanno evidenziato una proporzionalità inversa tra caduta del numero delle piastrine e la loro attivazione. L’infusione di eparina per via endovenosa, infatti, indurrebbe la formazione di aggregati piastrinici reversibili. Nei pazienti con trombocitopenia é stata descritta, in vitro, aggregazione piastrinica eparino-dipendente (1, 2, 6, 9, 33, 34). La formazione intravasale di aggregati piastrinici provocherebbe una diminuizione della conta piastrinica nel sangue periferico e, contemporaneamente, la tendenza a complicanze tromboemboliche (31). In questi casi il tentativo di aumentare il dosaggio dell'eparina non é seguito da alcun risultato perché la liberazione del fattore piastrinico IV provoca la neutralizzazione dell’eparina stessa. Ackroyd e Schulman hanno identificato in meccanismi di tipo immunoallergico la piastrinopenia indotta da eparina (Tab. 1). 13 IPOTESI DI ACKROYD EPARINA + MEMBRANA PIASTRINICA + C' IPOTESI DI SCHULMAN IMMUNOCOMPLESSI + MEMBRANA PIASTRINICA + C' AGGREGAZIONE E LISI PIASTRINICA PIASTRINOPENIA EMORRAGIE LIBERAZIONE DEI FATTORI PROCOAGULANTI ( TxA 2 , FPIII...) NEUTRALIZZAZIONE EPARINICA (FP IV) TROMBOEMBOLIE Tab.1 Meccanismi patogeni ipotizzati nelle trombocitopenie indotte da eparina. Secondo l’ipotesi di Ackroyd (1964) la fissazione del farmaco ad una proteina piastrinica mediante un legame labile, porterebbe alla formazione di un antigene completo verso cui l’organismo si sensibilizza. Recentemente é stata indicata la glicoproteina Ib (Gp Ib) della membrana piastrinica come probabile sito di legame per l’eparina. Tuttavia le prove con eparina marcata hanno evidenziato che il legame avviene anche con piastrine di pazienti affetti da tromboastenia di Glanzmann e da sindrome di Bernard Soulier, patologie caratterizzate rispettivamente da carenze di Gp IIb/IIIa e Gp Ib. Secondo Schulman (1964) invece, il farmaco agisce da aptene combinandosi con una molecola proteica plasmatica. Il complesso farmaco-proteina plasmatica in quanto antigene completo, é capace di stimolare la formazione di anticorpi. Ad una successiva somministrazione del farmaco, l’anticorpo si combina con l’antigene formando un immunocomplesso che legatosi a recettori di membrana per l’Fc delle IgG, induce attivazione delle piastrine e forse la loro lisi complemento-mediata. Le piastrine pertanto sono coinvolte in una reazione immunologica come testimoni innocenti. Tali ipotesi sono avvalorate dai numerosi casi di pazienti con alti livelli di IgG associate alle piastrine. In particolare sono state riscontrate IgG in grado di legarsi a pistrine di controllo in presenza di eparina e di provocare rilascio di serotonina, aggregazione e danno immunitario piastrinico eparino-dipendenti. 14 Azione antiaterosclerotica dell’Eparina L’eparina é in grado di inibire l’effetto mitogeno del PDGF (Platelet Derived Growth Factor), un fattore di crescita proteico, liberato dalle piastrine attivate in seguito a danno endoteliale. Questo fattore stimola l’infiltrazione di monociti e macrofagi nella lesione, quindi la migrazione e poi la proliferazione delle cellule muscolari lisce del sottoendotelio, con formazione della placca aterosclerotica. Un importante effetto dell’eparina sul metabolismo lipidico, si ha con lo spiazzamento della lipoproteinlipasi ancorata all’intima endoteliale, che viene così immessa nel torrente circolatorio dove, una volta attivata, svolge la sua azione “chiarificante” con lipolisi delle lipoproteine (trigliceridi, chilomicroni, VLDL, con formazione di acidi grassi liberi, glicerolo, mono- e digliceridi). E’ fondamentale che questa azione si svolga nel plasma, perché in tal modo si riduce la concentrazione di particelle ricche in colesterolo a livello della parete vasale. Azione sui meccanismi di angiogenesi L’eparina é in grado di interferire nei processi di angiogenesi che si verificano, oltre che nelle patologie neoplastiche, anche nell’infiammazione, nella riparazione delle ferite, nella formazione del corpo luteo e nello sviluppo dell’embrione. L’esatto meccanismo di questa specifica azione dell’eparina non é ancora ben definito, anche se sembra essere prevalentemente di tipo inibente sui fattori angiogenetici. Lo sblocco delle mitosi che si verifica dopo una lesione, potrebbe essere determinato da uno squilibrio tra azione inibente dell’eparina e azione dei mitogeni. Probabilmente, a livello dell’endotelio danneggiato si ha una diminuita quota di eparina o per una ridotta secrezione da parte delle cellule endoteliali stesse o per una inibizione da parte del fattore piastrinico IV. Tuttavia é stata identificata un’attività eparinica favorente le mitosi: sembrerebbe infatti che l’eparina possa potenziare l’azione dell’ECGF (Endothelial Cell Growth Factor), un mitogeno per le cellule endoteliali. Azione dell’Eparina sul sistema immunitario L’eparina ha mostrato in vitro numerose attività antimmunitarie. Essa é in grado di determinare: 1) attivazione dei macrofagi, probabilmente attraverso un aumento della produzione di interferone (35); 2) inibizione della chemiotassi dei macrofagi e dei neutrofili, impedendo l’adesione dei neutrofili alle cellule endoteliali (44), degradando l’anafilotossina C3a, inibendo il MIF (fattore inibente la migrazione), inibendo la deposizione di fibrina. Infatti quest’ultima non può formare una rete attorno ai macrofagi poiché l’eparina bloccando la fibronectina -16 impedisce la formazione del citoscheletro (16); 3) inibizione della liberazione di molti enzimi lisosomiali, interferendo così sugli aspetti funzionali e metabolici dei fagociti; 4) inibizione della reazione allergica attraverso un’azione diretta sull’istamina, la serotonina, la bradichinina o la PG F2alfa; 15 5) inibizione di alcuni fattori del complemento: inibizione del C1q per interazione diretta, del legame C4-C2 e C1s, potenziamento del C1 inattivatore, degradazione della anafilotossina C3a (13). Contrariamente a queste attività inibenti, in vivo l’eparina sembrerebbe determinare una maggior resistenza alle infezioni, un’attività antimicrobica diretta e un’azione terapeutica nei confronti di varie malattie infettive e autoimmuni (17). In considerazione di questi effetti contrastanti, é difficile verificare un’azione terapeutica antinfettiva efficace dell’eparina. Si può invece pensare ad un suo ruolo immunoregolatore. Azione dell’Eparina sul sistema Fibrinolitico L’eparina possiede un’attività favorente la fibrinolisi. Secondo Vairel e coll. (42) e Vinazzer e coll. (45), l’effetto attivatore sul sistema fibrinolitico, sia dell’eparina standard che di quella a basso peso molecolare, causa un accorciamento del tempo di lisi delle euglobuline ed un aumento dell’area di lisi su piastre di fibrina. Inoltre é stato evidenziato un aumento del tasso plasmatico di t-PA, la cui liberazione da parte dell’endotelio vasale, sarebbe favorita dall’eparina. In considerazione di tutto ciò l’eparina rappresenterebbe il farmaco di scelta non solo per la profilassi della trombosi stabilizzata, ma anche nelle condizioni di ipercoagulabilità, causate da un’alterata liberazione del t-PA, e che spesso determinano trombosi venose recidivanti. 16 Origini dell’Eparina Due sono gli organi da cui viene attualmente estratta l’eparina: il polmone di bue e l’intestino di maiale. L’eparina di estrazione bovina ha un’attività anticoagulante di circa il 20-30% più debole di quella derivata dall’intestino. Tuttavia, nel prodotto finale questa differenza viene annullata poiché il prodotto é titolato in unità biologiche. A parità di unità biologiche, l’eparina derivata dall’ intestino di maiale ha un’attività anti FXa più elevata. L’eparina può essere coniugata con sali di calcio o sali di sodio . L’eparina calcica, a differenza di quella sodica, ha un effetto acceleratore della coagulazione. In quanto la quota di calcio presente non modifica la cascata enzimatica, ma é in grado di influenzare favorevolmente la formazione del complesso ternario AT III- trombina- eparina. Farmacocinetica dell’eparina La farmacocinetica dell’eparina é differente a seconda della via di somministrazione prescelta che può essere endovenosa o sottocutanea. La via orale non viene ultilizzata poiché l’eparina non viene assorbita dal tratto gastrointestinale. Inoltre, in considerazione della particolare polarità della molecola, essa non supera la barriera ematoencefalica e non passa nelle secrezioni ghiandolari. Via venosa Dopo iniezione endovenosa l’eparina viene eliminata dal compartimento plasmatico attraverso due meccanismi: uno cellulare saturabile, ed uno renale non saturabile, in funzione delle dosi somministrate. In questo caso l’emivita é di 60-90 minuti, e risulta prolungata in caso di insufficienza renale. La concentrazione plasmatica del farmaco risente della volemia e dell’ematocrito, per cui uno stato di anemia o di poliglobulia può provocare degli squilibri. L’eparina si lega alle proteine plasmatiche e subisce un’ulteriore ripartizione: una frazione si fissa all’endotelio vasale che rappresenta il sistema cellulare di clearance; una frazione si lega all’AT III e rappresenta così la parte biologicamente attiva; una frazione, infine, per le sue caratteristiche basiche, viene neutralizzata da fibrinogeno, lipoproteine, fattore IV piastrinico, glicoproteina ricca in istidina (HRGP), vitronectina, o, in ambito terapeutico, dal solfato di protamina. Questi sistemi di neutralizzazione e di “binding” hanno una notevole variabilità individuale e giocano un ruolo fondamentale nel meccanismo di eliminazione iniziale dell’eparina dal circolo ematico. Infatti, solo dopo aver saturato detti sistemi, l’aumento della sua concentrazione in circolo diventa lineare. La saturabilità di questi meccanismi giustifica il fatto che l’emivita dell’eparina é dose-dipendente e il volume di distribuzione corrisponde al volume plasmatico. Per questo motivo é ragionevole scegliere un dosaggio iniziale in base al peso corporeo o alla superficie corporea. Per studiare la cinetica d’azione dell’eparina nel sangue, sono state impiegate diverse metodiche: l’APTT o tempo di cefalina con caolino, il tempo di trombina, l’attività anti FXa. 17 Esistono però delle variazioni individuali che a parità di dose somministrata non permettono una comparazione tra i vari metodi. Importanti da tenere in considerazione sono le curve di eliminazione dell’eparina, che variano in base alla dose somministrata, oltre che all’emivita dell’eparina stessa. Pertanto se introdotta in circolo a piccole dosi, l’eparina viene catturata dalla cellula di Kupffer del fegato ove subisce un processo di desolfatazione e di depolimerizzazione: i prodotti di degradazione ripassano nel sangue e vengono eliminati dall’emuntorio renale. Se vengono somministrate dosi elevate, allora essa viene catturata, oltre che dal fegato, anche dalla milza, dai polmoni, dai reni e dai macrofagi circolanti. Pertanto una parte viene metabolizzata e una immagazzinata. EPARINA TOTALE EPARINA LIBERA AT III ALBUMINE GLOBULINE FIBRINOGENO FATT. 4 PIASTRINICO Glicoproteina ricca di istidina PROTAMINA Vitronectina Eparina attiva PARETI VASCOLARI (Eparina stoccata) Eparina neutralizzata Tab.2 Ripartizione dell'eparina nel sangue dopo iniezione endovenosa. Questi sistemi di neutralizzazione e di “binding” hanno una notevole variabilità individuale e giocano un ruolo fondamentale nel meccanismo di eliminazione iniziale dell’eparina dal circolo ematico. Infatti, solo dopo aver saturato detti sistemi, l’aumento della sua concentrazione in circolo diventa lineare. La saturabilità di questi meccanismi giustifica il fatto che l’emivita dell’eparina é dose-dipendente e il volume di distribuzione corrispondente al volume plasmatico. Per questo motivo é ragionevole scegliere un dosaggio iniziale in base al peso o alla superficie corporea. Si é parlato dell’opportunità di scegliere dosi di eparina in relazione al peso corporeo; tuttavia nei soggetti obesi si verifica quasi paradossalmente un aumento dell’eparinemia se la dose viene calcolata in base al peso corporeo. Per avere un’eparinemia situata in zona terapeutica é necessario conoscere il peso ideale di quel paziente obeso, oppure valutare altri parametri biologici, ad esempio il tasso di fibrinogeno. 18 Per avere quindi un’eparinemia costante sarebbe opportuno procedere ad iniezioni frequenti, con notevoli disagi per il paziente e per l’operatore, con il rischio di determinare soprattutto dei picchi di ipocoagulabilità. E’ preferibile pertanto ricorrere all’infusione continua, possibilmente con l’uso di pompe peristaltiche dopo la somministrazione di una dose iniziale in bolo. Nell’intervallo di 60 minuti si raggiungerà il range terapeutico. Eparinemia Endovena Controllo perfusione Tempo (ore) 1h 2h 3h 4h 6h Fig.16 Eparinemia dopo iniezione endovenosa e dopo infusione endovenosa continua (tratto da “L’Héparine” J. P. Duclos). Eparinemia (unità/ml) 5 4 3 2 30.000 UI (400 UI/Kg) T 1/2=2h 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 15.000 UI (200 UI/Kg) T 1/2=1h e 30' 0,4 Zona Terapeutica 0,3 10.000 UI 0,2 5000 UI 0,1 1000 UI 1 7500 UI (100 UI/Kg) T 1/2=1h Tempo (ore) 2500 UI 2 3 Fig.17 Eparinemia dopo iniezione endovenosa (tratto da L’Héparine” J. P. Duclos). 4 19 Il comportamento dell’eparina a basso peso molecolare é differente rispetto all’eparina non frazionata. Essa viene eliminata quasi esclusivamente attraverso il filtro renale ed é indipendente dalle dosi somministrate; il tempo di dimezzamento é due volte più lungo rispetto a quello dell’eparina non frazionata ed é ulteriormente allungato nei soggetti con compromissione della funzionalità renale. Dopo somministrazione di eparina a basso peso molecolare si hanno differenti curve di eliminazione, a seconda che si utilizzi la via endovenosa o la via sottocutanea oppure si usino dosi diverse. Infatti, valutando la cinetica dell’eparina a basso peso molecolare somministrata sottocute, si può osservare come la combinazione del lento assorbimento e della lenta eliminazione, condizionino un’emivita maggiore rispetto a quella dell’eparina non frazionata (12). Essa possiede inoltre una maggiore biodisponibilità (90% contro 30%) e pertanto un notevole vantaggio ai fini dell’impiego farmacologico. E’ sufficiente una sola iniezione al dì per la profilassi della trombosi venosa profonda post-operatoria e dell’embolia polmonare, anziché le due o tre iniezioni giornaliere di eparina non frazionata. L’azione anticoagulante si può avere con due iniezioni sottocute di eparina a basso peso molecolare anziché con infusione continua o intermittente di eparina non frazionata. Via sottocutanea Dopo somministrazione sottocutanea il picco plasmatico si ha alla terza ora; il valore così ottenuto rimane pressoché costante sino alla settima ora, quindi l’eparinemia diminuisce gradatamente fino a non essere più determinabile dopo la tredicesima ora (Fig. 18). Anche per la via di somministrazione sottocutanea dell’eparina non frazionata, valgono tutte le variazioni individuali precedentemente descritte. Il range terapeutico compreso tra tra 0.2 e 0.5 U di eparina per ml di plasma può essere raggiunto in tempi diversi e con dosi diverse. 100 10 1 S.C. E.V. 0.1 0 20 100 200 300 400 500 Minuti Fig.18 Eparinemia media dopo iniezione di Eparina sottocute. Il monitoraggio dell’eparina effettuato per valutare la costante concentrazione ematica del farmaco prevede prelievi a 5 e 7 ore dalla iniezione se si effettuano due somministrazioni quotidiane di eparina, e dopo 4-6 ore se le somministrazioni giornaliere sono tre. Anche nel caso di somministrazioni di eparina a scopo profilattico é comunque raccomandato il monitoraggio dei test di laboratorio e del paziente, in considerazione delle variazioni individuali sopra descritte che potrebbero influenzare la cinetica dell’eparina. Riguardo all’eliminazione, si é visto che l’endotelio vasale é in grado di fissare maggiormente l’eparina quando viene somministrata per via sottocutanea rispetto alla via venosa. Questo spiegherebbe la continua protezione che si verifica somministrando piccole dosi di eparina, in quanto essa viene accumulata e “stoccata” nell’endotelio vasale conferendogli quella carica elettronegativa necessaria per mantenere ed aumentare la sua atrombogenicità (14-27). L’eparina nella formulazione di sale sodico somministrata sottocute diffonde velocemente provocando dei picchi di eparinemia assai elevati, mentre l’eparina calcica,diffondendo più lentamente e più regolarmente, viene captata immediatamente dalle cellule endoteliali, legandosi ad esse con un meccanismo recettoriale ad alta affinità. La captazione é funzione più del tempo di esposizione che delle concentrazioni plasmatiche. Infatti se vengono somministrate alte dosi di eparina per via endovenosa, la quota di farmaco legata all’endotelio é piccola e indipendente dalla dose iniettata e un’alta quota viene eliminata dal plasma attraverso il fegato e il rene; invece dopo somministrazione sottocutanea di eparina calcica questa viene ceduta progressivamente dal sito di iniezione e le concentrazioni plasmatiche non raggiungono la soglia di eliminazione epatica e renale. Quindi l’eparina calcica somministrata sottocute rimane più a lungo adesa all’endotelio, ove raggiunge concentrazioni maggiori rispetto a quelle ottenute per via endovenosa. Questa maggior affinità per l’endotelio é più evidente se l’eparina viene somministrata a basse dosi. Con l’aumentare della dose si raggiunge la saturazione dei recettori endoteliali, per cui la concentrazione plasmatica sale rapidamente. Questi concetti sono alla base della profilassi antitrombotica con eparina, durante la quale non si osservano generalmente alterazioni dei processi coagulativi indotte dal farmaco e vengono così ridotti rischi emorragici importanti per il paziente. Ciò vale soprattutto per i soggetti “iperresponders”. Eparine a basso peso molecolare La farmacocinetica dell’eparina a basso peso molecolare é diversa rispetto a quella dell’eparina non frazionata. Essa viene eliminata quasi esclusivamente attraverso il filtro renale ed é indipendente dalle dosi somministrate; il tempo di dimezzamento é due volte più lungo rispetto a quello dell’eparina non frazionata ed é ulteriormente allungato nei soggetti con compromissione della funzionalità renale. Le curve di eliminazione dell’eparina a basso peso molecolare sono differenti in base alla via di somministrazione ed alle dosi. 21 Infatti, valutando la cinetica dell’eparina a basso peso molecolare somministrata sottocute, si può osservare come la combinazione del lento assorbimento e della lenta eliminazione, condizionino un’emivita maggiore rispetto a quella dell’eparina non frazionata (12). Essa possiede inoltre una maggior biodisponibilità (90% contro 30%) e pertanto un notevole vantaggio ai fini dell’impiego farmacologico. E’ sufficiente una sola iniezione al dì per la profilassi della trombosi venosa profonda post-operatoria e dell’embolia polmonare, anziché le due o tre iniezioni giornaliere di eparina non frazionata. L’azione anticoagulante si può avere con due iniezioni sottocute di eparina a basso peso molecolare anziché con infusione continua o intermittente di eparina non frazionata. Purtroppo alla stato attuale non esistono standard di riferimento per queste nuove eparine: questo fa si che un’eparina a basso peso molecolare non sia sovrapponibile quantitativamente ad un’altra, condizionando in tal modo l’impiego routinario di questo farmaco. Per studiare la cinetica d’azione dell’eparina nel sangue, sono state impiegate diverse metodiche: l’aPTT o tempo di cefalina, il tempo di trombina, l’attività anti FXa. Esistono però delle variazioni individuali che a parità di dose somministrata non permettono una comparazione tra i vari metodi. 22 Uso clinico dell’eparina L’eparina può essere impiegata sia a scopo preventivo, nella profilassi antitrombotica, che come farmaco anticoagulante vero e proprio nella patologia tromboembolica in atto. Per quanto riguarda il suo uso a fini profilattici, essa é indicata nella prevenzione della trombosi venosa profonda (TVP) e dell’embolia polmonare (EP), nella prevenzione del reinfarto, nella prevenzione delle trombosi in corso di circolazione extracorporea o di emodialisi, durante la gravidanza in alternativa agli anticoagulanti orali per controllare lo stato di ipercoagulabilità che si viene a creare in questa particolare condizione. Recenti studi hanno prospettato nuove indicazioni cliniche dell’eparina basata sulla sua azione inibitrice sui processi di espansione metastatica. Prevenzione della trombosi venosa profonda e dell’embolia polmonare Sono ormai numerose le dimostrazioni dell’efficacia dell’eparina nella prevenzione della TVP post-operatoria e dell’EP (8, 18, 19, 21). La prima ampia sperimentazione effettuata in tal senso fu l’International Multicentre Heparin Trial (Kakkar 1975 20) condotto su 4121 pazienti di eta’ superiore ai 40 anni, sottoposti ad importanti interventi di chirurgia generale, distribuiti in 28 centri di 11 Paesi differenti e suddivisi in un gruppo di controllo (2076) ed in un gruppo di trattati (2045). A questi ultimi furono somministrate 5000 UI di eparina calcica due ore prima dell’intervento ed ogni otto ore nei sette giorni successivi, oppure sino alla mobilizzazione, mentre nei controlli non fu praticata alcuna profilassi specifica. Per quanto riguarda l’incidenza di EP, la profilassi con eparina calcica determinò una notevole diminuzione dei decessi legati a tale complicanza: 3.7% nel gruppo dei trattati contro il 22% nei controlli. Altrettanto si può dire della frequenza di TVP evidenziate con test al fibrinogeno marcato con I 125: il test era positivo nel 24.6% dei controlli, Altrettanto si può dire della frequenza di TVP evidenziate con test al fibrinogeno marcato con I 125: il test era positivo nel 26.6% dei controlli, contro il 7.7% dei trattati. In questi ultimi inoltre le TVP erano anche meno estese e raramente bilaterali. L’importanza di questo studio é consistita, inoltre, nell’aver evidenziato il mancato aumento del rischio emorragico nei pazienti trattati rispetto ai controlli. Queste conclusioni furono confermate anche da numerosi altri autori. In particolare Colditz et al. nel 1986 (7) condussero una ricerca di metanalisi esaminando 59 studi compresi tra il 1976 e il 1984, relativi all’impiego della profilassi con eparina calcica e altri sistemi di prevenzione della TVP post-operatoria (compressione pneumatica, didroergotamina, calze elastiche). 23 Schemi sull’incidenza di TVP (Trombosi Venosa Profonda) postoperatoria (le seguenti tabelle sono tratte da: Colditz et. al. “Lancet” July 19, 1986 p. 149-146) Studio Disegno "in cieco" Valutazione Percentuale di TVP 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 No No Doppio No Doppio No Semplice No Doppio No Doppio No No No Doppio Semplice Doppio Doppio No No No Doppio No 12/29 21/50, 21/50 17/39 3/62 6/54 47/128 5/52 164/667 10/19 39/89 10/50 66/412 52/101 36/100 6/44 5/24 11/48 20/61 29/99 14/66 14/58 22/90 7/44 37 38 39 40 41 42 No No Semplice No No No TCF-1 TCF-3 TCF-2 TCF-1 TCF-1 TCF-1 TCF-2 TCF-1 Flebografia TCF-3 TCF-3 TCF-2 TCF-1 TCF-1 TCF-3 TCF-1 TCF-1 TCF-4 TCF-3 TCF-1 TCF-4 TCF-1 TCF-2 +Flebografia TCF-1 TCF-1 TCF-1 TCF-1 TCF-1 TCF-2 23/47 1/50 4/92 37/103 15/50, 8/20 4/57 TCF= Test di captazione del Fibrinogeno marcato con 1125. TCF-1 quotidianamente per 7 giorni; TCF-2 quotidianamente per più di 7 giorni; TCF-3 a giorni alterni fino a 7 giorni; TCF-4 a giorni alterni > 7 giorni; TCF-5 un solo test dopo 7 giorni; TCF-6 non specificato. Q di Cochran - 365 su 30 gradi di libertà; incidenza media 27,0% (95% di limiti di confidenza: 21,9%; 32,1%). Tab. 3a: Percentuale di TVP in pazienti non sottoposti a profillassi. 24 Studio Disegno in cieco Dose di Eparina in UI (intervallo tra le dosi) 14 15 16 43 17 19 20 21 22 23 24 26 44 28 29 30 31 32 45 33 34 46 No No Doppio No No No Semplice No Doppio No Doppio No No Doppio Semplice Doppio Doppio No No No No No 5000 (6 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (8 h) 75 UI/Kg (12 h) 5000 (8 h) 5000 (12 h) 5000 (8 h) 5000 (8 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (8 h) 5000 (8 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (8 h) 47 48 49 50 51 35 18 25 No No No Semplice No Doppio Doppio No 5000 (8 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (8 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (12 h) 5000 (8 h) Valutazione Percentuale di TVP TCF-1 TCF-3 TCF-2 TCF-3 TCF-1 TCF-1 TCF-2 TCF-1 Flebografia TCF-3 TCF-3 TCF-1 TCF-1 TCF-3 TCF-1 TCF-1 TCF-4 TCF-3 TCF-1 TCF-1 TCF-4 TCF-4 +Flebografia TCF-1 TCF-1 TCF-1 TCF-1+doppler TCF-3 TCF-1 TCF-1 TCF-2 4/27 7/52, 4/48 3/39 2/55 4/63 15/128 4/53 48/625 7/22 12/79 3/50 5/54 12/94 0/44 6/28 3/49 10/63, 10/43 14/100 4/98 3/42 6/53 2/115 2/64 20/85 12/98 7/75 8/50 32/190 2/58 17/362 Q di Cochran = 115 su 31 gradi di libertà; incidenza media semi-ponderata = 9,6% (7,2%; 11,9%). Tab. 3b: Percentuale di T.V.P. in pazienti sottoposti a profilassi con Eparina. 25 Studio Disegno in cieco 36 No 52 37 No No 38 40 53 54 39 No No No No Semplice Trattamento Sotto al ginocchio fino alla dimissione NS Alla coscia fino a completa deambulazione Alla coscia fino alla dimissione Alla coscia fino alla dimissione Alla coscia fino alla dimissione NS Altezza NS: fino alla dimissione Valutazione Percentuali di TVP TCF-2 + Flebografia TCF-2 TCF-1 4/51 29/122 11/48 TCF-1 TCF-1 TCF-3 TCF-2 TCF-1 4/50 15/97 4/39 1/21 0/104 Q di Cochran = 70 su 7 gradi di libertà; incidenza media semi-ponderata - 11,1% (5,3%; 16,8%). NS = non specificato. Tab. 3c: Percentuali di T.V.P. in pazienti con calze elastiche a compressione graduale. Studio Disegno in cieco 41 29 No Semplice 48 55 No Semplice 42 54 No No Trattamento Valutazione Al ginocchio fino alla deambulazione Al ginocchio fino alla dimissione TCF-1 TCF-1 + Flebografia Al ginocchio 24h dopo l'intervento TCF-1 Fino al trasferimento, TCF-1 + dalla guarigione Flebografia Al ginocchio fino alla deambulazione TCF-2 NS TCF-2 + Flebografia Percentuali di TVP 6/50, 1/20 1/29 37/84, 37/84 5/50 6/62 2/16 Q di Cochran = 77 su 7 gradi di libertà; incidenza media = 17,6% (6,1%; 29,1%). Tab. 3d: Percentuali di T.V.P. in pazienti sottoposti a profilassi con mezzi compressivi. Studio Disegno in cieco Trattamento Eparina (UI) DIE (mg) 45 46 35 No No Doppio 50 Semplice 2500 2500 2500 5000 5000 0,5 (8 h) 0,5 (8 h) 0,5 (12 h) 0,5 (12 h) 0,5 (12 h) Valutazione Percentuali di TVP TCF-1 TCF-1 TCF-1 TCF-1 + doppler 3/49 4/61 32/190 117/181 7/76 Q di Cochran = 7,6 su 3 gradi di libertà; incidenza media semi-ponderata - 9,9% (6,2%; 13,6%). Tab. 3e: Percentuali di T.V.P. in pazienti trattati con Eparina + Diidroergotamina (D.I.E). 26 Studio 56 57 Disegno in cieco Trattamento Valutazione Percentuali di TVP No No Altezza NS; indossate dopo l'intervento Altezza NS; fino alla dimissione TCF-1 TCF-1 2/122 3/20 Q di Cochran = 2,4 su 1 grado di libertà; incidenza media semi-ponderata = 6,3% (0%; 17,6%). Tab. 3f: Percentuali di T.V.P. in pazienti trattati con Eparina + calze elastiche a compressione graduale. Studio 52 52 57 Disegno in cieco Trattamento Valutazione Percentuali di TVP No No No CPI fino alla coscia per 72h minimo CPI fino alla coscia per 72h minimo CPI fino alla coscia fino al 5° giorno TCF-3 TCF-3 TCF-1 1/38 3/50 1/24, 3/25 Q di Cochran = 2,0 su 3 gradi di libertà; incidenza media ponderata = 4,5% (1,1%; 8,0%). Le calze sono state indossate fino alla dimissione in tutti i 3 studi. Tab. 3g: Percentuali di T.V.P. in pazienti trattati con compressione intermittente + calze elastiche a compressione graduale. Dall’analisi dei risultati si deduce che nei soggetti non sottoposti a profilassi, l’incidenza di TVP post-operatoria,diagnosticata con il test di captazione del fibrinogeno marcato con I 125 (TCF) o con flebografia era pari al 27%, mentre la diagnosi veniva posta clinicamente solo nel 3% dei casi. La profilassi iniziata prima dell’intervento somministrando eparina ogni dodici ore (19 studi) o ogni otto ore (10 studi), dava un’incidenza del 9.6%. Negli 8 studi che hanno valutato l’uso delle calze e la compressione graduale l’incidenza media della TVP era dell’11%. Nei 6 studi in cui si valutava la sola compressione graduale l’incidenza era del 17.6%. L’associazione di più trattamenti, sebbene effettuati in un numero esiguo di pazienti, ha mostrato i seguenti risultati: eparina + dididroergotamina permetteva di ottenere un’incidenza di TVP del 9.9%; con l’associazione di eparina + calze elastiche e compressione graduale l’incidenza di TVP era del 6.3%; con l’associazione di eparina + compressione pneumatica l’incidenza era del 4.5%. In conclusione, questi risultati, sottolineano l’utilità di praticare la profilassi eparinica nei pazienti candidati ad interventi importanti di chirurgia generale. In chirurgia ortopedica, in pazienti operati di protesi d’anca, le complicanze di TVP ed EP si presentano molto più elevate (24, 37) con un’incidenza del 50% di TVP e del 10% di EP e con una mortalita’ dell’1-2% (pazienti operati di protesi d’anca). 27 In questi casi l’uso dell’eparina a basse dosi riduce l’incidenza di TVP ma il rischio rimane elevato poiché legato a manovre traumatizzanti dell’atto chirurgico (torsione del peduncolo arteriofemorale). Sembrerebbe più efficace un trattamento “personalizzato” piuttosto che con dosi prestabilite di eparina, anche se é probabile che dosi minime di anticoagulanti orali abbiano un’efficacia più elevata in pazienti sottoposti ad interventi di chirurgia ortopedica maggiore. Risultati incoraggianti sono stati ottenuti con l’associazione di eparina ed antiaggreganti o diidroergotamina. Autori FLICOTTEAUX et coll. (1976) SAGAR et coll. (1976) SCHÖNDORF et HEY (1976) ROGER et coll. (1978) Trattamenti N° Pazienti Operati Protesi d’anca Percentuale di Trombosi Eparina Eparina+Aspirina Controlli Eparina Eparina +DHE Controlli Aspirina Eparina+Aspirina Controlli Eparina+ Sulfinpirazone 20 20 32 25 25 15 30 30 37 36 20 20 69 32 16 60 53 27 51 36 DHE: Diidroergotamina Tab. 4: Prevenzione della Trombosi Venosa Profonda (TVP) postoperatoria nelle protesi d'anca: associazioni farmacologiche (tratto da “L’Héparine” J.P. Duclos). Prevenzione del reinfarto L’eparina calcica somministrata a basse dosi per via sottocutanea, grazie al potenziamento dei meccanismi fisiologici antitrombotici senza interferire nelle reazioni coagulative, offre importanti vantaggi terapeutici, soprattutto nella limitazione dell’estensione dell’infarto miocardico e nella prevenzione delle sue recidive. A questo proposito é interessante ricordare lo studio italiano multicentrico, durato 2 anni, coordinato da Neri Serneri (26) in cui sono stati reclutati 728 pazienti, ripartiti in due gruppi: 363 sono stati trattati con una singola dose pari a 12500 UI di eparina calcica al dì, per via sottocutanea 365 pazienti costituivano il gruppo di controllo. Il tasso di recidiva di infarto era del 63% inferiore nel gruppo trattato rispetto ai controlli; inoltre la mortalità generale era ridotta del 48% e quella cardiovascolare del 33% nei trattati rispetto ai controlli. 28 Profilassi dello stato trombofilico in gravidanza e puerperio La gravidanza é una condizione caratterizzata da ipercoagulabilità dovuta ad un aumento dei fattori della coagulazione (soprattutto fibrinogeno, fattori VII, VIII, IX, X) favorita inoltre dalla stasi venosa degli arti inferiori secondaria alla compressione della vena cava inferiore da parte dell’utero gravidico, oltre che dall’azione ipotonizzante del progesterone sulle pareti venose. Nel caso in cui si aggiungano ulteriori fattori di rischio, quali l’immobilità prolungata, un’infezione, un trauma, l’obesità, precedenti tromboembolici, interventi chirurgici, é doveroso sottoporre la gestante ad un trattamento profilattico. Almeno due caratteristiche rendono l’eparina un farmaco particolarmente adatto a questo scopo: essa non passa nella circolazione fetale poiché non attraversa la barriera placentare, al contrario di altre sostanze anticoagulanti che quindi esporrebbero il feto al rischio di gravi emorragie. Inoltre la sua azione é diretta prevalentemente in senso antitrombotico, mentre quella sui meccanismi emostatici propriamente detti é trascurabile, soprattutto con basse dosi e comunque l’effetto é rapidamente reversibile. Essa quindi é in grado di modulare finemente il delicato equilibrio emostatico della gravidanza in cui senz’altro lo stato trombofilico presente può portare a gravi conseguenze ma, nel contempo, la deposizione intravascolare di fibrina (almeno nel distretto deciduo-placentare) ed il potenziamento dei meccanismi deputati all’arresto delle emorragie in previsione del parto, hanno un loro ruolo essenziale (36). La profilassi antitrombotica con eparina in gravidanza, si applica nella prosecuzione di una terapia anticoagulante orale e nella prevenzione della malattia tromboembolica nei soggetti a rischio, nella CID (eclampsia-gestosi, ritenzione di feto morto), nell’iposviluppo fetale da insufficienza placentare nei casi con anamnesi significativa (riscontri ripetuti di insufficienza feto-placentare, distacco precoce di placenta normalmente inserita, morte intrauterina del feto) o con evidenza di fattori di rischio quali ipertensione arteriosa, diabete, vasculiti. Soprattutto in quest’ultima indicazione il trattamento deve essere iniziato già nelle prime settimane di gestazione ed andrà proseguito nel puerperio. Il dosaggio orientativo é di 5000 UI sottocute ogni 8-12 ore. Eparina e tumori: nuove possibili indicazioni terapeutiche. Numerosi studi hanno indagato i meccanismi di diffusione metastatica dei tumori con l’intento di trovare terapie in grado di intervenire su questo processo. Si è osservato che l’angiogenesi svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo delle metastasi. Pertanto la regolazione dei processi di angiogenesi ed in particolare il controllo della sintesi o dell’attività dei peptidi coinvolti in questo processo, rappresentano un nuovo approccio per limitare l’espansione del tumore metastatico. Infatti da uno studio condotto su topi è emerso che la combinazione di alte dosi di cortisone ed eparina ha prodotto una notevole inibizione della formazione di nuovi vasi, una riduzione delle dimensioni della massa principale dei tumori e della diffusione metastatica. 29 Inoltre numerosi studi retrospettivi sulla mortalità di pazienti oncologici trattati con eparina hanno evidenziato che l’eparina a basso peso molecolare sembra avere un effetto inibitorio sullo sviluppo delle masse tumorali in misura superiore rispetto all’eparina classica. Probabilmente l’eparina LMWH può penetrare più agevolmente nelle cellule, grazie alle sue dimensioni ridotte, svolgendo un’efficace azione antineoplastica. Si è osservato che anche la Suramina può inibire l’espansione metastatica. L’interazione tra le cellule e le proteine adesive della matrice extracellulare sono mediate dalle integrine, una famiglia di glicoproteine di membrana eterodimeriche con subunità alfa e beta. La specificità di legame dipende dall’associazione tra subunità alfa e beta e dalla sequenza di Arginina, Glicina ed Asparagina. In vitro le integrine, grazie alla presenza di questa tripletta inibiscono la capacità invasiva della cellule metastatiche; in vivo riducono la potenziale capacità di colonizzazione. Tale proprietà è difficilmente utilizzabile per scopi terapeutici perchè i peptidi contenenti Arginina, Glicina ed Asparagina hanno emivita breve (51, 52). Terapia anticoagulante con eparina a piene dosi L’eparina viene utilizzata a scopo anticoagulante nelle seguenti condizioni : 1) TVP ed EP in alternativa ai farmaci trombolitici; 2) cardiopatia ischemica; 3) tromboembolie arteriose periferiche. Per quanto riguarda le trombosi cerebrali, vi sono tuttora delle controversie. Abbiamo segnalazioni di casi in cui il trattamento con eparina ha determinato un miglioramento del flusso ematico nel distretto esplorato, ma l’esiguità delle casistiche e l’assenza di studi caso-controllo non permettono di trarre delle deduzioni conclusive, soprattutto in considerazione dell’eventualità di stravasi ematici possibilmente indotti dal trattamento farmacologico (11, 39). 4) Coagulazione Intravascolare Disseminata (CID). 5) disordini emostatici della gravidanza. 6) circolazione extracorporea. Gli studi più numerosi sono quelli riguardanti la TVP acuta in cui il ruolo del trattamento eparinico é quello di prevenire l’EP, di impedire l’insorgenza della sindrome post-flebitica, di ridurre la morbilità per ipertensione polmonare. Inoltre, rispetto ai farmaci trombolitici permette di diminuire i costi e minimizzare gli effetti collaterali. I dosaggi consigliati sono diversi a seconda che si utilizzi la via venosa o quella sottocutanea. 30 Via venosa La terapia per infusione continua deve essere praticata ricorrendo a pompe peristaltiche e non utilizzando degli sgocciolatori, allo scopo di ottimizzare il livello plasmatico dell’eparina. La somministrazione intermittente é ormai abbandonata in quanto espone il paziente a periodi di marcata ipocoagulabilità e a periodi in cui si verifica una eparinemia al di sotto del range terapeutico. Si possono utilizzare quantitativamente due tipi di dosaggio, l’uno definito “dosaggio pieno” e l’altro “moderato”. La dose piena prevede un bolo di 5000 UI di eparina sodica, seguito da 24000 UI nelle 24 ore, mantenendo il livello di eparinemia nel range terapeutico compreso tra 0.2 e 0.5 UI/ml. La dose moderata prevede la somministrazione di 2000 UI in bolo, seguite da 18000 UI nelle 24 ore. E’ utile monitorare la terapia con la determinazione dell’aPTT (28, 43). Per mantenere il livello di eparinemia compreso nel range terapeutico di 0.2-0.5 UI/ml, é necessario che l’aPTT sia tra una volta e mezzo/due volte il valore massimo. Sperimentalmente é stato dimostrato che la crescita del trombo viene inibita con un livello di eparinemia di 0.2 UI/ml e con un aPTT pari a due volte il valore normale. Il primo controllo deve essere eseguito dopo le prime sei ore dall’inizio della somministrazione e dopo 24 ore ci si puo’ trovare in tre diverse condizioni : 1) essere già nel range terapeutico ottimale; ciò si verifica nel 70% dei pazienti trattati; 2) nel rimanente 30% ci si può trovare in due situazioni: - essere al di sotto del range terapeutico e quindi occorre aumentare il bolo di 2000 UI e la dose giornaliera di altre 3000 UI, ripetendo il test dopo 4-6 ore; - essere al di sopra del range terapeutico e quindi occorre ridurre la dose giornaliera di circa 2000-4000 UI oppure fermare l’infusione per 30-60 minuti, ripetendo l’aPTT dopo 4 ore. CONFERMATA INDICAZIONE ALL'EPARINA 5000 UNITA' EV IN BOLO INFUSIONE INIZIALE COSTANTE DI 25ml / ora (20.000 U / 500 ml) CONTROLLO aPTT DOPO 5 ORE ENTRO IL RANGE TERAPEUTICO CONTROLLI GIONALIERI REGOLARE APPROPRIATAMENTE L'INFUSIONE Tab.5a Range terapeutico: aPTT basale x 2. 31 CONFERMATA INDICAZIONE ALL'EPARINA 5000 UNITA' EV IN BOLO INFUSIONE INIZIALE COSTANTE DI 25ml / ora (20.000 U / 500 ml) CONTROLLO aPTT DOPO 5 ORE INFERIORE AL RANGE TERAPEUTICO 1000 - 2000 U EV in bolo Aumento dell'infusione di 2000 - 4000 U / 24 ore RIPETIZIONE DEL MONITORAGGIO DOPO 4 - 6 ORE Tab.5b Inferiore al range terapeutico. CONFERMATA L'INDICAZIONE ALL'EPARINA 5000 UNITA' EV IN BOLO INFUSIONE INIZIALE COSTANTE DI 25ml / ora (20.000 U / 500 ml) CONTROLLO aPTT DOPO 5 ORE SUPERIORE AL RANGE TERAPEUTICO CONTROLLARE FUNZ. RENALE aPTT > di una volta e mezza/due rispetto al valore massimo - STOP INFUSIONE PER 30 - 60 min - RIDURRE IL TASSO DI INFUSIONE DI 2000 - 4000 U / 24 ore - CONTROLLO APTT DOPO 4 ORE aPTT < o = a una volta e mezza/due volte il valore massimo - CONTINUARE IL REGIME IMPOSTATO - RICONTROLLARE APTT DURANTE IL GIORNO - RIDURRE L'INFUSIONE SE CONFERMATO aPTT 32 Tab.5c Superiore al range terapeutico. Via sottocutanea Viene utilizzata quando si devono fare trattamenti per lunghi periodi o come seguito alla terapia eparinica in infusione continua nei pazienti con TVP acuta. La somministrazione di 10000-15000 UI ogni 12 ore permette di mantenere l’eparinemia nel range terapeutico per la maggior parte della giornata. La terapia eparinica deve essere proseguita mediamente per circa 10-15 giorni e nelle ultime 48 ore viene embricata con gli anticoagulanti orali in quanto, prima che essi possano raggiungere il range terapeutico, data la loro emivita relativamente lunga, passano circa 36 ore. Nei pazienti con TVP l’incidenza delle recidive nei primi 3 mesi é elevata, circa il 10% se non viene praticata la profilassi eparinica. Per pazienti che hanno avuto in passato episodi di TVP o EP, é necessario un prolungamento della terapia per almeno sei mesi, se non addirittura per tutta la vita. Nella cardiopatia ischemica la terapia eparinica si embrica solitamente alla terapia trombolitica con streptochinasi, urochinasi o attivatore tissutale del plasminogeno. L’eparina ha lo scopo di prevenire la formazione di trombi murali, di diminuire l’incidenza di embolie ricorrenti e la comparsa di trombosi venose. Viene impiegata alla dose iniziale di 5000 UI in bolo, seguite da 1000 UI/ora. Nell’ occlusione arteriosa periferica acuta la terapia elettiva é di ordine chirurgico, con la rimozione del trombo mediante catetere di Fogarthy. La terapia trombolitica e successivamente quella eparinica rappresentano l’alternativa all’intervento chirurgico nel caso in cui quest’ultimo non possa essere effettuato. La CID rappresenta una complicanza di varie condizioni patologiche. In questo caso é utile la somministrazione di basse dosi di eparina sin dalle fasi iniziali, dato che il consumo dei fattori della coagulazione e l’iperfibrinolisi secondaria sono sempre accompagnate, e anzi precedute, da una attivazione anomala della coagulazione. Nell’adulto é sufficiente una dose iniziale di 5000 UI seguita da una dose di 5-15 UI/Kg/ora, mentre nel neonato si impiegano 5-10 UI/Kg/ora. L’uso dell’eparina nella CID diventa rischioso nelle fasi terminali, poiché si ha una iperfibrinolisi spinta e i fattori della coagulazione sono ormai depleti. Durante la terapia é utile controllare il numero delle piastrine e il dosaggio del fibrinogeno. Se questi valori non aumentano, bisogna supporre un deficit acquisito o congenito di AT III e somministrare plasma o concentrati di AT III. In quest’ultimo caso secondo il seguente schema: 1500 UI di AT III vengono attivate dall’aggiunta di 1000 UI di eparina e successivamente somministrate al paziente. In gravidanza é indicata sia nelle manifestazioni tromboemboliche che nella CID e nelle iperdeposizioni di fibrina in singoli distretti (come accade in un certo numero di casi di insufficienza placentare e di gestosi). In tutte queste situazioni la terapia dovrebbe essere iniziata più precocemente possibile e si deve basare sia sull’osservazione clinica che su indici di laboratorio sufficientemente sensibili; dopo 7-10 giorni di infusione endovenosa a piene dosi si può passare alla somministrazione per via sottocutanea ad intervalli di 8-12 ore.Il dosaggio inizialmente deve essere modulato in modo che l’eparinemia, al controllo effettuato ad un tempo intermedio tra due iniezioni successive, si mantenga tra 0.2 e 0.4 UI/ml. 33 In corso di gravidanza il monitoraggio della terapia dovrebbe basarsi proprio sui test di dosaggio dell’eparina in quanto i test di screening risultano spesso inaffidabili. Dopo 3-4 settimane le dosi vengono ridotte al di sotto delle 20000 UI/die. Nelle situazioni che richiedono la prosecuzione della terapia eparinica nel puerperio, il farmaco viene temporaneamente sospeso da 3-6 ore prima del parto fino a 6 ore dopo. La terapia viene ripresa a dosi inferiori di 10000 UI/die per la prima settimana e quindi protratta per 4-6 settimane dopo il parto. Nella circolazione extracorporea si verificano delle modificazioni dinamiche che alterano la funzione emostatica del sangue. Si ha l’attivazione della via intrinseca per un aumento delle superfici di contatto degli apparecchi; si attiva la via estrinseca per i traumi meccanici sui globuli rossi con conseguente liberazione di sostanze ad attività tromboplastinica; si ha una diminuzione del numero delle piastrine per traumi meccanici, termici e per formazione di aggregati. Tutte queste situazioni che producono un notevole potenziale coagulante, vengono controllate mediante la somministrazione di eparina direttamente al paziente ed aggiunta alle sacche di sangue dei donatori. Le successive dosi vengono ripetute se l’intervento dura più di tre ore e monitorate in base ai risultati di prove di laboratorio quali l’aPTT e il TT o tramite l’ACT. Controindicazioni all’uso dell’eparina Le controindicazioni assolute sono rappresentate da : 1) grave episodio emorragico in atto (sia esso post-operatorio, traumatico,o spontaneo); 2) intervento chirurgico recente a carico del SNC; 3) malattie emorragiche congenite o acquisite ad eccezione della CID nelle sue fasi iniziale e intermedia; 4) ictus emorrragico non antecedente a due mesi; 5) ischemia cerebrale non antecedente a due settimane; 6) ipertensione grave. Queste condizioni sono correlate ad un rischio elevato di emorragie potenzialmente fatali per il paziente. In tutte le altre situazioni di rischio emorragico, inclusi gli interventi chirurgici, il parto, i traumi maggiori, l’ulcera gastrica e l’età avanzata, la controindicazione é relativa alla dose somministrata e all’entità del conseguente allungamento dei tempi di coagulazione. 34 COMPLICANZE E PRECAUZIONI La principale complicanza é l’ emorragia che compare nel 4% circa dei pazienti trattati con eparina. Essa diviene più probabile nel corso di trattamenti con boli endovenosi intermittenti, quando l’aPTT supera di tre volte i valori normali e se in tali condizioni vengono associati farmaci ad attività anticoagulante o antiaggregante (FANS in particolare). In alcune condizioni l’effetto anticoagulante dell’eparina appare sproporzionato alle dosi usate. In particolare in caso di trombocitopenia, in quanto la ridotta disponibilità di Fattore Piastrinico 4 compromette la fisiologica attività neutralizzante del plasma sull’eparina, ed in caso di insufficienza renale in cui risulta alterata l’efficienza della principale via di eliminazione dell’eparina dall’organismo. Spesso si hanno sanguinamenti di modesta entità: gengivorragie, perdite emorroidarie, emorragie sottocongiuntivali, menorragie. Emorragie a carico di altri distretti (gastroenterico,urinario) e le metrorragie, devono sempre far sospettare e ricercare una lesione organica favorente. Le misure da adottare, a seconda della gravità dell’emorragia, variano dalla semplice riduzione della dose, alla temporanea sospensione del trattamento, sino alla somministrazione, in casi di eccezionale urgenza, di solfato di protamina (una sostanza fortemente basica che si lega all’eparina inattivandola rapidamente) nel rapporto di 1mg ogni 100 UI di eparina. Questa dose va ridotta, a causa della rapida clearance dell’eparina somministrata endovena, rispettivamente del 50% se la somministrazione di eparina risale ad un’ora prima e del 25% se la somministrazione risale a due ore prima. In caso di somministrazione sottocutanea é sufficiente neutralizzare il 50% del’ultima dose somministrata, ed é spesso necessario ripetere la dose di solfato di protamina a causa del lento assorbimento dell’eparina inoculata attraverso questa via. L’iniezione di una o più dosi di solfato di protamina va fatta per via endovenosa, lentamente, e il suo effetto neutralizzante sull’eparina va verificato monitorando l’aPTT nel tempo. Nel corso della terapia con eparina, soprattutto se prolungata e se somministrata per via endovenosa, si può verificare un calo considerevole dell’AT III plasmatica. Infatti si é rilevato che nei soggetti normali dopo pochi giorni si riscontra una riduzione della concentrazione pari al 30-40% dei valori antecedenti la terapia. Questa variazione costituisce un fattore di rischio importante, soprattutto quando preesiste un grave deficit ereditario o acquisito di AT III. Nei casi più eclatanti può derivarne la quasi totale perdita di efficacia della terapia eparinica, testimoniata dalla permanenza dei tempi di coagulazione entro limiti normali, nonostante l’aumento delle dosi del farmaco. In queste situazioni si deve associare l’infusione di plasma o di concentrati sintetici dell’inibitore. E’ assolutamente da evitare la brusca sospensione della terapia eparinica in quanto la breve emivita di quest’ultima, associata alla carenza di AT III comporterebbe una rischiosa situazione di ipercoagulabilita’. E’ sempre preferibile attuare una graduale riduzione delle dosi (fino a 5000 UI/die) nell’arco di una settimana. Prima di iniziare la terapia eparinica é consigliabile verificare la conta piastrinica e ricontrollarla poi a 10 e a 20 giorni dall’inizio del trattamento. Nel caso di trombocitopenia marcata (inferiore a 100000/mm3) é consigliabile sostituire l’eparina con antagonisti della vitamina K. Il trattamento con eparina protratto per più di 6 mesi può favorire la comparsa di una diffusa demineralizzazione ossea: i soggetti più esposti sono le donne in età postmenopausale e che non svolgono adeguata attività fisica. Le cause di questa osteoporosi (in genere subclinica) risiedono nella capacità dell’eparina di chelare il calcio e di interferire con la funzione dell’acido ascorbico nella biosintesi del collagene (25). Relativamente frequenti sono le reazioni di ipersensibilita’ all’eparina che, in ogni caso, impongono la sospensione del farmaco. Si tratta di manifestazioni localizzate, di tipo orticarioide o di comparsa di noduli granulomatosi in sede di inoculo. In quest’ultimo caso provocano un sequestro del farmaco e un suo rilascio troppo rapido o ritardato, con conseguenti errate valutazioni nel monitoraggio di laboratorio o di complicanze emorragiche. Talvolta invece si riscontrano manifestazioni sistemiche di varia gravità: cefalea, reazioni vasomotorie , astenia e febbre, fino alle forme più minacciose quali broncospasmo e shock. Complicanze più rare sono l’alopecia, enteropatie, neuropatie periferiche, ipoaldosteronismo. 35 Monitoraggio della terapia eparinica Il monitoraggio della terapia eparinica può essere eseguito ricorrendo a vari test. L’aPTT é il test maggiormente usato per la sua rapidità d’esecuzione, riproducibilità e realizzabilità. Questo test valuta globalmente la funzionalità del sistema emostatico ovvero monitorizza l’effetto risultante dalla attivazione della proteolisi e dall’inibizione del sistema coagulativo intrinseco, ed inoltre permette di analizzare l’effetto biologico dell’eparina (47,48). La variabilità delle risposte sembra dipendere principalmente dal tipo di reagente utilizzato: tale reagente é costituito da fosfolipidi diversi per composizione ed origine con l’aggiunta di attivatori differenti. Inoltre le caratteristiche dello strumento utilizzato, il tipo di anticoagulante, la modalità ed il momento in cui viene eseguito il prelievo, possono influenzare il tipo di risposta. Il processo di standardizzazione del tempo di tromboplastina parziale attivato ha portato a consigliare l’espressione del risultato come rapporto. In questo modo i risultati ottenuti in laboratori diversi sono paragonabili. L’intento dei comitati per la standardizzazione dei metodi é di individuare un reagente di riferimento che permetta di uniformare le cefaline in base alla loro sensibilità all’eparina. Nella maggior parte dei casi si osserva corrispondenza fra il livello di eparina somministrato ed il risultato di laboratorio (Test qualitativi o quantitativi) (49). Tuttavia alti livelli di fattore VIII possono determinare una sottostima dell’effetto anticoagulante dell’eparina (45,46,47). Esistono alcune eccezioni: nelle prime fasi della terapia eparinica (vedi Tab.2) in pazienti con embolia polmonare o con gravi trombosi venose per l’elevata clearance, l’indicazione del test di laboratorio può non essere correlata con la dose di farmaco somministrata (47). Il fenomeno dell’eparino-resistenza, anche se rara (48), può manifestarsi in pazienti con livelli di Antitrombina III estremamente ridotti o per alti livelli di antagonisti dell’eparina quali il PF4 (Fattore piastrinico 4) o la HRG (glicoproteina ricca di istidina). Il monitoraggio della terapia eparinica può essere effettuato anche ricorrendo al tempo di trombina, si tratta di un test funzionale simile all’aPTT. Tuttavia elevate dosi di eparina inibiscono totalmente la formazione del coagulo poiché il plasma povero di piastrine é molto sensibile all’effetto anticoagulante di questo farmaco. Inoltre si può verificare un prolungamento del tempo di trombina per altre cause (presenza di prodotti di degradazione del fibrinogeno e della fibrina, ipofibrinogenemie o disfibrinogenemie; 47). Ogni laboratorio utilizza curve di riferimento proprie poiché tali valori variano in funzione della concentrazione dell’enzima trombina del reagente e del tipo di preparazione farmacologica dell’eparina in uso. Questo potrebbe rappresentare un limite per il laboratorio con routine ridotta. 36 Il laboratorio inoltre può ottenere informazioni circa il dosaggio dell’eparina analizzando i plasmi con test quantitativi (49). I più utilizzati sono i metodi che sfruttano la capacità dell’eparina di inibire alcuni fattori attivati della coagulazione (FXa e/o FIIa). Si tratta di metodiche cromogeniche o coagulative (Heptest). Il plasma da analizzare inizialmente viene incubato con eparina, ATIII e fattore attivato, quest’ultimo viene aggiunto in eccesso. Successivamente si rileva l’attività residua del fattore: nel caso di metodiche cromogeniche si misura la pNA che si libera dalla reazione tra fattore residuo e substrato specifico; nel caso dell’Heptest si misura il tempo di coagulazione della miscela contenente FXa residuo alla quale vengono aggiunti fosfolipidi e CaCl2. Utilizzando una curva di calibrazione é possibile estrapolare l’eparinemia del campione. Infine per il monitoraggio dell’eparina durante interventi particolari in quanto richiedono la somministrazione di dosi consistenti di farmaco anticoagulante (ad esempio interventi di cardioochirurgia con circolazione extra-corporea) é possibile utilizzare l’ACT (Activated Clotting Time). Il test viene eseguito su sangue intero, é rapido e semplice, ma poco sensibile. Si é voluto valutare un reagente per l’esecuzione del tempo di tromboplastina parziale attivato, avente come attivatore silice micronizzata, comparandolo con un reagente costituito da cefalina attivata con acido ellagico. Sono stati esaminati plasmi di campioni ottenuti da soggetti apparentemente normali e soggetti in terapia eparinica. In particolare ai soggetti trattati sono state somministrate dosi di farmaco e formulazioni farmacologiche diverse come indicato nel seguente schema: I gruppo: eparina calcica, 5000 U somministrate una volta al giorno; II gruppo: eparina calcica, 5000 U somministrate due volte al giorno; III gruppo: eparina calcica, 12500 U somministrate una volta al giorno; IV gruppo: eparina calcica, 12500 U somministrate due volte al giorno; V gruppo: eparina calcica, 7500 U somministrate una volta al giorno; VI gruppo: eparina sodica somministrata ad infusione continua; I campioni esaminati erano costituiti da frazioni di plasma citratato fresco ed erano analizzati entro 4 ore dal prelievo venoso. TM I test aPTT sono stati eseguiti utilizzando apparecchi ACL della Instrumentation Laboratory; Per le prove sono stati utilizzati i seguenti reagenti: - IL Test Aptt silice micronizzata liofilizzata; - Thrombofax Ortho. TM TM Il reagente IL Test Aptt silice micronizzata liofilizzata é costituito da : *Cefalina Bovina *Silice micronizzata come attivatore. Il diametro delle particelle é <20millimicron, mentre l’area superficiale é di circa 100m2/g. *Tampone pH 7.3 a 37°C Il reagente Thrombofax Ortho é costituito da: *Fosfolipidi estratti da cervello di bue *Acido ellagico come attivatore *Tampone: N-2-idrossietilpiperazina-n-2-acido etansulfonico *Batteriostatico: thimerosal 0.01% Il Cloruro di Calcio alla concentrazione di 25 mmoli/L é il reattivo starter per entrambi i reagenti. Sono stati analizzati in totale 301 plasmi, di cui 85 ritenuti normali, 171 in profilassi e 45 in terapia eparinica. Ogni campione é stato analizzato con entrambi i reagenti, in rapida successione (15 minuti come tempo massimo fra l’analisi con un reagente e l’altro), utilizzando lo stesso strumento. I campioni rappresentavano la routine del laboratorio. La ratio é stata calcolata automaticamente dal coagulometro ACL , utilizzando come valore di riferimento il tempo di tromboplastina parziale attivato del plasma calibrante IL Test . TM TM 37 Abbiamo constatato che per tutte le classi di campioni analizzati con i due diversi reagenti i dati sono sovrapponibili. In particolare: CAMPIONI RITENUTI NORMALI Il seguente grafico rappresenta la buona correlazione fra i dati. Inoltre sia supponendo una distribuzione normale dei risultati sia una distribuzione non parametrica il range di normalità é compreso fra 0.8 e 1.2 ratio per il reagente silice e fra 0.7 e 1.2 per il reagente acido ellagico (Fig. a). INTERVALLO DI NORMALITÀ RATIO RATIO da a APTT Silice 0.8 1.2 APTT Ellagico 0.7 1.2 Silice liofila Campioni Normali 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Thrombofax Dati espressi in ratio r=0.82 m=0.8 q=0.2 Fig.a CAMPIONI IN PROFILASSI. I dati ottenuti sono rappresentati nel grafico di Fig. b. La buona correlazione é indicata dal valore di r=0.84, coefficiente angolare m=1.2 ed intercetta q=-0.12. Inoltre, focalizzando l’attenzione sui valori minimi e massimi rilevati, emerge che il valore minimo trovato é di 0.8 ratio mentre il valore massimo é di 2.07 ratio per i campioni analizzati con reattivo silice; il valore minimo trovato é di 0.67 ratio mentre il valore massimo é di 1.45 ratio per i campioni analizzati con reattivo caratterizzato da attivatore acido ellagico. Pertanto, secondo questi dati, il reattivo caratterizzato da attivatore silice sembra essere lievemente più sensibile nel discriminare i campioni in profilassi. 38 REAGENTE VALORE MINIMO RATIO VALORE MASSIMO RATIO da a APTT Silice 0.8 2.07 APTT Acido Ellagico 0.67 1.45 Campioni in Profilassi 2,5 Silice liofila 2 1,5 1 0,5 0 0 0,2 0,4 Dati espressi in ratio r=0.84 m=1.26 0,6 0,8 1 Thrombofax 1,2 1,4 1,6 q=0.12 Fig.b CAMPIONI IN TERAPIA I dati risultano correlabili come indicato nel grafico di fig. c. Per i campioni testati col reagente silice abbiamo trovato un valore medio di 1,7 ratio, un valore minimo di 0.9 ratio ed un valore massimo di 2.9 ratio. Campioni in Terapia 3 Silice liofila 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,00 0,50 Dati espressi in ratio r=0.68 m=1.44 Fig.c 1,00 1,50 2,00 2,50 Thrombofax q=0.25 39 Per i campioni analizzati col reagente acido ellagico il valore medio é di 1.35 ratio, il valore minimo é di 1.01 ratio ed il valore massimo é di 2 ratio. (Nota: per il monitoraggio di campioni di soggetti sottoposti a terapia eparinica a dosi consistenti, quali ad esempio, l’infusione di farmaco durante la circolazione extra corporea per interventi cardiaci, viene utilizzato l’ACT (Activated Clotting Time) e solo successivamente il test di riferimento é l’APTT). Abbiamo voluto confrontare la sensibilità in vitro all’eparina dei due reagenti. I calibratori a concentrazioni note di eparina sono sati preparati secondo il seguente schema oppure come indicato nella Fig. 8. Calibratore 0.8U/ml 120µl di una soluzione 40U/ml (*) sono stati aggiunti a 6 ml di plasma calibrante IL Test™, ne sono stati prelevati 400µl che sono stati utilizzati come calibratore 0.8U/ml. Il restante é stato usato per la preparazione degli altri calibratori. Calibratore 0.7U/ml 1750µl di calibratore 0.8U/ml sono stati aggiunti a 250µl di plasma calibrante Calibratore 0.6U/ml 750µl di calibratore 0.8U/ml sono stati aggiunti a 250µl di plasma calibrante. Calibratore 0.5U/ml 1250µl di calibratore 0.8U/ml sono stati aggiunti a 750µl di plasma calibrante. Calibratore 0.4U/ml ottenuto mediante diluizione 1:2 del calibratore 0.8U/ml con plasma calibrante, 250µl di calibratore 0.8U/ml + 250µl di plasma calibrante. Calibratore 0.3U/ml 750µl di calibratore 0.8U/ml sono stati aggiunti a 1250µl di plasma calibrante. Calibratore 0.2U/ml ottenuto mediante diluizione 1:4 del calibratore 0.8U/ml con plasma calibrante, 200µl di calibratore 0.8U/ml + 600µl di plasma calibrante: 500µl sono stati utilizzati come calibratore 0.2U/ml e 300µl per la preparazione del calibratore 0.1U/ml. Calibratore 0.1U/ml ottenuto mediante diluizione 1:2 del calibratore 0.2U/ml con plasma calibrante, 300µl di calibratore 0.2U/ml + 300µl di plasma calibrante. NOTA (*) La soluzione 40U/mL di Eparina é stata preparata nel seguente modo: con eparina commerciale a concentrazione 25000U/ml. Sono stati prelevati 80µl di eparina in uso presso l’ospedale; sono stati aggiunti 50ml di acqua distillata. con eparina commerciale a concentrazione 12500U/ml. Sono stati prelevati 80µl di eparina in uso presso l’ospedale; sono stati aggiunti 25ml di acqua distillata. con eparina commerciale a concentrazione 5000U/ml. Sono stati prelevati 80µl di eparina in uso presso l’ospedale; sono stati aggiunti 10ml di acqua distillata. 40 249 mL acqua distillata 1 mL 5000 U/mL Eparina Eparina 20 U/mL 1 mL 24 mL acqua distillata 5 mL Eparina 0.8 U/mL 1 mL 15 mL acqua distillata Eparina 0.2 U/mL 1 mL = 0.8 U/mL Calibratore = 0.2 U/mL Calibratore Plasma Calibrante Plasma Calibrante 1 mL acqua distillata = 0.0 U/mL Calibratore Plasma Calibrante Fig.8 Schema per la preparazione dei calibratori. Nota: Nel caso di preparazione a diversa concentrazione di eparina effettuare una diluizione preliminare in modo da ottenere una soluzione a 5000 U/ml. Esempio: preparazione farmacologica a 25000 U/ml: diluire 1:5 (2 ml di acqua distillata + 0,5 ml di eparina). La sensibilità in vitro all’eparina per i due reagenti é simile. Non abbiamo rilevato differenze fra l’uso di plasma fresco o liofilizzato. I dati ottenuti sono schematizzati nella tabella e nel grafico seguenti. u/ML Acido Ellagico Silice plasma fresco plasma liofilo plasma fresco plasma liofilo 0 1 1 1 1 0.1 1.09 1.11 1.10 1.10 0.2 1.54 1.49 1.48 1.34 0.3 2.03 1.93 1.91 1.67 0.4 2.51 2.37 2.41 2.05 0.5 2.96 3.06 2.94 2.37 0.6 3.39 3.63 3.51 3.38 0.7 3.86 4.18 4.15 4.16 0.8 4.21 4.78 4.88 5.25 41 Curva dose risposta 6 5 Ratio 4 3 2 Trombofax Silice liofila 1 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Eparina U/ml Possiamo concludere che entrambi i reagenti sono in grado di discriminare i campioni normali ed eparinati. La differente sensibilità dei reagenti può essere principalmente riconducibile alle caratteristiche dell’attivatore. I nostri dati confermano la soggettività della risposta alla terapia eparinica: la stessa dose della medesima preparazione farmacologica può dare effetti e quindi risposte diverse quando somministrata a pazienti diversi. Ogni laboratorio dovrebbe disporre di dati di riferimento propri. 42 Riferimenti bibliografici 1) Barrowcliffe T.W. et al. “Standardization of low molecular weight heparins: a collaborative study” Thromb.Haemost. 1985 54:675 2) Cade J.F. et al. “A comparison of the antithrombotic and hemorrhagic effects of low molecular weight heparinfractions: the influence of the method of preparation” Thromb.Res. 1984 35:613 3) Caen J.P. et al. “Fibrinolyse et thrombolyse” ed. 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