sInterleukin-2-Receptor ELISA

Transcript

Istruzioni per l’Uso
sInterleukin-2-Receptor
ELISA
Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa
di recettore solubile per l’interleuchina-2 (sIL-2R) umana nei supernatanti
di colture cellulari, nel siero e plasma umani.
BE51121
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
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www.IBL-International.com
sInterleukin-2-Receptor ELISA (BE51121)
ITALIANO
INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE
1.
USO PREVISTO
2
2.
SOMMARIO
2
3.
PRINCIPIO DEL TEST
3
4.
REAGENTI FORNITI
4
5.
ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE
5
6.
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
5
7.
MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI
5
8.
PRECAUZIONI PER L’USO
6
9.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
7
10. PROCEDURA DEL TEST
9
11. CALCOLO DEI RISULTATI
12
12. LIMITI DELLA PROCEDURA
13
13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
14
14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
16
15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI
17
16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST
18
17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
19
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1.
ITALIANO
Uso Previsto
IL sIL-2R umana ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo
della sIL-2R umana. IL sIL-2R umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure
terapeutiche.
2.
Sommario
L’interleuchina-2 (IL-2) è stata descritta come un fattore che promuove la crescita e la proliferazione dei
linfociti T umani, per cui occupa un ruolo centrale nella generazione della risposta immunitaria. Questa
proliferazione dei linfociti T è innescata dall’interazione tra l’IL-2 e il suo recettore specifico posto sulla
superficie cellulare, che avviene in seguito all’attivazione del linfocita T. Il recettore dell’IL-2 è composto da
almeno tre subunità polipeptidiche distinte, le catene IL-2R a, IL-2R b e IL-2R g che formano una proteina
legata alla membrana da 55-65 kD.
I geni che codificano per l'IL-2 e le tre subunità del recettore sono stati clonati e sono state dedotte le loro
strutture primarie complete. Le prove accumulate suggeriscono un ruolo fondamentale di IL-2R b nella
trasduzione del segnale dell’IL-2. Si ritiene che le tirosina chinasi accoppiate a IL-2R svolgano un ruolo
fondamentale nella trasduzione di questo segnale.
Oltre all’espressione de novo di IL-2R da parte dei linfociti T attivati del sangue periferico, è stata rilevata
una forma rilasciata e perfettamente solubile di IL-2R (sIL-2R). È stato osservato che sIL-2R è presente in
vivo in bassi livelli nei sieri di persone sane e in livelli notevolmente maggiori in varie condizioni patologiche
tra cui le neoplasie. Le caratteristiche strutturali, funzionali e molecolari di sIL-2R sono state ampiamente
investigate. Grazie alla sua capacità di legarsi all’IL-2, questa molecola solubile svolge un ruolo nella
regolazione della risposta immunitaria. La rilevazione e la quantificazione di sIL-2R fornisce ai medici un
metodo utile e semplice per valutare la funzione immunitaria in vivo nel quadro dell’esame, della gestione e
della prognosi di un ampio spettro di malattie umane.
- Neoplasie ematologiche:
I livelli di IL-2R solubile sono significativamente aumentati nei sieri di pazienti affetti da leucemia a cellule T
dell’adulto, leucemia a cellule capellute, leucemia linfocitica, linfoma di Hodgkin e non-Hodgkin, carcinomi
epatici, mammari e polmonari.
- Malattie autoimmuni o infiammatorie:
Nei pazienti affetti da lupus eritematoso sistemico, artrite reumatoide, sclerosi sistemica progressiva,
polimiosite, malattia di Kawasaki, sclerosi multipla e diabete di tipo I, le concentrazioni plasmatiche del
recettore sIL-2 sono significativamente aumentate rispetto ai controlli.
- Malattie infettive:
Le infezioni virali e micobatteriche determinano livelli elevati di IL-2R solubile, riscontrati in epatite, HIV-1,
mononucleosi infettiva, morbillo, lebbra, tubercolosi e malaria.
- Trapianto o rigetto:
sIL-2R è risultato un marcatore molto utile per il monitoraggio dei pazienti trapiantati che mostrano aumenti
significativi dei livelli sierici di sIL-2R e presentano episodi di rigetto in trapianti di rene, polmone, cuore e
fegato.
- Insufficienza renale cronica o dialisi:
La compromissione della funzione renale causa un aumento dei livelli sierici di sIL-2R in quanto questa
molecola è trasportata attivamente nell’urina.
- Pelle:
sIL-2R è significativamente aumentato nei pazienti con lesioni termiche.
- Terapia:
L’IL-2 ricombinante utilizzata come farmaco antitumorale può provocare il rilascio di sIL-2R.
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3.
ITALIANO
Principio del Test
Figura 1
I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di
rivestimento anti-sIL-2R umana.
Micropozzetto Rivestito
Anticorpo di Rivestimento
Figura 2
Prima Incubazione
La sIL-2R umana presente nel campione o nello standard si
lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti e vi viene
aggiunto l’anticorpo sIL-2R anti-umano coniugato con l’HRP,
che si lega alla sIL-2R umana catturata dal primo anticorpo.
Standard o Campione
Coniugato HRP
Figura 3
Seconda Incubazione
Dopo l’incubazione, la sIL-2R anti-umana coniugato all’HRP
e non legato viene rimosso con una fase di lavaggio e ai
pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva
all’HRP.
Substrato
Figura 4
In proporzione alla quantità di sIL-2R umana presente nel
campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La
reazione viene terminata aggiungendo l’acido e l’assorbanza
si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla
base di 7 diluizioni standard di sIL-2R umana e si determina
la concentrazione della sIL-2R umana.
Substrato post-reazione
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4.
ITALIANO
Reagenti Forniti
1
busta d´alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonali anti-sIL-2R
umana
1
flaconcino (70 µL) con Coniugato-HRP (anticorpi monoclonali anti-sIL-2R umana)
3
flaconcini con Standard sIL-2R umana liofilizzati, 40 ng/mL dopo ricostituzione
1
flaconcino (12 mL) con Diluente dei Campioni
1
flaconcino (5 mL) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x
(PBS con 1 %Tween 20 e 10 % BSA)
1
flaconcino (50 mL) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x
(PBS con 1 %Tween 20)
1
flaconcino (15 mL) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina)
1
flaconcino (15 mL) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M)
2
Copripiastra Adesivi
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5.
ITALIANO
Istruzioni di Conservazione
Conservare i reagenti del kit a 2-8 °C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a
2-8 °C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette.
La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati
correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la
prima manipolazione.
6.
Prelievo e conservazione dei Campioni
Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA,
citrato, eparina). Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all’uso per questo dosaggio. Dopo la
coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile.
Fare attenzione ad un possibile “Effetto Gancio” dovuto ad alte concentrazioni nei campioni (vedi
capitolo 11).
I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio.
Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici.
I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 °C, per evitare la perdita di sIL-2R umana
bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra
2 °C ed 8 °C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5).
Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev’essere
portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela.
7.
−
−
−
−
−
−
−
−
−
Materiali necessari ma no forniti
Pipette graduate da 5 mL e 10 mL
Micropipette adattabili da 5 µL a 1000 µL a canale singolo, con punte usa e getta
Micropipette adattabili da 50 µL to 300 µL multicanale con punte usa e getta
Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti
Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti
Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico.
Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d’onda di riferimento
620 nm)
Acqua bidistillata o deionizzata
Calcolatore statistico con programma che esegua l’analisi di regressione
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8.
ITALIANO
Precauzioni per l’Uso
- Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò,
l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze
alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali.
Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi,
immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli.
- I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico.
- Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza.
- Non usare i kit dopo la data di scadenza.
- Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce.
- Non pipettare utilizzando la bocca.
- Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni.
- Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose.
- Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni.
- Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo.
- Evitare schizzi o produzione di aereosol.
- Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che
invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso.
- Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato.
- L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato.
- Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti.
- La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo.
- Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè
potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per
minimo 1 ora a 121.5 °C.
- Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio
ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti
liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido.
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9.
ITALIANO
Preparazione dei Reagenti
Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a
temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tamponi presenta
cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli.
9.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)
Versare l'intero contenuto (50 mL) del Tampone di Lavaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato
pulito da 1000 mL. Portare il volume finale a 1000 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata.
Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 °C e 25 °C. Il
Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni.
Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente:
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
Soluzione Tampone di Lavaggio
Concentrato (20x) (mL)
25
50
Acqua Distillata (mL)
475
950
9.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)
Versare l'intero contenuto (5 mL) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato
pulito da 100 mL. Portare il volume finale a 100 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata.
Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
Conservare a temperature comprese fra 2 °C e 8 °C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni.
Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente:
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
Soluzione Tampone di Dosaggio
Concentrato (20x) (mL)
2.5
5.0
Acqua Distillata (mL)
47.5
95.0
9.3. Preparazione di Coniugato-HRP
Il Coniugato-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione.
La Soluzione Coniugato-HRP concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in
una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente:
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
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Coniugato-HRP prediluito (1:100) (mL)
0.03
0.06
Tampone di Dosaggio (1x) (mL)
2.97
5.94
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ITALIANO
9.4. Standard sIL-2R Umana
Ricostituire lo standard sIL-2R umana aggiunendo acqua distillata.
Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare
gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard
ricostituito = 40 ng/mL). Lasciare lo standard a ricostituire per 10-30 minuti. Prima di fare le diluizione
mescolare bene.
Dopo l’uso, lo standard rimanente non può essere conservato e deve essere scartato.
La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi
(vedi 9.4.1).
9.4.1. Diluzione Standard Esterna
Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard.
S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.
Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo:
Pipettare 225 uL di Diluente dei Campioni a tutti tubi.
Pipettare 225 µL di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 40 ng/mL) nel primo tubo,
etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 20 ng/mL).
Pipettare 225 µL di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del
successivo transferimento.
Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 5).
Il Diluente dei Campioni serve come bianco.
Figura 5
Transferire 225 µL
S1
sIL-2R Umana
Standard Ricostituito
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S2
S3
Diluente dei Campioni
225 µL
S4
-
S7
Buttare
225 µL
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ITALIANO
10.
Procedura del Test
a.
Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di
campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono
essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e
conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 °C e
perfettamente sigillate.
b.
Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µL di Tampone di Lavaggio per
pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere
al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa 10-15 secondi prima dell'aspirazione. Evitare
di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con
un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip
subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non
lasciar asciugare i pozzetti.
c.
Diluizione dello standard in micropozetti
(alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi – vedi 9.4.1)
Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard B1/2-G1/2,
lasciando A1/A2 vuoto. Pipettare 100 µL di standard preparato (vedi 9.4 Preparazione dello
Standard, concentrazione = 40.00 ng/mL) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1).
Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni
(concentrazione dell standard 1, S1 = 20.00 ng/mL) e trasferire 100 µL, rispettivamente, ai pozzetti
B1 e B2 (vedere Figura 6). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare
questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da
20.00 a 0.31 ng/mL. Buttare 100 µL del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2).
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Figura 6
Transferire 100 µL
S1
S2
Standard Ricostituito
sIL-2R Umana
S3
S4
-
S7
Buttare
100 µL
Diluente dei Campioni
100 µL
In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.4.1) pipettare 100 µL di queste diluizioni standard
(S1–S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1.
Tavola 1
Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standard e campioni nei pozzetti:
A
B
C
D
E
F
G
H
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1
2
Standard 1
(20.00 ng/mL)
Standard 2
(10.00 ng/mL)
Standard 3
(5.00 ng/mL)
Standard 4
(2.50 ng/mL)
Standard 5
(1.25 ng/mL)
Standard 6
(0.63 ng/mL)
Standard 7
(0.31 ng/mL)
Standard 1
(20.00 ng/mL)
Standard 2
(10.00 ng/mL)
Standard 3
(5.00 ng/mL)
Standard 4
(2.50 ng/mL)
Standard 5
(1.25 ng/mL)
Standard 6
(0.63 ng/mL)
Standard 7
(0.31 ng/mL)
Bianco
Bianco
3
4
Campione 1
Campione 1
Campione 2
Campione 2
Campione 3
Campione 3
Campione 4
Campione 4
Campione 5
Campione 5
Campione 6
Campione 6
Campione 7
Campione 7
Campione 8
Campione 8
10/19
ITALIANO
d.
Dispensare 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco.
e.
Dispensare 50 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni.
f.
Dispensare 50 µL di ogni campione in duplicato ai pozzetti dei campioni.
g.
Preparare il Coniugato-HRP (vedere la preparazione del Coniugato-HRP 9.3)
h.
Dispensare 50 µL di Coniugato-HRP a ciascun pozzetto.
i.
Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 3 ore
utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm.
j.
Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 3 volte come descritto
in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo.
k.
Pipettare 100 µL di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti.
l.
Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 °C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione
diretta a luci intense.
È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del
substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di
essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo
del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro.
Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un
colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA
a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore
della DO di 0.9-0.95.
m.
Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µL di Soluzione Stopp in ciascun
pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda
rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I
risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora
se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 °C.
n.
Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come
lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da
610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del
produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli
standard.
Note: In caso d’incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più
bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi.
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ITALIANO
11.
CALCOLO DEI RISULTATI
-
Calcolare i valori medi dell’assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati
devono rientrare nel 20 % del valore medio.
-
Creare una curva standard segnando l’assorbanza media di ogni concentrazione standard
sull’ordinata contro la concentrazione di sIL-2R umana sull’ascissa. Disegnare una curva di best-fit
congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri).
-
Per determinare la concentrazione di sIL-2R umana circolante per ogni campione, trovare prima il
valore medio di assorbanza sull’ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard.
Nel punto d’intersezione estendere una linea verticale fino all’ascissa e leggere il valore
corrispondente della concentrazione di sIL-2R umana.
-
Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulari sono
stati diluiti 1:2 (50 µL campione + 50 µL Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla
curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x).
-
Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo standard 1 può dare per
risultato livelli scorretti e bassi di sIL-2R umana (Effetto Gancio). Questi campioni richiedono
un’ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati della sIL-2R umana, con Diluente
dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di sIL-2R umana.
-
Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione
di sIL-2R umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori
ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere
validi.
-
La Figura 7 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per
dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di
strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.
Figura 7
Curva standard rappresentativa per il sIL-2R umana ELISA. La sIL-2R umana è stato diluito in 2 fasi seriali
nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard
dev’essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.
sInterleukin-2R ELISA
DO (450 nm)
10.0
1.0
0.1
0.0
0.1
1
10
100
(ng/m L)
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ITALIANO
Tavola 2
Dati tipici relativi all’uso del sIL-2R umana ELISA
Lunghezza d’onda: 450 nm
Lunghezza d’onda di riferimento: 620 nm
1
Concentrazione
sIL-2R Umana (ng/mL)
20.00
2
10.00
3
5.00
4
2.50
5
1.25
6
0.63
7
0.31
Bianco
0.00
Standard
D.O.
(450 nm)
2.239
2.193
1.366
1.354
0.710
0.747
0.403
0.410
0.204
0.219
0.120
0.122
0.071
0.074
0.010
0.012
D.O. Media
(450 nm)
2.216
C.V.
(%)
3.25
1.360
0.85
0.729
2.62
0.407
0.49
0.212
1.06
0.121
0.14
0.073
0.21
0.011
0.14
I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad
es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può
influenzare l’attività enzimatica e quindi l’intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi.
12.
LIMITI DELLA PROCEDURA
-
Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva
standard per ogni esecuzione del test.
-
La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione
crociata tra reagenti può casusare risultati erronei.
-
Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro
riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell’uso.
-
Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o
falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca,
riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti
scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati.
-
L’uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi
umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali
murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi
delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le
immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante)
vengono aggiunti al campione.
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13.
ITALIANO
Caratteristiche di Prestazione
13.1. Sensibilità
Il limite di rilevamento della sIL-2R umana definito come la concentrazione dell’analita, risultante in
un’assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni
standard), è stato determinato di 0.27 ng/mL (media di 6 dosaggi indipendenti).
13.2. Riproducibilità
13.2.1. Intra-Dosaggio
La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è
stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sIL-2R umana. Per
ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media
di sIL-2R umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente
complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 7.2 %.
Tavola 3
La concentrazione media di sIL-2R umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione
Campione
1
2
3
4
5
6
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Esperimento
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Concentrazione media di
sIL-2R umana (ng/mL)
2.60
2.53
2.01
1.47
1.54
1.32
1.47
1.56
1.30
1.72
1.80
1.64
1.43
1.52
1.33
3.05
3.42
2.67
Coefficiente di
Variazione (%)
11
7
3
10
7
5
9
7
9
2
7
7
8
11
4
10
5
4
14/19
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13.2.2. Inter-Dosaggio
La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è
stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sIL-2R umana. Per
ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media
di sIL-2R umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente
complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 9.8 %.
Tavola 4
La concentrazione media di sIL-2R umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione:
Concentrazione media di
2.381
1.440
1.443
1.803
1.430
3.048
Campione
1
2
3
4
5
6
Coefficiente di
Variazione (%)
13.6
8.1
9.1
9.2
6.5
12.3
13.3. Test di Recupero
Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 4 livelli di sIL-2R umana in un pool di siero umano normale e
campioni di plasma citrato. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno
con 4 replicati.
La quantità di sIL-2R umana endogena in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test.
Il recupero complessivo è del 75 %.
13.4. Parallelismo della Diluizione
4 campioni di siero con diversi livelli di sIL-2R umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e
con 4 replicati l’uno.
Il recupero rientrava in un range dal 77 % al 107 % con un recupero medio complessivo del 86 % (vedere
Tavola 5)
Tavola 5
Campione
1
2
3
4
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Diluizione
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
Concentrazione Attesa
di
-6.37
3.18
1.59
-8.50
4.25
2.13
-9.30
4.65
2.33
-8.36
4.18
2.09
Concentrazione
Misurata di
1.27
5.92
2.58
1.28
17.0
9.08
3.83
1.86
18.6
8.35
3.69
1.78
16.72
6.79
3.49
1.84
Recupero di
Concentrazione Attesa
di sIL-2R umana (%)
-93
81
81
-107
90
87
-90
79
77
-81
83
88
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13.5. Stabilità dei Campioni
13.5.1. Stabilità a Congelamento - Scongelamento
Aliquote di campioni di siero (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 °C e scongelati 5
volte e sono stati determinati i livelli di sIL-2R umana. Con il congelamento e lo scongelamento non si è
rilevata una perdita significativa di immunoreattività della sIL-2R umana.
13.5.2. Stabilità della Conservazione
Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 °C, 2-8 °C, a
temperatura ambiente (TA) ed a 37 °C e il livello di sIL-2R umana ne è stato determinato dopo 24, 48 e 96
ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di
immunoreattività del sIL-2R umana.
13.6. Specificità
L’interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in
concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero sIL-2R umana positivo. Non si è constatata alcuna
reattività crociata.
13.7. Valori Attesi
Per la sIL-2R umana è stato testato un pannello di 40 campioni di siero di donatori apparentemente sani
(maschi e femmine) selezionati casualmente (random).
I livelli misurati possono variare con la raccolta di campioni usata. Per i livelli di sIL-2R umana misurati vedi
la Tavola 6.
Tavola 6
Matrice di
Campione
Siero
Plasma (EDTA)
Plasma (Citrato)
Plasma (Heparina)
14.
Numero di Campioni
Esaminati
40
40
40
40
Intervallo
(pg/mL)
1.9 – 13.1
0.9 – 8.1
1.8 – 7.8
2.12 – 8.0
% Rilevabile
4.7
2.4
3.8
4.0
Media dei Valori
Rilevabile (pg/mL)
2.6
1.3
1.65
1.7
INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
Per gli ordini contattare:
Vedi ultima pagina.
Per informazioni tecniche contattare:
e-mail: [email protected]
http://www.IBL-International.com
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16/19
15.
ITALIANO
Sommario: Preparazione dei Reagenti
15.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)
Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 mL) a 950 mL di acqua distillata.
Numero
di strisce
1-6
1-12
Soluzione Tampone di Lavaggio
Concentrata (mL)
25
50
Acqua
Distillata (mL)
475
950
15.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)
Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 mL) a 95 mL di acqua distillata.
Numero
di strisce
1-6
1-12
Soluzione Tampone di Dosaggio
Concentrata (mL)
2.5
5.0
Acqua
Distillata (mL)
47.5
95.0
15.3. Coniugato-HRP
Fare una prediluizione 1:100 di Coniugato-HRP in Tampone di Dosaggio (1x):
Numero
di strisce
1-6
1-12
Coniugato-HRP (mL)
Prediluito (1:100)
0.03
0.06
Soluzione Tampone di
Dosaggio (1x) (mL)
2.97
5.94
15.4. Standard sIL-2R Umana
Reconstituire il standard liofilizzato di sIL-2R umana con acqua distillata.
(Il volume di ricostituzione è dichiarato sull’etichetta del flaconcino dello standard.)
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ITALIANO
16.
Sommario di Procedura del Test
1.
Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto.
2.
Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio.
3.
Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni,
in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µL di standard preparato nei primi pozzetti e
creare diluizioni di standard trasferendo 100 µL da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µL dagli ultimi
pozzetti.
Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.4.1.): Pipettare 100 µL di queste
diluizioni dello standard nei micropozzetti.
4.
Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti del bianco.
5.
Aggiungere 50 µL di Diluente dei Campioni)a tutti i pozzetti.
6.
Aggiungere 50 µL di campione in duplicato a tutti i pozzetti.
7.
Preparare il Coniugato-HRP.
8.
Aggiungere 50 µL di Coniugato-HRP a tutti i pozzetti.
9.
Coprire le strisce e incubare 3 ore a temperatura ambiente (18-25 °C).
10.
Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio.
11.
Aggiungere 100 µL di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti.
12.
Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C).
13.
Aggiungere 100 µL di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti.
14.
Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l’intensità del colore a 450 nm.
Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di supernatanti di
colture cellulari sono stati diluiti 1:2 (50 µL campione + 50 µL Diluente dei Campioni). La
concentrazione letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x).
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17.
ITALIANO
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
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receptor as a tumor marker in patients with hairy cell leukemia. Blood 1988; 71:1304-1309.
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19/19
Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbH
Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany
IBL International Corp.
194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
+ 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11
[email protected]
+1 (416) 645 -1703 Fax: -1704
[email protected]
LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20

sInterleukin-2-Receptor ELISA

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