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Relazione sull’attività sperimentale prevista dal
Corso di Alta Formazione per lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative finanziato
nell’ambito del Progetto STRAIN (STRAtegie terapeutiche Innovative).
Allievo: Caterina Ferrara
Tutor: Prof.ssa Angelina Lombardi
Periodo di svolgimento: Novembre 2013-Settembre 2014
Sede: Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università degli Studi di Napoli Federico II,
Complesso Universitario di Monte Sant’Angelo, Via Cintia, 21 - 80126 – Napoli.
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Obbiettivi
I recettori tirosin-chinasici sono stati impiegati con successo come sistemi sonda delle vie di
trasduzione del segnale e per il targeting di diverse forme tumorali. Una famiglia di recettori
tirosin-chinasici transmembrana è quella dei recettori del fattore di crescita dell’epidermide
(EGFR). Ad essa appartengono quattro membri strettamente correlati tra loro (ErbB1, ErbB2,
ErbB3 ed ErbB4).
Il recettore transmembrana ErbB1 è stato l’oggetto di ricerca del mio anno di Borsa di Studio.
L’attività principale ha riguardato la sintesi di un peptide modello (CHAMP- computed helical antimembrane protein), in grado di legare il dominio transmembrana del recettore allo scopo di
analizzare successivamente il meccanismo di funzionamento di ErbB1 in cellule sane e in cellule
tumorali. A tal fine, ho eseguito la sintesi in fase solida del peptide CHAMP anti- ErbB1, legante il
recettore ErbB1, e la sintesi della porzione transmembrana del recettore ErbB1(Ile645-Met668).
Successivamente entrambi i peptidi sono stati purificati e analizzati mediante tecniche di
cromatografia e di spettrometria di massa.
Sintesi di peptidi CHAMP come sonde per lo studio di proteine di membrana e a scopo terapeutico.
Una vasta serie di funzioni biologiche e fisiologiche viene controllata da peptidi o piccole proteine
modello. Considerevoli progressi sono stati compiuti nella realizzazione di molecole di dimensione
ridotta, in grado di mimare elementi della struttura secondaria delle proteine (eliche, strand e turn).
Negli ultimi anni la modellistica computazionale si è fatta sempre più strada nell'ambito delle
scienze della vita. Un notevole progresso si è avuto nell’utilizzo e nel perfezionamento del software,
delle tecniche e degli algoritmi di modellistica dei sistemi complessi.
In questo contesto si inserisce la sintesi dei peptidi CHAMP (computed helical anti-membrane
protein) come approccio strategico volto sia alla costruzione di un modello di studio per complessi
tra proteine di membrana, sia allo sviluppo di terapie nell’ambito di patologie tumorali
caratterizzate da una over-espressione di geni che codificano per recettori tirosin-chinasici.
In seguito al legame del peptide elicoidale CHAMP anti-ErbB1 al recettore ErbB1 stesso si
potrebbe verificare un riarrangiamento guidato da due domini contenuti nella sequenza del peptide
CHAMP, ovvero motivi – GXXXG – like. In particolare, il legame del peptide elicoidale CHAMP al
recettore potrebbe avere un potenziale effetto inibitorio sulla dimerizzazione di
quest’ultimo, di cui sarebbe impedita o limitata la fosforilazione. I metodi di "de novo design"
hanno in sostanza lo scopo di generare nuove sequenze per estrapolazione diretta delle informazioni
contenute nella struttura del sito recettoriale.
La strategia de novo design di peptidi è in grado di effettuare il targeting di eliche trans membrana
prevedendo fondamentalmente tre fasi:
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studio delle librerie di peptidi presenti nelle banche dati disponibili


identificazione della migliore sequenza di targeting
miglioramento della sequenza identificata
Perché studiare i rettori tirosin-chinasici: Importanza e ruolo nel processo di oncogenesi.
La trasformazione tumorale delle cellule è associata a mutazioni multiple a carico di alcune classi
fondamentali di geni che svolgono un ruolo cruciale nella moltiplicazione e nella differenziazione
delle cellule: i proto-oncogeni e i geni oncosoppressori.
I proto-oncogeni esprimono proteine che stimolano la cellula a progredire nel suo ciclo cellulare
(aumento di volume, replicazione del DNA e divisione cellulare); i geni oncosoppressori, invece,
inibiscono la crescita della cellula. Gli agenti esogeni (chimici, fisici e virali) danno luogo a
mutazioni di proto oncogeni producendo oncogeni, la maggior parte dei quali codifica per una
proteina tirosin-chinasi. Quasi tutte le mutazioni associate agli oncogeni si traducono in una perdita
dell’inibizione dell’attività catalitica, che altera le funzioni che controllano la divisione cellulare2.
Numerosi polipeptidi, come i fattori di crescita, i fattori di differenziamento e gli ormoni, giocano
un ruolo fondamentale nella proliferazione e nel differenziamento cellulare. Molti di questi fattori
mediano la loro azione legandosi ed attivando specifici recettori di membrana associati ad attività
tirosin-chinasica.
Il legame con il ligando provoca la dimerizzazione del recettore, la fosforilazione della tirosina e
poi della chinasi. Tali eventi permettono l’attivazione di molte molecole effettrici, tra cui le MAP
chinasi attive, che stimolano la sintesi e l’attivazione di fattori trascrizionali, come FOS e JUN, i
quali regolano il ciclo cellulare e che sono, pertanto, coinvolti nella tumorigenesi.
I recettori tirosin-chinasici delle cellule tumorali sono in effetti permanentemente dimerizzati,
quindi i recettori mutati trasmettono continuamente segnali mitogeni provocando una crescita
incontrollata e incontrollabile3.
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Attività svolte
Targeting del recettore per il fattore di crescita epidermico EGFR mediante l’impiego di peptidi
CHAMP.
L’attività principale del presente lavoro di tesi è stata la sintesi in fase solida e la purificazione della
sequenza del tratto TM del recettore del fattore di crescita epiteliale ErbB1(Ile645-Met668) e di un
peptide artificiale denominato CHAMP anti-ErbB1, disegnato per riconoscere selettivamente la
sequenza TM di ErbB1.
Il peptide CHAMP è stato precedentemente disegnato tramite metodi di "de novo design". Tali
metodi hanno lo scopo di generare nuove sequenze per estrapolazione diretta delle informazioni
contenute nella struttura del sito recettoriale3.
La sintesi di tali peptidi è stata eseguita essenzialmente allo scopo di studiare successivamente il
meccanismo di attivazione del recettore ErbB1 e per sviluppare in futuro sonde peptidiche da
utilizzare come potenziali radio farmaci nelle applicazioni diagnostiche, tese ad evidenziare la
sovra-espressione del recettore ErbB1, in collaborazione con il gruppo del Prof. De Grado
all’Università della California di San Francisco (UCSF).
Molti peptidi in grado di agire sul meccanismo di diversi sistemi recettoriali sono stati studiati negli
ultimi anni sia in vitro (mediante caratterizzazione biochimica e biologica su sistemi cellulari) sia in
vivo (su modelli murini e sull’uomo) e sono stati in seguito proposti come potenziali traccianti
radiomarcati per la diagnosi e la terapia di patologie umane.
Studi precedenti: esempi applicativi dei peptidi CHAMP
Risultati promettenti nell’applicazione del metodo computazionale CHAMP si sono già avuti in
precedenza in uno studio sulle integrine1. Queste sono una famiglia importante di recettori cellulari
responsabili delle interazioni cellule-cellule, e cellule-matrice extracellulare. Singolarmente, esse
possono interagire con diversi ligandi e allo stesso modo un dato ligando può presentare siti di
riconoscimento per varie integrine. L’affinità di legame per i propri ligandi è relativamente bassa,
ma la loro concentrazione sulla membrana plasmatica è superiore rispetto ad esempio ai recettori di
ormoni e di fattori di crescita. Le integrine sono recettori contenenti due catene distinte, denominate
subunità α e β e si legano ai corrispondenti ligandi extracellulari
mediante domini N-terminali contenuti in tali subunità. Queste interazioni integrine-ligandi sono
regolate essenzialmente da alcuni fattori come: la presenza sul ligando di sequenze riconosciute da
un certo tipo di integrina; la formazione di complessi con i cationi bivalenti (Mg2+, Ca2+); la
transizione verso una conformazione attiva dell’integrina. Ciascuna cellula può comunque variare le
sue proprietà di adesione attraverso l’espressione selettiva di differenti integrine, modulando
l’affinità di quest’ultime per il ligando, ed anche la specificità, attraverso il processo di attivazione e
di deattivazione dell’integrina stessa.
Recentemente, lo sviluppo del metodo computazionale precedentemente illustrato ha permesso il
design di sequenze specifiche, appunto di CHAMP per le integrine, che legano porzioni di proteine
transmembrana all’interno della membrana. Il metodo è stato applicato per disegnare peptidi che
riconoscano in maniera specifica i domini transmembrana della subunità αIIb dell’integrina αIIbβ3
14,15. L’interazione del peptide CHAMP anti-αIIb con l’integrina αIIbβ3 isolata in micelle
detergenti, ha confermato che anti-αIIb attiva αIIbβ3 nelle cellule intere a causa dell’interruzione
dell’interazione proteina-proteina tra le subunità α - β alla regione transmembrana1.
Strategia di sintesi
La sintesi peptidica, alla base dell’attività sperimentale da me svolta, è stata eseguita secondo la
strategia della chimica Fmoc, caratterizzata da diversi accorgimenti. In primo luogo in entrambe le
sequenze sono state introdotte quattro residui di Lys, due all’estremità N-terminale e due a quella Cterminale, che si presentano come teste idrofiliche atte a favorire la solubilità dei peptidi stessi e il
loro ingresso nella membrana cellulare. Nel caso di una reazione di condensazione con rese non
ottimali è possibile insistere eseguendo un secondo “coupling” con lo stesso amminoacido prima di
sbloccare il gruppo protettore al terminale α-amminico del peptide in crescita (coupling doppio),
oppure si possono utilizzare agenti condensanti diversi o, ancora, aumentare i tempi di reazione.
A tal proposito, è stata prevista nel mio lavoro di ricerca/formazione l’introduzione di doppi
accoppiamenti amminoacidici, vista la presenza nelle sequenze di amminoacidi stericamente
ingombranti, come l’isoleucina e la leucina che sfavoriscono l’attacco dell’amminoacido successivo
in catena. Inoltre è stato utilizzato come solvente di sintesi una soluzione DMSO/NMP 75:25.
L’aggiunta di DMSO all’ NMP, normalmente utilizzato nella sintesi peptidica, sfavorisce fenomeni
di aggregazione tra le catene peptidiche, come riportato in letteratura. Infine, nella sintesi del
peptide CHAMP anti-ErbB1, la Ser in posizione 17 è stata introdotta sotto forma di pseudo-prolina
(Fmoc-Ile-Ser [psi(Me,Me)pro]-OH )4.
Anche tale scelta è stata operata al fine di sfavorire i fenomeni di aggregazionne sulla resina. Infatti
in caso di peptidi lunghi e/o sequenze complesse, il suo utilizzo apporta notevoli miglioramenti
nella qualità e nella resa dei prodotti grezzi evitando l’ottenimento di sequenze non desiderate. Al
momento del distacco del peptide sintetizzato dalla resina, le condizioni acide legate alla presenza
del TFA nella miscela di reazione favoriscono l’apertura dell’anello oxazolidinico della pseudoprolina5 e a restituiscono la sequenza nativa del peptide. Terminata la sintesi, i peptidi sono stati
distaccati dalla resina mediante trattamento con TFA, consentendo contestualmente anche la
rimozione dei gruppi protettori delle catene laterali.
Le condizioni ottimali per il distacco dipendono da una serie di fattori quali gli amminoacidi
presenti, il loro numero e la loro sequenza, i gruppi protettori delle catene laterali, il tipo di resina
utilizzata. Durante questa fase sono possibili alcune reazioni collaterali, in particolare quelle
generanti cationi ter-butilici o benzilici che possono attaccare le catene non protette del Trp, Tyr,
Met, e His. Per disattivare le suddette specie cationiche si aggiungono alla miscela di distacco
reagenti elettrofili, detti scavengers, come l’anisolo, solfuri organici e tioli.
Nella sintesi di entrambe i peptidi oggetto del mio studio, sono stati impiegati rispettivamente: la
resina “Rink Amide MBHA”, che costituisce uno dei supporti comunemente utilizzati per la sintesi
peptidica in chimica Fmoc; triisopropilsilani come scavengers. La resina Rink Amide è definita
“acido labile”, in quanto il distacco del peptide avviene per l’appunto in condizioni acide. I prodotti
grezzi sono stati analizzati mediante RP-HPLC.
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Risultati conseguiti
Tramite un innovativo protocollo computazionale di de novo design è stato disegnato un peptide di
27 amminoacidi denominato CHAMP anti-ErbB1 che assume una struttura secondaria alfa elica.
Esso è stato progettato per legare il recettore per il fattore di crescita epidermico EGFR.
L’attività sperimentale legata alla mia borsa di studio ha previsto la sintesi sia del peptide CHAMP
anti- ErbB1 che della porzione peptidica complementare di 30 amminoacidi contenuta nel
corrispondente recettore transmembrana. Quest’ultimo punto ha rappresentato, infatti, l’aspetto più
critico, vista la scarsa solubilità dei peptidi nei classici solventi impiegati nelle diverse metodiche di
analisi e purificazione. Tale ostacolo è stato superato attraverso l’ utilizzo di solventi disaggreganti
sia nelle fasi di sintesi sia nelle fasi di purificazioni.
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Descrizione della struttura ospitante
Presso il Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università di Napoli “Federico II” si svolgono
attività di ricerca e didattica ed attività per Conto-terzi. Tali attività coprono vari settori della
Chimica, tra i quali:
- la progettazione e la sintesi di nuove molecole
- la purificazione e la caratterizzazione analitica di molecole di origine naturale e di sintesi
- la determinazione strutturale di nuove molecole mediante diffrazione raggi X, risonanza
magnetica nucleare, spettroscopie ottiche ed elettroniche di spin, spettrometria di massa.
In particolare, il gruppo ospitante ha riconosciute competenze ed esperienza nel campo della
chimica delle proteine e peptidi, in particolare nella loro progettazione, sintesi e caratterizzazione
strutturale (in soluzione e allo stato solido).
Il gruppo dispone delle seguenti strumentazioni: sintetizzatori di peptidi, sistemi HPLC,
spettrometri LC-MS-ESI-MS e LC-ITTOF, dicrografo, spettrometro Bruker Avance 600 MHzNMR
con probe criogenico, voltammometro, stereomicroscopi, spettrofotometro micro-Raman,
laboratorio di cristallizzazione.
Il gruppo ha inoltre accesso al CIMCF (Centro di Metodologie Chimico-Fisiche) dell'Università
degli Studi di Napoli, al CERM European Large Scale Facility (Centro di Risonanza Magnetica)
dell'Università degli Studi di Firenze, ed ai principali sincrotroni europei (Elettra, Trieste, Italia,
ESRF, Grenoble, Francia). Il gruppo collabora con i Prof. Benoît Limoges e Veronique Balland
(Université Paris Diderot - Parigi) per la caratterizzazione spettro-elettrochimica.
Riferimenti del Tutor
Prof.ssa ANGELINA LOMBARDI
Tel.: 081-674418
e-mail: [email protected]
Riferimenti
1. Davies DE, Chamberlin SG Targeting the Epidermal Growth Factor Receptor for therapy of
carcinomas. Biochemical Pharmacology 1996 51: 1101-1110;
2. Pontieri GM, Patologia generale, Ed. Piccin, 1987;
3. Farmacia.unical.it/cartelle/download/dispense/sisci/
4. Albert Isidro-Llobet,Mercedes A´ lvarez, and Fernando Albericio, Amino Acid-Protecting
Groups; Chem. Rev. 2009, 109, 2455–2504
5. Torsten Wo 1hr, Franck Wahl, Adel Nefzi, Barbara Rohwedder, Tatsunori Sato, Xicheng
Sun, and Manfred Mutter, Pseudo-Prolines as a Solubilizing, Structure-Disrupting
Protection Technique in Peptide Synthesis; J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9218-9227