tossemia gravidica (chetosi) nella capra da latte ad alta produzione

THBP (thyroid hormone binding protein) COME INDICATORE MUSCOLARE DI
CRESCITA
THBP (thyroid hormone binding protein) LIKE MUSCULAR GROWTH INDICATOR
Gaviraghi A.1, Noè L.1, Fortin R.1,2, Deriu F.1,2, Roncada P.1,2 1Istituto Sperimentale Italiano
L. Spallanzani, Lodi. 2Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie, Milano.
Parole chiave: proteomica, muscolo, accrescimento, capra.
Key words: proteomic, muscle, growth, goat.
SUMMARY – Aim of this work is the identification of molecular biomarkers of growth in
skeletal muscle of male castrated goats in function of the type and frequency of feeding: a
sample of 4 individuals was taken into account for both free and rationed feeding. Beside the
analysis of the metabolic profiles and of the meat colour, the investigation has been carried
over using proteomic techniques such as two-dimensional electrophoresis, image analysis and
data base research of proteins identified by means of mass spectrometry. Both classical and
proteomics approaches showed no relevant differences, save for the appearance of a protein
train at pH ~ 5 and Mw ~ 50-70 in the 2D maps of the rationed feeding individuals. By
comparison with mouse skeletal muscle 2D map, these proteins have been identified as
isoforms of thyroid hormone binding protein (THBP) (EC 5.3.4.1), a multifunctional
sarcoplasmatic reticulum protein.
INTRODUZIONE – Si è valutata l’espressione proteica nel muscolo longissimus dorsi in 8
soggetti caprini di razza Frisa Valtellinese e di sesso maschile castrati. Gli animali, macellati a
335 ± 15 giorni di vita, sono stati allevati con due tipologie di alimentazione differenti: in un
caso gli animali avevano libero accesso al foraggio durante tutto l’arco della giornata,
nell’altro caso gli animali venivano alimentati in maniera razionata. L’analisi dei profili
proteici nelle mappe bidimensionali di estratto di muscolo scheletrico ha messo in evidenza
una notevole espressione della THBP nei soggetti ad alimentazione razionata. La THBP è una
proteina multifunzionale contenuta nel lume del reticolo sarcoplasmatico; oltre a legare la
3,5,3’-triiodo-L-tirosina, la THBP cellulare esplica le seguenti funzioni: riarrangiamento dei
ponti disolfuro nelle proteine neosintetizzate, la formazione di 4-idrossiprolina nel collagene
neosintetizzato ed il trasferimento di oligosaccaridi dal dolicolpirofosforiloligosaccaride ai
residui di asparagina di altre proteine (1).
MATERIALI E METODI – Il lavoro è stato effettuato su 8 campioni di muscolo
longissimus dorsi derivanti dalla macellazione di due gruppi di 16 soggetti caprini di razza
Frisa Valtellinese e di sesso maschile allevati secondo due tipologie diverse. I 32 soggetti, nati
in un unico allevamento tra la metà e la fine di febbraio, sono stati castrati nelle prime
settimane di vita (D.L. 26 marzo 2001, n.146 art 19). La prova è iniziata dopo lo svezzamento,
a 60 giorni, quando il peso medio dei soggetti del gruppo 1 era 18,57 Kg (d.s. 2,31) mentre
quello del gruppo 2 era 18,32 Kg. (d.s. 2,80). L’alimentazione degli animali del gruppo 1 è
costituita da fieno di prato stabile o loiessa, secondo le disponibilità aziendali, integrata da
fiocchi di mais e mangime commerciale completo. Le risorse alimentari sono sempre presenti
in mangiatoia. Per i soggetti del gruppo 2 l’alimentazione è costituita da una razione composta
da fieno di prato stabile ad libitum integrata da 500 - 800 g/capo giorno di mangime completo.
La macellazione dei soggetti è avvenuta a 335 ± 15 giorni di vita. Alla macellazione i pesi dei
due gruppi erano statisticamente differenti, 38,27 ± 0,78 Kg per l’allevamento 1 e 32,00 ±
0,68 Kg per il 2. I campioni di muscolo longissimus dorsi sono stati congelati a -80°C
immediatamente dopo la macellazione. Successivamente 100 mg di tessuto sono stati utilizzati
per l’estrazione della frazione proteica tramite OMNIzol (Euroclone). I pellet proteici sono
stati poi risospesi in una soluzione contenente 8M urea, 4% CHAPS, 1% DTT, 30mM Tris,
1.6% Anfoline pH 3.5-10. In seguito 75 µg di proteina per campione sono stati seminati in
300 µl della stessa soluzione per rigonfiare overnight strip pH 3-10NL (Amersham
Biosciences). Dopo 20 ore di rigonfiamento è stata eseguita l’isoelettrofocalizzazione con un
IPGPhor II (Amersham Biosciences) fino ad un totale di 60 kV/h totali. Dopo equilibrazione
le strip sono state trasferite su un gel SDS-PAGE al 10% di acrilammide (180x160x1.5mm)
per la separazione in seconda dimensione tramite Hoefer SE600 (Amersham Biosciences). I
gel sono stati poi colorati secondo la colorazione all’argento nitrato come precedentemente
descritto (2). Dopo l’acquisizione delle immagini digitalizzate dei gel è stata effettuata
l’analisi d’immagine con il software dedicato Image Master 2D Platinum (Amersham
Biosciences) e l’identificazione delle proteine note è stata effettuata per confronto con le
mappe bidimensionali di muscolo scheletrico bovino (3) e murino (4).
RISULTATI – Sono stati confrontati 4 capi provenienti da 2 allevamenti differenti per un
totale di 8 individui. In un allevamento gli animali avevano piena libertà di alimentazione,
mentre nel secondo l’alimentazione veniva razionata. L’analisi del colore della carne con il
sistema CIEL*a*b* ha dato risultati molto simili per tutti i soggetti. L’analisi dei gel
bidimensionali delle proteine del muscolo scheletrico ha invece messo in evidenza la presenza
di uno spot proteico presente solo nei soggetti provenienti dell’allevamento ad alimentazione
razionata (Fig. 1 e 2). Per confronto con le mappe presenti in banca dati, la proteina è stata
identificata come la proteina legante l’ormone tiroideo (thyroid hormone-binding protein,
THBP).
Figg. 1 e 2: elettroforesi bidimensionali di riferimento per i soggetti ad alimentazione libera
(sinistra) e ad alimentazione razionata (destra): la zona ombreggiata nella mappa di destra
mostra il treno di spot proteici presenti solo nei capi ad alimentazione razionata corrispondenti
alle isoforme della THBP. Gli spot numerati indicano le proteine identificate per confronto
con le mappe bovine e murine presenti in banca dati: 1-2) heat shock cognate; 3) serum
albumin precursor; 4) desmin ; 5) ATP-synthase beta chain, mitochondrial precursor; 6)
alpha-actin skeletal muscle; 7) myosin light chain 1, fast-twitch muscle isoform; 8) myosin
regulatory light chain 2, skeletal muscle isoform; 9) myosin light chain 3, skeletal muscle
isoform.
CONCLUSIONI – L’indagine proteomica tramite elettroforesi bidimensionale e ricerca in
banca dati ha evidenziato la sovrespressione di THBP negli individui ad alimentazione
razionata. Ciò potrebbe essere legato ad una sofferenza tiroidea negli animali, con
conseguente feed-back positivo nell’espressione del recettore per l’ormone tiroideo nel
muscolo scheletrico. La mancata attivazione della THBP da parte della 3,5,3’-triiodo-Ltirosina può così spiegare il sottosviluppo muscolare a cui sono andati incontro i capi del
secondo gruppo: la THBP esplica infatti un ruolo chiave nell’attivazione e glicosilazione di
un’ampia gamma di proteine fondamentali al normale sviluppo del muscolo, oltre a
concorrere alla formazione del collagene maturo.
BIBLIOGRAFIA – (1) Fliegel L et al (1990) J Biol Chem, 265, 15496-15502. (2) Murakami
K et al (1998) Electrophoresis, 19, 2521-2527. (3) Bouley J et al (2004) Proteomics, 4, 18111824. (4) Sanchez JC et al (2001) Proteomics, 1, 136-163.
Lavoro realizzato con fondi MIPAF (Caprisoft) e Regione Lombardia (Hircus Meat).
Si ringrazia per la collaborazione Carlo Gianoncelli (APA di Sondrio).