Nuove tecnologie della riproduzione Cesare Galli e

Nuove tecnologie della riproduzione
Cesare Galli e Giovanna Lazzari
Laboratorio di Tecnologie della Riproduzione, CIZ srl,
Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani
Via Porcellasco 7f, 26100 Cremona Italia
La riproduzione riveste un ruolo fondamentale nell’allevamento animale poiché, oltre che a
moltiplicare gli animali da allevare, è anche lo strumento principale su cui si fonda il miglioramento
genetico e la selezione. La fecondazione artificiale ha avuto ed ha tuttora l'impatto maggiore
sull'allevamento bovino permettendo l'utilizzo di pochi riproduttori, geneticamente superiori, su
gran parte degli animali allevati mentre la selezione sulla linea germinale femminile è limitata
all'utilizzo del MOET (multiple ovulation and embryo transfer).
Le nuove tecniche di riproduzione assistita consentono di aumentare la pressione di selezione sulla
linea femminile (1) e sono utilizzate in campo animale non necessariamente per la cura della
fertilità ma principalmente per aumentare il numero di embrioni prodotti da ogni singola donatrice.
L'altro aspetto importante riguarda la possibilità di sfruttare a fini selettivi, attraverso queste
tecniche riproduttive e genotipizzando gli embrioni, i dati che vengono messi a disposizione dalla
mappatura del genoma.
Produzione di embrioni in vivo (MOET)
Nelle specie monouvulanti come i ruminanti ogni femmina può generare un numero molto ridotto
di progenie. Per aumentare questo numero e sfruttare meglio dal punto di vista riproduttivo
femmine di particolare valore genetico si ricorre a trattamenti farmacologici che portano ad
ovulazione un numero superiore di follicoli. Gli embrioni ottenuti vengono rimossi con un lavaggio
uterino e sono impiantati in bovine riceventi di scarso valore genetico che porteranno a termine la
gravidanza. In questo settore possiamo già parlare di una vera e propria industria sia per i numeri di
embrioni prodotti ogni anno nel mondo (circa mezzo milione) (2) sia perché dopo congelamento gli
embrioni sono commercializzati in tutto il mondo. Un numero limitato di embrioni sono prodotti
anche da suini, ovini, caprini, bufali e cavalli.
Produzione di embrioni bovini in vitro
Un numero elevato di ovociti è presente nelle ovaie al momento della nascita, ma solo una piccola
parte viene fisiologicamente utilizzata a fini riproduttivi, mentre la maggior parte é persa attraverso
il processo di atresia. Le tecniche di produzione in vitro degli embrioni si basano sul prelievo di
ovociti che hanno completato la fase di crescita all'interno del follicolo ovarico. Solo gli ovociti
presenti in follicoli con diametro oltre 2 mm contengono un ovocita che è competente per il
successivo sviluppo embrionale (3). Gli ovociti vengono prelevati dalle ovaie dopo la macellazione
dell'animale ( 4, 5, 6) oppure dagli animali vivi per via transvaginale ecoguidata (7). La tipologia
dell'embrione prodotto varia in funzione delle modalità di raccolta degli ovociti e del valore
genetico delle donatrici. Negli ultimi venti anni notevoli progressi sono stati fatti nella maturazione
degli ovociti in vitro; molto importanti sono le interazioni, durante le prime ore di maturazione, tra
le cellule che circondano l'ovocita (cellule della granulosa) e l'ovocita stesso (8). La maturazione in
vitro viene ottenuta in circa 24 h di coltura in condizioni di temperatura ed atmosfera controllata;
successivamente, seme congelato utilizzato normalmente per la fecondazione artificiale viene
preparato per la fecondazione in vitro, gli spermatozoi vengono separati mediante centrifugazione,
capacitati con l'aggiunta di eparina e messi in contatto con gli ovociti maturi (9). Dopo 18-24 h di
coltura in presenza di spermatozoi, gli ovociti vengono trasferiti in un medium idoneo allo sviluppo
embrionale e in 7 giorni raggiungono lo stadio di blastocisti, stadio in cui possono venire impiantati
per via transcervicale nell'utero di una bovina ricevente oppure congelati e conservati in azoto
liquido fino al momento dell'impianto (6). L'efficienza della maturazione in vitro è molto elevata
(oltre il 90% degli ovociti raggiunge la seconda metafase) come pure quella della fecondazione in
vitro (oltre il 70%). La fase più critica (anche per la sua durata temporale) è lo sviluppo dell'ovocita
fecondato a blastocisti (oscilla tra il 30-40%). La coltura degli zigoti di bovino nell'ovidotto di
pecora (10) permette di superare la maggior parte dei limiti imposti da sistemi di coltura inadeguati.
Tuttavia, con il continuo sviluppo di nuove formulazioni di medium semi-definiti (SOF, 11; CR1,
12) si ottengono oggi embrioni di buona qualità ed idonei al congelamento.
Ovum Pick Up (OPU)
La tecnica OPU permette di produrre da ogni singola donatrice un elevato numero di embrioni con
padri diversi in situazioni fisiologiche più disparate (dai due mesi di età fino al quarto mese di
gravidanza). Dopo il prelievo gli ovociti vengono trattati come descritto sopra per la produzione in
vitro. Oltre alla maggior probabilità di produrre embrioni rispetto alle tecniche tradizionali l'OPU
permette, utilizzando donatrici prepuberi, di ridurre notevolmente l'intervallo generazionale
aumentando il progresso genetico (13). Inoltre consente di poter utilizzare per la fecondazione un
toro diverso ad ogni prelievo di ovociti ottenendo in poco tempo molti embrioni da una determinata
donatrice con tutti gli accoppiamenti desiderati. Queste tecniche di miglioramento genetico sulla
linea femminile trovano la loro migliore applicazione all'interno dei nuclei di selezione, dove sono
allevati e riprodotti intensivamente animali geneticamente superiori. L'OPU inoltre, rappresenta
anche l'unica possibilità per produrre embrioni da donatrici fino al 3-4 mese di gravidanza, da
donatrici ipofertili o sterili ed in alcuni casi svolge anche un effetto terapeutico con il recupero della
carriera riproduttiva della donatrice.
Durante il prelievo degli ovociti la donatrice è contenuta in un travaglio, è sedata e sottoposta ad
anestesia epidurale. Il prelievo è abbastanza rapido, la sonda ecografica viene inserita in vagina e
l'ovaio avvicinato alla sonda per via transrettale. Un secondo operatore muove l'ago che é montato
sulla sonda aspirando così i follicoli visualizzati per via ecografica. In media si aspirano 15-20
follicoli e si raccolgono 8-10 ovociti nell'arco di 15-20 minuti. Il prelievo è effettuato in genere due
volte per settimana e ripetuto in funzione del numero di embrioni richiesto per molte settimane
senza provocare alcuna lesione alla donatrice. Alla sospensione dei prelievi la donatrice manifesta
un calore fertile entro 7-10 giorni. Un altro vantaggio di questa tecnica è che non è richiesto nessun
trattamento ormonale soprattutto se il prelievo viene effettuato con regolarità 1-2 volte la settimana;
questo è particolarmente importante per gli animali giovani e per le vacche ipofertili. Nel caso si
utilizzino vitelle donatrici di poche settimane, il prelievo degli ovociti viene effettuato per via
laparotomica, visualizzando l'ovaio e aspirando direttamente i follicoli (13).
Analisi genetiche preimpianto
La possibilità di accedere alle fasi di sviluppo dell'embrione preimpianto sia con la tecnica del
MOET, sia con la tecnologia in vitro, permette di effettuare indagini analitiche su una biopsia
(alcune cellule) dell'embrione. In particolare la diagnosi del sesso dell'embrione sta diventando una
pratica consolidata come anche la diagnosi di alcune malattie genetiche. La determinazione del
sesso è basata sull'amplificazione di sequenze specifiche localizzate sul cromosoma Y, utilizzando
sonde molecolari con la tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR) (14). Altre due
malattie genetiche (BLAD e CVD) possono essere diagnosticate su biopsia di embrione e / o
contemporaneamente alla determinazione del sesso.
Con le informazioni generate dallo studio e mappatura del genoma bovino sarà in futuro possibile
identificare marcatori associati a QTL o ad altri caratteri (resistenza alle malattie, fertilità, ecc.) che
potranno essere utilizzati per identificare caratteristiche genotipiche degli embrioni prima
dell'impianto, aumentando così l'accuratezza della selezione e riducendo i costi. Per quest'ultimo
tipo di analisi tuttavia è necessario sviluppare tecniche di amplificazione totale del genoma oppure
moltiplicare in coltura le cellule prese con la biopsia per avere sufficiente DNA genomico che
consenta la ricerca di più marcatori (15).
Sessaggio del seme
La disponibilità di seme sessato permette la produzione di embrioni a sesso predeterminato. I
quantitativi ancora piuttosto limitati di spermatozoi sessati che si possono ottenere con le
apparecchiature attuali, rendono l'utilizzo del seme sessato particolarmente indicato per la
fecondazione in vitro (16). Oltre al numero limitato di spermatozoi ottenibili con la tecnologia
attuale, il seme che è passato attraverso il citofluorimetro per la separazione ha una motilità molto
ridotta. Quest'ultima caratteristica rende particolarmente indicato l'utilizzo di tecniche di
microfecondazione (ICSI, iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi) che però nel bovino sono
ancora in fase di messa a punto (17), al contrario di quanto avviene per la specie umana dove l'ICSI
è largamente utilizzata con successo.
Clonazione
La clonazione animale consiste nel creare copie genomiche di embrioni, feti o individui adulti. Si
utilizzano ovociti maturi che vengono svuotati del loro nucleo nei quali viene successivamente
introdotto il nucleo di una cellula di un embrione o di un feto o di un adulto. L'embrione così
ricostruito viene attivato e lo sviluppo embrionale riparte come se fosse un embrione normale. In
passato l'utilizzo di questa tecnica era limitato all'utilizzo di cellule dell'embrione e il numero
limitato di cellule disponibili e la bassa efficienza della tecnica di clonazione non ne ha permesso lo
sviluppo commerciale (18).
Le recenti acquisizioni nel campo della clonazione somatica (19) hanno creato le premesse per un
radicale cambio del sistema di allevamento del bovino. Si prospetta quindi la possibilità, già
utilizzata in campo vegetale, di avere dei nuclei di selezione dove gli animali saranno selezionati e
riprodotti seguendo le tecniche descritte sopra; quindi, gli animali con le caratteristiche richieste
saranno clonati e gli embrioni saranno venduti agli allevamenti commerciali. La clonazione
somatica da animali adulti permette di utilizzare a fini produttivi animali di provato valore che sarà
mantenuto inalterato o quasi durante la riproduzione per clonazione (20, 21). Questi embrioni
(animali) saranno ovviamente del sesso desiderato e adattabili alle diverse situazioni ambientali dei
diversi allevamenti commerciali, potranno essere successivamente riprodotti con tecniche
tradizionali o fungere da riceventi per altri embrioni clonati. La nascita di Galileo, clone di Zoldo,
toro di razza bruna ottenuto dal nostro laboratorio nel gennaio del 1999, rappresenta un chiaro
esempio delle potenzialità della clonazione sia per chiarire aspetti di biologia dello sviluppo
(Galileo è stato ottenuto da un leucocita di Zoldo) che per possibili impieghi zootecnici (Zoldo era
allora il primo toro italiano nella razza bruna e tra i primi al mondo). Alla clonazione di Galilea
hanno fatto seguito tre cloni di Mtoto (22), un importante riproduttore di razza Frisona, due cloni di
Bassora, una vacca bruna di particolare valore e un clone di Zapping , una campionessa di razza
frisona. Di recente il nostro laboratorio ha clonato Prometea, il primo clone di cavallo al mondo
(23).
La clonazione somatica necessita di ulteriori ricerche affinché possa essere utilizzata su larga scala
a fini commerciali. Il limite attuale sta nel fatto che una elevata percentuale di gravidanze ottenute
con tali embrioni viene riassorbita, infatti solo il 5-10% delle gravidanze ottenute va a termine. Va
evidenziato il fatto che gli animali clonati come spra descritto sono copie genetiche , cioè dei
gemelli monozigoti dell’animale originale. Nonostante questo aspetto di fatto esiste una moratoria
sull’utilizzo agroalimentare degli animali clonati basata su pregiudizi, in quanto l’evidenza
scientifica preliminare non fornisce alcun elemente per ritenere questi animali e i loro prodotti un
rischio per la salute.
Le informazioni generate dalla mappatura del genoma combinate con le tecniche di clonazione
somatica rendono le modificazioni genetiche possibili anche nel bovino. Le caratteristiche che
potrebbero essere modificate vanno dai caratteri produttivi, alla resistenza alle malattie, alla
produzione di farmaci complessi, agli organi per i trapianti.
Mentre l'utilizzo della transgenesi per la produzione di farmaci (24) viene generalmente accettata,
l’ipotesi di una transgenesi per produrre derrate alimentari di origine animale è ancora oggetto di
discussione sia per quanto riguarda la salubrità di tali prodotti da un punto di vista alimentare sia
per la diffidenza spesso infondata di parte dell'opinione pubblica.
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