Monoclonal Mouse Anti-Human BCL6 Protein Clone PG

Monoclonal Mouse
Anti-Human BCL6 Protein
Clone PG-B6p
Codice n. M7211
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
Monoclonal Mouse Anti-Human BCL6 Protein, clone PG-B6p, è destinato all’uso in immunoistochimica.
L’anticorpo marca le cellule che esprimono la proteina BCL6 ed è un mezzo utile per la differenziazione dei
centri proliferativi nei linfomi linfocitici B cronici (BCL2+/BCL6-) dai centri germinali intrappolati in linfomi a
cellule del mantello (BCL2-/BCL6+) e per l’identificazione di cellule neoplastiche nel morbo di Hodgkin
nodulare, a predominanza linfocitaria (1). L’identificazione differenziale si avvale dei risultati di un pannello di
anticorpi. L’interpretazione clinica di un’eventuale colorazione o della sua assenza deve essere integrata
mediante studi morfologici avvalendosi di controlli adeguati e deve essere valutata nell’ambito dell’anamnesi
del paziente e di altri test diagnostici da parte di un patologo qualificato.
Cenni e spiegazioni
Il proto-oncogene BCL6 codifica per una proteina “zinc-finger”/POZ di peso molecolare pari a 92-98 kDa.
Nonostante le sei sequenze “zinc-finger” C-terminali, la proteina BCL6 si lega a sequenze specifiche di DNA di
geni bersaglio, dove agisce come repressore trascrizionale (2,3).
L’espressione di BCL6 sembra avere carattere ubiquitario, dal momento che è stata individuata a bassi livelli in
molti tessuti. Tuttavia, alti livelli di espressione di BCL6 sono limitati alle cellule della linea linfoide B e dei
muscoli scheletrici. Nella linea cellulare linfoide B, l’espressione di BCL6 sembra essere strettamente regolata
durante la differenziazione; una forte espressione si nota preferenzialmente nelle cellule B del centro germinale
(GC) ma non nelle cellule del plasma, nelle cellule B precursori, della zona del mantello e della memoria.
Anche le controparti neoplastiche delle cellule B del centro germinale, compreso il linfoma di Burkitt, il linfoma
follicolare e diffuso a grandi cellule, manifestano alti livelli di espressione di BCL6 (3).
La proteina BCL6 potrebbe essere implicata nella translocazione cromosomica dove la regione regolatoria del
gene BCL6 viene sostituita da un partner eterologo reciproco, come un gene dell’immunoglobulina (IG). La
sostituzione del promotore porta alla deregolazione dell’espressione di BCL6, che può essere associata a
linfomagenesi (3). Il riarrangiamento di BCL6 è una delle più comuni anomalie genetiche nel linfoma non
Hodgkin a cellule B, con una frequenza particolarmente elevata (28-40%) nel linfoma diffuso a grandi cellule
(2).
Reagente fornito
Anticorpo monoclonale murino fornito in forma liquida come coltura cellulare surnatante dialisata contro una
soluzione tampone Tris/HCl 0,05 mol/L, a pH 7,2, contenente NaN3 15 mmol/L.
Clone: PG-B6p (1). Isotipo: IgG1, kappa.
Concentrazione di IgG murine: fare riferimento all’etichetta sulla fiala.
La concentrazione della proteina tra i lotti potrebbe variare senza influenzare la diluizione ottimale. La
titolazione di ogni lotto è confrontata e regolata in base a un lotto di riferimento, per garantire la prestazione
della procedura di colorazione immunoistochimica da lotto a lotto.
Immunogeno
Proteina BCL6-glutatione S-transferasi (GST) ricombinante corrispondente agli amminoacidi 3-484 della
proteina BCL6 umana (1).
Specificità
L’analisi SDS-PAGE degli immunoprecitati tra l’anticorpo e i lisati totali delle cellule Bjab (BCL6+) e delle cellule
EB3 transfettate con BCL6 evidenzia una reazione con un frammento di peso molecolare pari a ~95 kDa
corrispondente a BCL6. Non si osserva alcuna reazione con le cellule Rd (BCL6-) e con le cellule EB3
transfettate con un plasmide di controllo (1).
Nel Western blotting di lisati totali di cellule Bjab e di cellule EB3 transfettate con BCL6, o di cellule EB3
transfettate con un controllo, l’anticorpo non ha marcato alcuna banda, il che suggerisce assenza di reattività
con la proteina BCL6 denaturata (1).
Come dimostrato dall’immunocitochimica, l’anticorpo cross-reagisce con la proteina BCL6-equivalente in vari
mammiferi, fra cui la mucca, il coniglio, il ratto, la pecora e il maiale. Non si è osservata cross-reattività nel
pollo e nel piccione (1).
Precauzioni
1. Per operatori specializzati.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle
concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma la sodio azide potrebbe reagire con
le tubature in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Per lo smaltimento del prodotto è
consigliabile sciacquare abbondantemente per prevenire la formazione di azidi metalliche nelle tubature.
3. Come per ogni prodotto di derivazione biologica, utilizzare procedure di manipolazione adeguate.
4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Conservazione
Conservare a 2–8°C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti sono
conservati in condizioni diverse da quelle specificate, le loro condizioni dovranno essere verificate dall'utente.
Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l'instabilità di questo prodotto; pertanto, è opportuno
analizzare un controllo positivo e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una
colorazione imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia
dovuta ad un probabile problema dell'anticorpo, contattare l’Assistenza Tecnica di Dako.
(103139-002)
M7211/IT/KRM/2008.09.30 p. 1/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Preparazione
del campione
Sezioni in paraffina: l’anticorpo può essere usato per la marcatura di sezioni di tessuto incluse in paraffina, fissate
in formalina. È necessario un pre-trattamento dei tessuti con smascheramento termoindotto dell’epitopo. I
risultati migliori si ottengono con la soluzione di smascheramento Dako Target Retrieval Solution, a pH elevato,
codice n. S3308, oppure con il tampone Tris 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, pH 9,0. Tuttavia, la soluzione di
smascheramento Dako Target Retrieval Solution, codice n. S1700, oppure il tampone citrato 10 mmol/L, a pH
6,0 e il pre-trattamento di tessuti con proteinasi K sono risultati inefficaci. Le sezioni di tessuto non devono
andare a secchezza durante il trattamento o durante la successiva procedura di colorazione
immunoistochimica.
Sezioni congelate e preparazioni cellulari: l’anticorpo può essere utilizzato per la marcatura di sezioni congelate
fissate in acetone.
Procedura di colorazione
Diluizione: in sezioni di tonsille umane fissate in formalina, incluse in paraffina, Monoclonal Mouse Anti-Human
BCL6 Protein, codice n. M7211, può essere utilizzato in un rapporto di diluizione da 1:10 a 1:20 con
smascheramento termoindotto dell’epitopo per 20 minuti in soluzione Dako Target Retrieval solution, a pH
elevato, codice n. S3308, e incubando per 30 minuti a temperatura ambiente con l’anticorpo primario. Le
condizioni ottimali possono variare a seconda del campione e del metodo di preparazione e devono essere
determinate dai singoli laboratori. Il controllo negativo raccomandato è Dako Mouse IgG1, codice no. X0931, diluito
alla stessa concentrazione di IgG murine dell’anticorpo primario. A meno che la stabilità dell’anticorpo e del
controllo negativo diluiti non sia stata definita nella procedura di colorazione specifica, si raccomanda di diluire i
reagenti immediatamente prima dell’uso oppure di diluire con il diluente per anticorpi Dako Antibody Diluent, codice
n. S0809. È necessario includere un controllo positivo e un controllo negativo per ogni campione del paziente.
Visualizzazione: si raccomanda l’uso dei kit Dako LSAB™+/HRP, codice n. K0679, e Dako EnVision™+/HRP ,
codice n. K4004 e K4006. Per le sezioni congelate e le preparazioni cellulari, il kit Dako APAAP, codice n.
K0670, rappresenta una buona alternativa nei casi in cui la perossidasi endogena può essere causa di
colorazione aspecifica. Seguire la procedura riportata nel kit di visualizzazione scelto.
Automazione: l’anticorpo è adatto per la colorazione immunoistochimica su piattaforme automatiche.
Caratteristiche specifiche
delle performance
Le cellule marcate con l’anticorpo mostrano una colorazione diffusa microgranulare limitata al nucleo. Una
intensa
colorazione citoplasmatica non associata a cromosomi in metafase si nota solamente nelle figure mitotiche (1).
Tessuti normali: nelle tonsille, l’anticorpo marca in modo evidente i nuclei dei centroblasti dell’area scura e dei
centrociti dell’area chiara basale e apicale dei centri germinali. Inoltre, l’anticorpo marca circa il 10% delle cellule T
del centro germinale. Non è stata osservata alcuna marcatura nelle cellule del plasma, nei macrofagi, nelle cellule
follicolari dendritiche e nei linfociti del mantello follicolare IgD+/IgM+. Nella milza, si è evidenziato un pattern di
colorazione simile a quello delle tonsille, ma in aggiunta l’anticorpo ha marcato alcune cellule diffuse linfoide-simili di
fenotipo indefinito. In tessuti extra-linfoidi, l’anticorpo ha marcato debolmente l’epitelio squamoso delle tonsille, del timo
e della pelle. Non si è osservata alcuna marcatura nel fegato, nella tiroide, nella muscolatura striata e nel rene (1).
Tessuti anomali: sono stati sottoposti ad analisi con l’anticorpo 173 casi di neoplasie linfoidi umane. Fra i linfomi o
le leucemie a cellule B, sono risultati positivi 24 su 24 linfomi centro-follicolare, 29 su 30 linfomi diffusi a grandi
cellule e 13 su 13 linfomi di Burkitt. Non si è osservata alcuna marcatura in 7 su 7 leucemie linfoblastiche acute
pre-B, 16 su 16 leucemie a piccoli linfociti/linfocitiche croniche delle cellule B, 6 su 6 leucemie a cellule capellute,
22 su 22 leucemie a cellule del mantello e 14 su 14 linfomi della zona marginale. Fra i linfomi o le leucemie a
cellule T, 4 su 8 linfomi anaplastici a grandi cellule sono risultati positivi, mentre non si è osservata alcuna
marcatura in 10 su 10 linfomi linfoblastici acuti, 3 su 3 micosi fungoidi, 6 su 6 linfomi a cellule T periferiche e 2 su 2
linfomi a cellule T periferiche (AILD-simili). Dei casi di morbo di Hodgkin analizzati, sono risultati positivi 5 su 5 casi
nodulari a predominanza linfocitaria, 1 su 4 casi di sclerosi nodulare e 1 su 3 a cellularità mista (1).
Fra i linfomi non-Hodgkin correlati all’AIDS, l’anticorpo ha marcato 11 su 11 linfomi a piccole cellule non clivate, 7
su 7 linfomi a grandi cellule non clivate (LNCCL) e 2 su 9 (linfoplasmocitoide) linfomi plasmacitoidi immunoblastici
a grandi cellule (IBLP). Nei linfomi del sistema nervoso centrale AIDS- correlati, l’anticorpo ha marcato 4 su 4 casi
di LNCCL e nessuno dei 4 casi di IBLP. Non si è osservata alcuna marcatura in 5 casi di linfoma ad effusione
primaria (PEL) e in 6 casi di linee cellulari AIDS-PEL (4).
Riferimenti bibliografici
1. Flenghi L, Bigerna B, Fizzotti M, Venturi S, Pasqualucci L, Pileri S, et al. Monoclonal antibodies PG-B6a
and PG-B6p recognize, respectively, a highly conserved and a formol-resistant epitope on the human BCL-6
protein amino-terminal region. Am J Pathol 1996;148:1543-55.
2. Ye BH. BCL-6 in the pathogenesis of non-Hodgkin’s lymphoma. Cancer Invest 2000;18:356-65.
3. Nakamura Y. Internal deletions within the BCL6 gene in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. Leuk Lymphoma
2000;38:505-12.
4. Carbone A, Gaidano G, Gloghini A, Larocca LM, Capello D, Canzonieri V, et al. Differential expression of
BCL-6, CD138/syndecan-1, and Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein-1 identifies distinct
histogenetic subsets of acquired immunodeficiency syndrome-related non-Hodgkin’s lymphomas. Blood
1998;91:747-55.
(103139-002)
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