26 Nadal

STUDIO FUNZIONALE DELLA BARRIERA INTESTINALE
NEI PAZIENTI CON CIRROSI EPATICA ED
IPERTENSIONE PORTALE
E. Nadal¹, A. Buda², D. Pizzuti², L. Nai², P. Burra¹, M. Senzolo¹
¹Unità
Unità di Trapianto Multiviscerale, Gastroenterologia,
Dipartimento di Scienze Chirurgiche e Gastroenterologiche,
²Gastroenterologia,
Dipartimento di Scienze Chirurgiche e Gastroenterologiche,
Università
Università Ospedale di Padova
INTRODUZIONE
- I pazienti con cirrosi epatica sono caratterizzati da elevati livelli di
endotossiemia che aumentano parallelamente alla severità della malattia epatica
e possono aumentare le complicanze (U Thalheimer , AK Burroughs Gut 2005)
- La traslocazione batterica
intestinale
è
riconosciuta essere il principale
meccanismo responsabile degli elevati livelli di endotossiemia nel paziente con
cirrosi epatica, in associazione con diminuzione della clearance
epatica e
presenza di shunt porto-sistemici (Guarner C, Soriano G, Eur J Gastroenterol Hepatol 2005)
- Nel paziente con cirrosi epatica l’intestino è sede di numerose alterazioni tra le
quali: overgrowth batterico, dismotilità ed alterazione di barriera intestinale
(Ramachandran A, Balasubramanian K, Journal of Gastroenterology and Hepatology 2001)
INTRODUZIONE
- La permeabilità intestinale nei pazienti con cirrosi epatica è stata dimostrata
alterata mediante varie metodiche indirette
(Kalaitzakis E, Bjornsson E SJ of
Gastroenterology 2006)
- Tuttavia non sono presenti attualmente studi che valutino direttamente le
alterazioni funzionali e strutturali dell’epitelio intestinale nel paziente con
cirrosi epatica
- Le opzioni terapeutiche utilizzate sono finalizzate alla modificazione della
flora intestinale, ma l’abbassamento della pressione portale potrebbe
migliorare la funzionalità di barriera diminuendo il danno mucoso da
congestione vascolare (Xu WH, Li JS HBPC Int 2002)
SCOPO
- Valutare l’integrità funzionale della barriera intestinale in pazienti
con cirrosi epatica ed ipertensione portale mediante:
- test lattulosio/mannitolo
- metodica Ussing-chamber
- endoscopia confocale con fluoresceina
- Valutare l’integrità strutturale della barriera intestinale mediante lo
studio delle proteine di giunzione stretta epiteliale, ZO-1 ed
occludina
- Correlare la permeabilità intestinale al grado di ipertensione portale
- Valutare l’efficacia del β-bloccante nel migliorare le alterazioni della
funzionalità della barriera intestinale
PAZIENTI
- 20 pazienti con cirrosi epatica ed ipertensione portale sottoposti ad EGDS
- I pazienti sono stati divisi in base alla presenza od assenza di ascite.
- I criteri di inclusione sono stati:
- presenza di cirrosi epatica con ipertensione portale dimostrata da
pregresso riscontro endoscopico di varici esofagee o segni ecografici di
ipertensione portale
- non terapia con β-bloccanti
- astinenza da bevande alcoliche > 6 mesi
- sospensione antibiotici non assorbibili > 1 mese
- creatinina sierica < 130 µmol/L
- sospensione disaccaridi non assorbibili da 1 settimana
- Il gruppo di controllo : 10 soggetti con anamnesi farmacologica e
patologica negativa ed assenza di lesioni endoscopiche all’EGDS
test LATTULOSIO/MANNITOLO
- Permette la valutazione non invasiva della permeabilità intestinale
- Consiste nella somministrazione per via orale di una miscela di due
zuccheri di diverso peso molecolare e diversa via di assorbimento:
- Lattulosio, disaccaride con passaggio paracellulare
- Mannitolo, monosaccaride assorbito per via transcellulare
- Dopo raccolta delle 6 ore successive alla somministrazione gli
zuccheri vengono dosati mediante HPLC nelle
urine ed il loro
rapporto permette di valutare l’integrità della barriera intestinale.
- I valori inferiori a 0.025 sono considerati normali.
USSING CHAMBERS
- Tecnica di valutazione in vitro della permeabilità paracellulare
mediante la misurazione della resistenza transepiteliale o del suo
reciproco (conduttanza).
- La resistenza transepiteliale viene calcolata con la Legge di Ohm,
dividendo la differenza di potenziale (∆P) per l’intensità di corrente
(Isc).
• Si misura la differenza di potenziale
tra il versante mucosale e quello
sierosale attraverso 2 elettrodi
• Si
esegue
un
voltage-clamp
attraverso la corrente di cortocircuito
(Isc)
• La Isc correla con il trasporto attivo
transepiteliale.
IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA PROTEINE DI
GIUNZIONE ZO-1 E OCCLUDINA
- Si è eseguita immunofluorescenza su tessuto per le proteine delle giunzioni
strette ZO-1 e Occludina
Metodica
1. Criosezionamento
2.Fissazione in acetone a -20°C
3. Reazione Ag-Ab: incubazione con Ab primario e successivamente
Ab
secondario Goat anti-rabbit IgG coniugato con Tritc (Texas Red)
4. Lettura al microscopio confocale
- La distribuzione della fluorescenza corrisponde alla distribuzione dell’Ag nel
tessuto.
ENDOMICROSCOPIA CONFOCALE
- Permette un’analisi istologica “in vivo” con una risoluzione
subcellulare.
- Minisonda endoscopica dotata di sistema laser confocale che
genera immagini dinamiche in grado di evidenziare le strutture
cellulari con profondità 70µm-130 µm e campo visione 500x500µm
- L’esame è condotto dopo infusione endovenosa di fluoresceina
sodica 10% per un totale di 1.5ml-5ml.
CARATTERISTICHE DI PAZIENTI E CONTROLLI
Età (anni)
Sesso (M/F)
Cirrotici con
ascite (n=10)
Cirrotici senza
ascite (n=10)
Controlli
(n=10)
p
63.5 ± 5.5
61.8 ± 11.3
44.3 ± 7.9
0.02*
4/6
ns
6/4
7/3
Eziologia
Virale
(HCV/HBV)
ns
3/1
5/0
-
ns
Alcolica
4
3
-
ns
Altro
2
2
-
ns
Classe Child-Pugh
(A/B/C)
0/5/5
3/7/0
-
ns
MELD score medio
11.9 ± 4.8
10 ± 1.8
-
ns
4/4/2
7/3/0
-
ns
6/4
5/5
-
ns
Duodenopatia
4/6
congestizia (si/no)
* controlli versus cirrotici tutti
3/7
-
ns
Varici esofagee
(F1/F2/F3)
Segni rossi (si/no)
PREVALENZA DI ALTERAZIONE TEST
LATTULOSIO/MANNITOLO IN PAZIENTI E CONTROLLI
p=0.03
RAPPORTO PERCENTUALE DI ESCREZIONE URINARIA
LATTULOSIO/MANNITOLO IN PAZIENTI E CONTROLLI
escrezione urinaria Lattulosio/mannitolo
p=0.03
p=0.02
cirrotici test L/M
alterato
cirrotici test L/M
normale
controlli
RESISTENZA TRANSEPITELIALE ALLE USSING
CHAMBERS IN PAZIENTI E CONTROLLI
Ω x Cm2
P<0.001
cirrosi
controlli
RISULTATI- immunofluorescenza ZO-1
ZO-1 cirrosi
test L/M alterato
ZO-1 controllo
ZO-1 cirrosi
test L/M nei limiti
RISULTATI- immunofluorescenza Occludina
Occludina cirrosi
test L/M alterato
Occludina
controllo
Occludina cirrosi
test L/M nei limiti
RISULTATI- endomiscroscopia confocale
controllo
B
C
A
RISULTATI- endomiscroscopia confocale
paziente con cirrosi
RISULTATI- endomiscroscopia confocale
“spillage” nel paziente cirrotico
EFFETTI TERAPIA BETA BLOCCANTI NON SELETTIVI
RESISTENZA TRANSEPITELIALE
USSING CHAMBERS
Ω x Cm2
Escrezione urinaria Lattulosio/mannitolo
TEST LATTULOSIO/MANNITOLO
RISULTATI- terapia beta bloccanti non selettivi
Endomicroscopia confocale
Prima beta bloccanti
dopo beta bloccanti
CONCLUSIONI
- Pazienti
con cirrosi epatica presentano alterazione
permeabilità intestinale che peggiora in presenza di ascite
della
- La alterazione della permeabilità intestinale, valutata mediante
test lattulosio/mannitolo sembra correlare con una diminuita
resistenza elettrica trans-epiteliale dovuta a danno a livello di tight
junctions
- L’occludina sembrerebbe sede di danno delle tight junction nel
paziente cirrotico
- Tali alterazioni epiteliali potrebbero essere conseguenti alla
presenza di edema, congestione, ipervascolarizzazione ed
iperpermeabilità capillare nei villi intestinali, alterazioni visibili in
vivo mediante endomicroscopia confocale
- L’uso dei β-bloccanti, riducendo la pressione portale, potrebbe
normalizzare l’ipervascolarizzazione e la congestione vascolare
mucosa intestinale e conseguentemente migliorare le alterazioni di
barriera intestinale