Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains/FITC

Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains/FITC, Rabbit F(ab’)2
Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains/RPE, Rabbit F(ab’)2
Uso previsto
Codice N. F0435
Codice N. R0437
Per uso diagnostico in vitro.
F0435 e R0437 sono finalizzati per l’utilizzo nella citometria a flusso. Nella citometria a flusso, gli anticorpi anticatene leggere lambda sono utili per la dimostrazione delle catene leggere lambda di superficie cellulare e,
pertanto, per l’identificazione di monoclonalità (eccesso clonale) nelle malattie linfoproliferative delle cellule B
con un insieme di altri anticorpi (1-4). L’interpretazione dei risultati deve essere effettuata da patologi qualificati,
nel contesto dell’anamnesi clinica del paziente e di altri test diagnostici.
Introduzione
La maggior parte delle cellule B, ad esclusione delle cellule pre-B e pre-B progenitrici e delle cellule
plasmatiche mature, esprime immunoglobuline di superficie. Ogni cellula esprime soltanto un tipo di catena
leggera. Nel sangue periferico e nei linfonodi normali c’è un insieme di cellule kappa positive e lambda positive,
con due terzi delle cellule che esprimono le kappa e un terzo che esprime le lambda (5). Siccome i neoplasmi
linfoidi sono normalmente espansioni clonali di una cellula singola, le cellule maligne esprimono uniformemente
lo stesso isotopo di catena leggera. Le malattie linfoproliferative croniche neoplastiche delle cellule B possono
spesso essere identificate utilizzando la dimostrazione di una predominanza marcata di cellule che esprimono
un singolo tipo di catena leggera (4). Sono stati descritti rari casi di linfoma non-Hodgkin con cellule B lambdanegative o kappa-negative (4, 6).
Reagente fornito
I coniugati anti-catene leggere lambda, F0435 e R0437 sono stati prodotti da un frammento F(ab')2 di anticorpo
policlonale di coniglio isolato per affinità. I coniugati vengono forniti in forma liquida in tampone contenente 1%
di albumina sierica di bovino (BSA) e 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Utilizzare 10 µL di prodotto per la colorazione di
un numero di leucociti da sangue periferico umano normale fino a 106.
Concentrazione del coniugato g/L: Vedere l’etichetta della fiala
Anticorpo
Codice n.
Fluorocromo
Reagente Ig
Codice n.
F0435
Isotiocianato di fluorescina isomero 1 (FITC)
X0929
R0437
R-ficoeritrina (RPE)
X0930
Preparazione
1.
L’anticorpo usato per la coniugazione dell’isotiocianato di fluorescina isomero 1 (FITC) e del coniugato di
R-ficoeritrina è stato assorbito in fase solida con proteine del plasma umano per rimuovere gli anticorpi
indesiderati.
2.
L’anticorpo assorbito è stato ulteriormente purificato per cromatografia di affinità su una colonna con
catene leggere lambda umane immobilizzate.
3.
L’anticorpo isolato per affinità è stato poi degradato con pepsina e il frammento F(ab')2 è stato isolato
tramite filtrazione su gel.
4.
Infine, il frammento F(ab')2 è stato coniugato con isotiocianato di fluorescina isomero 1 o con Rficoeritrina.
Immunogeno
Catene leggere di immunoglobulina policlonale di tipo lambda isolate da un pool di sieri umani
Specificità
L’anti-catene leggere lambda reagisce con le catene libere lambda e con le catene lambda nelle molecole
intatte di immunoglobulina.La specificità è stata accertata come descritto qui di seguito. Per ottenere la
sensibilità massima, i test di specificità con immunoelettroforesi crociata e ELISA sono stati eseguiti prima
della purificazione per affinità e della degradazione con pepsina.
Immunoelettroforesi crociata. Quando l’anticorpo viene testato con il plasma umano appaiono soltanto
precipitati relativi a lambda. Colorazione Coomassie Brilliant Blue.
Citometria a flusso: Quando l’anti-catene leggere lambda viene applicato come descritto nella procedura di
colorazione insieme a anti-CD19/RPE, HD37, o anti-CD19/FITC, HD37, su sangue intero umano lisato, si
osserva una colorazione specifica di una parte dei linfociti B CD19-positivi che corrisponde alla gamma di
espressione prevista della catena leggera lambda.
L’analisi mediante citometria a flusso di sospensioni di cellule singole da campioni di tessuti fissati in formalina,
inseriti in paraffina ha dimostrato che l’anti-catene leggere lambda marca i nodi linfatici iperplastici reattivi (10/10
casi). Nei linfomi non Hodgkin l’anticorpo marcava 5/10 casi (5). I casi rimanenti sono risultati positivi per le
catene leggere kappa (4/10 casi) o non mostravano alcuna espressione di catene leggere (1/10 casi) (4).
L’analisi flusso-citometrica dei linfociti del sangue periferico dimostra che l’anti-catene leggere lambda marca una
proporzione di leucemie linfocitiche croniche delle cellule B. Pertanto in uno studio di 121 casi (2), 17 sono
risultati positivi per lambda. In un altro studio di 165 casi (3), 68 sono risultati positivi per lambda.
Precauzioni
1. Per operatori specializzati.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle
concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma la sodio azide potrebbe reagire con
le tubature in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Per lo smaltimento del prodotto è
consigliabile sciacquare abbondantemente per prevenire la formazione di azidi metalliche nelle tubature.
3. Come per ogni prodotto di derivazione biologica, utilizzare procedure di manipolazione adeguate.
4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
(104073-003)
F0435/R0437/IT/LHP/2013.01 p 1/2
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5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Conservazione
Conservare al buio ad una temperatura compresa tra 2-8 C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata
sulla fiala. Qualora i reagenti venissero conservati in condizioni diverse da quelle specificate, le condizioni devono
essere verificate dall’utente. Questo prodotto non mostra segni visibili evidenti di instabilità. Pertanto, vanno
eseguiti controlli positivi e negativi contemporaneamente ai campioni del paziente. Durante il periodo di
conservazione si potrà sviluppare una piccola quantità di precipitato che causa una colorazione non specifica
sottile e granulare. Tramite un filtraggio semplice (filtro di acetato di cellulosa da 0,22 µm), verrà ripristinata la
qualità elevata del coniugato. I coniugati non devono essere conservati in forma diluita. Qualora si osservasse
una colorazione anormale che non può essere attribuita a variazioni di procedure di laboratorio e si sospettasse un
problema relativo all’anticorpo, mettersi in contatto con il nostro Servizio Tecnico.
Nota procedurale
Prima di colorare i campioni di sangue periferico, le cellule mononucleari devono essere isolate mediante
centrifugazione su un mezzo di separazione o il campione di sangue deve essere lavato per eliminare le
proteine sieriche solubili. Siccome i monociti umani legano le immunoglobuline sieriche tramite i loro ricettori Fc
di superficie, queste cellule devono essere rimosse mediante deplezione o devono essere identificate.
Procedure di colorazione
1.
2.
3.
4.
Raccogliere sangue venoso in una provetta contenente un anticoagulante
Trasferire 100 µL del sangue anticoagulato nella provetta.
Aggiungere 2 mL di 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. Miscelare delicatamente usando un agitatore vortex.
Centrifugare a 300 x g per 5 minuti, poi aspirare il surnatante, lasciando circa 50 µL di liquido.
5.
6.
Ripetere le istruzioni riportate ai passi 3 e 4 ancora due volte.
Aggiungere 10 µL di frazione immunoglobulinica di coniglio, codice n. X0903, per bloccare la reazione.
Miscelare delicatamente utilizzando un agitatore vortex e incubare al buio a 37 °C per 30 minuti.
7. Aggiungere 10 µL di anti-catene leggere lambda coniugato con il fluorocromo. Miscelare delicatamente.
8. Usare un frammento F(ab’)2 non reattivo di immunoglobulina di coniglio, coniugato con lo stesso
fluorocromo, come controllo negativo (vedere la tabella).
9. Incubare al buio a 4 °C per 30 minuti.
10. Aggiungere 1-2 mL di reagente lisante d’eritrociti ad ogni provetta e miscelare delicatamente. Seguire le
raccomandazioni del produttore per il tempo e la temperatura d’incubazione.
11. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
12. Aspirare il surnatante, lasciando circa 50 µL di liquido.
13. Aggiungere 2 mL di 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. Miscelare delicatamente usando un agitatore vortex.
14. Ripetere le istruzioni riportate ai passi 11 e 12.
15. Risospendere il pellet in un liquido adatto per citometria a flusso e cioè 0,3 mL di paraformaldeide
(fissativo) all’1% in 0,01 mol/L PBS, pH 7,4.
16. Analizzare su un citometro a flusso.
Per il controllo del reagente e della preparazione, si raccomanda di includere un campione idoneo di controllo
positivo e negativo adatto ad ogni test. Va notato che i coniugati di fluorocromo sono sensibili alla luce,
pertanto i campioni vanno protetti dalla luce durante la procedura di colorazione e fino all’analisi.
Riferimenti bibliografici
1.
Johnson A, Olofsson T. Flow cytometric clonal excess analysis of peripheral blood, routine handling, and
pitfalls in interpretation. Cytometry 1993;14:188-95.
2.
Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell
chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916.
3.
Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic
characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica
1993;78:18-24.
4.
Leers MPG, Theunissen PHMH, Ramaekers FCS, Schutte B, Nap M. Clonality assessment of
lymphoproliferative disorders by multiparameter flow cytometry of paraffin-embedded tissue: an additional
diagnostic tool in surgical pathology. Hum Pathol 2000;31:422-7.
5.
Deegan MJ. B lymphocytes and plasma cells: their development and identification. In: Keren DF, editor.
Flow cytometry in clinical diagnosis. Chicago: ASCP Press; 1989. p. 139-63.
6.
Kaleem Z, Zehnbauer BA, White G, Zutter MM. Lack of expression of surface immunoglobulin light
chains in B-cell non-Hodgkin lymphomas. Am J Clin Pathol 2000;113:399-405
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