Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/FITC Rabbit F(ab`)2

Polyclonal Rabbit
Anti-Human IgG/FITC
Rabbit F(ab’)2
Codice n. F0185
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
F0185 è finalizzato per l’uso nella citometria a flusso. Nella citometria a flusso, gli anticorpi anti-lgG sono utili
per la dimostrazione delle lgG di superficie cellulare e, pertanto, per la sottoclassificazione delle malattie delle
cellule B linfoproliferative con un insieme di altri anticorpi (1-6). L’interpretazione dei risultati deve essere
effettuata da patologi qualificati, nel contesto dell’anamnesi clinica del paziente e di altri test diagnostici.
Introduzione
La maggior parte delle cellule B, ad esclusione delle cellule pre-B e pre-B progenitrici e delle cellule
plasmatiche mature, esprime immunoglobuline di superficie. Le cellule pre-B esprimono catene µ citoplasmiche
ma non catene leggere, mentre i linfociti B precoci esprimono solo lgM di membrana. Inoltre, i linfociti B in
maturazione producono lgD che viene inserita nella membrana cellulare congiungendosi alle lgM e creando
una popolazione di linfociti B lgM+lgD, che rappresenta la popolazione più ampia di linfociti B circolanti negli
esseri umani. La riorganizzazione susseguente della regione costante dei geni delle catene
immunoglobuliniche pesanti dà come risultato delle cellule che esprimono lgG o lgA di membrana inizialmente
insieme alle lgM o alle lgD. L’esposizione all’antigene attiva la produzione di queste cellule, che possono
evolvere da precursori B meno maturi in una risposta primaria, o da cellule di memoria in una risposta
secondaria (7). Le cellule B della leucemia linfocitica cronica (B-CLL) sono normalmente positive sia per le lgM
che per le lgD di superficie, mentre le cellule positive per le lgG di superficie appaiono nel 3-25% dei casi (2-6).
I casi lgG positivi vengono osservati frequentemente nella leucemia a tricoleucociti, nel linfoma splenico con
linfociti villosi e nel linfoma cellulare follicolare (1, 5).
Reagente fornito
L’anti-lgG coniugato, F0185, è stato prodotto da un frammento F(ab')2 di anticorpo policlonale di coniglio isolato
per affinità. Il coniugato viene fornito in forma liquida in tampone contenente 1% di albumina serica di bovino
(BSA) e 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Ogni fiala di F0185 contiene 100 test (10 µL di F0185 per max. 106 leucociti
da sangue periferico normale umano).
Concentrazione del coniugato mg/L: Vedere l’etichetta sulla fiala.
Anticorpo
codice n.
F0185
Preparazione
Fluorocromo
FITC (isotiocianato di fluorescina isomero 1)
Controllo negativo
codice n.
X0929
1.
L’anticorpo usato per la coniugazione dell’isotiocianato di fluorescina isomero 1 (FITC) è stato assorbito
in fase solida con proteine del plasma umano per rimuovere gli anticorpi indesiderati.
2.
L’anticorpo assorbito è stato ulteriormente purificato per cromatografia di affinità su una colonna con lgG
umana immobilizzata.
3.
L’anticorpo isolato per affinità è stato poi degradato con pepsina e il frammento F(ab')2 e stato isolato
mediante filtrazione su gel.
4.
Infine, il frammento F(ab')2 è stato coniugato con isotiocianato di fluorescina isomero 1.
Immunogeno
lgG isolata da un pool di sieri umani normali.
Specificità
L’anti-lgG reagisce con le catene α dell’lgG umana. La specificità è stata accertata come descritto qui di
seguito. Per ottenere la sensibilità massima, i test di specificità con immunoelettroforesi crociata e ELISA
sono stati eseguiti prima della purificazione per affinità e della degradazione con pepsina.
Immunoelettroforesi crociata: Quando l’anticorpo viene testato con plasma umano appare soltanto l’arco di
precipitazione dell’lgG. Colorazione: Coomassie Brilliant Blue.
ELISA: Nel test ELISA indiretto non si osserva nessuna reazione significativa con lgG e lgM umane. Nel test
ELISA a sandwich con doppio anticorpo non viene osservata nessuna reazione significativa con plasma umano
privato di lgG.
Citometria a flusso: Quando viene testato su cellule di tonsille umane, l’anti-lgG marca una sottopopolazione
delle cellule CD19-positive.
Le analisi flusso-citometriche dei linfociti del sangue periferico dimostrano che l’anti-lgG marca una proporzione di
B-CLL. Pertanto in uno studio di 121 casi (3), 4 sono risultati positivi per lgG. In un altro studio di 165 casi (4),
42 sono risultati positivi per le lgG.
Precauzioni
1. Per operatori specializzati.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle
concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma la sodio azide potrebbe reagire con
le tubature in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Per lo smaltimento del
prodotto è consigliabile sciacquare abbondantemente per prevenire la formazione di azidi metalliche nelle
tubature.
3. Come per ogni prodotto di derivazione biologica, utilizzare procedure di manipolazione adeguate.
4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
(103335-002)
F0185/IT/LHP/2009.11.30 p. 1/3
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5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Conservazione
Conservare al buio ad una temperatura compresa tra 2-8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza sta mpata
sulla fiala. Qualora i reagenti venissero conservati in condizioni diverse da quelle specificate, le condizioni
devono essere verificate dall’utente. Non esistono segni visibili che possano indicare l’instabilità di questo
prodotto. Pertanto, vanno eseguiti controlli positivi e negativi contemporaneamente ai campioni del paziente.
Durante il periodo di conservazione si potrà sviluppare una piccola quantità di precipitato che causa una
colorazione non specifica sottile e granulare. Tramite un filtraggio semplice (filtro di acetato di cellulosa da 0,22
µm), verrà ripristinata la qualità elevata del coniugato. I coniugati non devono essere conservati in forma diluita.
Qualora si ottenga una colorazione imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle
procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un probabile problema dell'anticorpo, contattare l’Assistenza Tecnica
di Dako.
Nota procedurale
Prima di colorare i campioni di sangue periferico, le cellule mononucleari devono essere isolate mediante
centrifugazione su un mezzo di separazione o il campione di sangue deve essere lavato per eliminare le
proteine sieriche solubili. Siccome i monociti umani legano le immunoglobuline sieriche tramite i loro ricettori
Fc di superficie, queste cellule devono essere rimosse mediante deplezione o devono essere identificate.
Procedura di colorazione
1.
Raccogliere sangue venoso in una provetta contenente un anticoagulante.
2.
Trasferire 100 µL del sangue anticoagulato nella provetta.
3.
Aggiungere 2 mL di 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. Miscelare delicatamente usando un agitatore vortex.
4.
Centrifugare a 300 x g per 5 minuti, poi aspirare il surnatante, lasciando circa 50 µL di liquido.
5.
Ripetere le istruzioni descritte ai passi 3 e 4 ancora due volte.
6.
Aggiungere 10 µL di frazione immunoglobulinica di coniglio, codice n. X0903, per bloccare la reazione.
Miscelare delicatamente utilizzando un agitatore vortex e incubare al buio a 37 °C per 30 minuti.
7.
Aggiungere 10 µL di anti-IgG coniugato con il fluorocromo. Miscelare delicatamente.
8.
Usare un frammento non reattivo di immunoglobuline di coniglio F(ab’)2 e coniugato con lo stesso
fluorocromo, come controllo negativo (vedere la tabella).
9.
Incubare al buio a 4 °C per 30 minuti.
10.
Aggiungere 1-2 mL di reagente lisante d’eritrociti ad ogni provetta e miscelare delicatamente. Seguire le
raccomandazioni del produttore per il tempo e la temperatura d’incubazione.
11.
Centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
12.
Aspirare il surnatante, lasciando circa 50 µL di liquido.
13.
Aggiungere 2 mL di 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. Miscelare delicatamente usando un miscelatore a vortice.
14.
Ripetere le istruzioni riportate ai passi 11 e 12.
15.
Risospendere il pellet in un liquido adatto per citometria a flusso e cioè 0,3 mL di paraformaldeide
(fissativo) all’1% in 0,01 mol/L PBS, pH 7,4.
16.
Analizzare su un citometro a flusso.
Per il controllo del reagente e della preparazione, si raccomanda di includere un campione idoneo di controllo
positivo e negativo adatto ad ogni test. Va notato che i coniugati di fluorocromo sono sensibili alla luce,
pertanto i campioni vanno protetti dalla luce durante la procedura di colorazione e fino all’analisi.
Riferimenti bibliografici
(103335-002)
1.
van Dongen JJM, Adriaansen HJ. Immunobiology of leukaemia. In: Henderson ES, Lister TA, Greaves
MF, editors. Leukemia. Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo: WB Saunders
Company; 1996. p. 83-130.
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of flow cytometric immunophenotyping of 540 consecutive patients with B-cell chronic lymphocytic
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3.
Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell
chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916.
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characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica
1993;78:18-24.
5.
Batata A, Shen B. Immunophenotyping of subtypes of B-chronic (mature) lymphoid leukemia. A study of
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6.
Shen PUF, Fuller SG, Rezuke WN, Sherburne BJ, DiGiuseppe JA. Laboratory, morphologic, and
immunophenotypic correlates of surface immunoglobulin heavy chain isotype expression in B-cell chronic
lymphocytic leukemia. Am J Clin Pathol 2001;116:905-12.
7.
Deegan MJ. B lymphocytes and plasma cells: their development and identification. In: Keren DF, editor.
Flow cytometry in clinical diagnosis. Chicago: ASCP Press; 1989. p. 139-6.
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