esercitazioni di laboratorio di biologia

I.I.S.S. “E. Medi” Galatone - Lecce
Laboratorio di Biologia
Raccolte di esercitazioni pratiche di
Laboratorio di Biologia a cura del Prof. Notaro Fernando
Programma scolastico delle quinte classi
dello Scientifico Tecnologico
Insegnanti:
Classi interessate VA e VB
Prof.ssa Mazza Angela
Prof. Cecchini Marco
ITP prof. Notaro Fernando
a.s. 2010 2011
0
Sommario
OSSERVAZIONE DELLE SPUGNE .........................................................................................................................2
Obiettivo: Osservare la composizione interna di una spugna.......................................................................2
OSSERVAZIONE DEI NEMATODI ........................................................................................................................3
Obiettivo: Osservare i nematodi al microscopio ...........................................................................................3
Osservazione di un calamaro e di una cozza .....................................................................................................4
OBIETTIVO: Osservazione di due organismi appartenenti a due classi del phila dei molluschi: cefalopode
(calamaro) e bivalvo (cozza) ..........................................................................................................................4
Osservazione di tessuti: Connettivo, Osseo e Muscolare .................................................................................6
Obiettivo: Osservare e riconoscere i tessuti .....................................................................................................6
Il tessuto osseo ..................................................................................................................................................8
Azione digestiva della saliva sull’amido ............................................................................................................9
Oggetto: La prima digestione avviene nella bocca .......................................................................................9
Ricerca degli zuccheri riducenti e dell’amido negli alimenti .........................................................................10
Descrizione dell’esperienza .........................................................................................................................10
Ricerca delle proteine negli alimenti ...............................................................................................................15
Ricerca delle proteine e degli aa mediante reazione al biureto .....................................................................17
IL SANGUE........................................................................................................................................................19
Preparazione dello striscio di sangue ..........................................................................................................19
PRELIEVO DEL SANGUE ...................................................................................................................................20
Eritrociti .......................................................................................................................................................22
Piastrine.......................................................................................................................................................23
Leucociti ......................................................................................................................................................23
Dissezione del rene di maiale ..........................................................................................................................26
Analisi delle urine ............................................................................................................................................27
Introduzione ................................................................................................................................................27
Esame fisico .....................................................................................................................................................28
Esame chimico .................................................................................................................................................28
Esame microscopico ........................................................................................................................................29
Osservazione di vetrini preparati sul sedimento urinario ...............................................................................30
Obiettivo: osservare il sedimento urinario su vetrini preparati in laboratorio autorizzato........................30
Test di Verica………………………………………………………………………………………………………………………………………..…..32
1
OSSERVAZIONE DELLE SPUGNE
Obiettivo: Osservare la composizione interna di una spugna
Materiale utilizzato:




Spugna
Vetrino
Bisturi
Forbicetta
Prerequisiti:
Le spugne sono organismi con dimensioni che vanno da un centimetro a due metri; si nutrono filtrando
solo acqua di mare; sono quasi tutte marine e vivono attaccate sui fondali e scogli a differente profondità.
Gli anellidi invece sono specie di vermi marini, di acqua dolce e di terra. La loro caratteristica principale è la
divisione del corpo in segmenti visibili
Procedimento:
Per la preparazione dei vetrini si deve prendere uno strato sottilissimo di spugna dato che questa non è
trasparente.
Con l’ausilio delle forbicette e del bisturi si preleva una sottilissima parte di spugna, si mette sul vetrino e
si osserva al microscopio.
Nella spugna di mare si è trovato un anellide, un verme dei platelminti
1) pori inalanti 2) coanociti 3) pori esalanti
Osservazione al microscopio
Quello che si può vedere è la parete dell’osculo, che è molto difficile da distinguere in quanto si vede solo
un ammasso di cellule e filamenti.
2
OSSERVAZIONE DEI NEMATODI
Obiettivo: Osservare i nematodi al microscopio
Materiale utilizzato:






Terra
Lampada
Imbuto di Baerman
Pipetta
Becker
Acqua
Prerequisiti: I nematodi sono piccoli vermi bianchi. Un qualsiasi pugno di terra ospita numerose specie e
moltissimi esemplari di questa classe.
I nematodi sono chiamati anche vermi cilindrici perché presentano un corpo cilindrico a sezione
trasversale circolare. Sono sottili e lunghi e hanno un’estremità anteriore arrotondata e quella inferiore
appuntita detta coda.
Questi hanno poca esigenza di ossigeno animali e prendono l’ossigeno dall’ambiente esterno.
Fasi operative: Prendere della terra utilizzando l’imbuto di Baerman. L’imbuto viene posto sotto una
lampada e con la luce i vermi tendono ad allontanarsi e attraverso le maglie dell’imbuto vanno a cadere
nell’acqua contenuta nel becker sottostante.
Con l’utilizzo di una pipetta si prende il nematode presente nell’acqua. Si pone su di un vetrino per
microscopio e si chiude con un vetrino copri oggetti.
Osservazione al microscopio
3
OSSERVAZIONE DI UN CALAMARO E DI UNA COZZA
OBIETTIVO: Osservazione di due organismi appartenenti a due classi del phila dei
molluschi: cefalopode (calamaro) e bivalvo (cozza)
MATERIALE UTILIZZATO: Bisturi, Guanti di lattice, piano di dissezione, forbicine, spilli e coltello
ORGANISMI OSSERVATI: Calamaro (una seppia sarebbe più indicata per la dissezione) e cozza
Disegno:
Valva
mantello
PREREQUISITI TEORICI: Il phylum Mollusco rappresenta uno dei numerosi phyla esistenti in
natura, sia per numero di individui rappresentati nel phyla sia per il numero di classi che questo
comprende. Essi sono animali a simmetria bilaterale e possiedono un corpo molle generalmente
protetto da una conchiglia (nella classe dei cefalopodi di cui si parlerà in seguito, la conchiglia ha
avuto un processo evolutivo che l’ha fatta diventare molto più piccola e interna al corpo). Abitano
ambienti terrestri e acque dolci, ma soprattutto vivono in mare in prossimità dei fondali.
La maggior parte dei molluschi possiede una struttura corporea comune che la rende riconoscibile:
in un generico mollusco, si possono individuare una testa in cui si apre la bocca e hanno sede gli
organi di senso, un piede cioè una massa muscolare adibita al movimento dell’animale e una massa
viscerale, che contiene gli organi ben sviluppati della digestione avvolta e protetta da un mantello
che secerne la conchiglia.
Ad eccezione della classe dei bivalvi, i molluschi ricavano il loro nutrimento dall’ambiente
circostante raschiando il fondo marino per ricavare pezzetti di alghe o altre sostanze nutritive:
proprio a questo scopo, questi molluschi hanno sviluppato un organo che si trova nella parte
terminale della bocca che prende il nome di radula.
Come già detto il phyla dei molluschi comprende numerose classi tra cui le più importanti sono.
1. BIVALVI: che prendono il nome dalla caratteristica di avere due conchiglie che
racchiudono il corpo (con una struttura muscolare, il piede per il movimento)
4
2. GASTEROPODI: così chiamati per la doppia funzionalità del piede, sia come parte
motoria che come “contenitore” dei principali organi per la digestione
3. CEFALOPODI: il cui cervello è contenuto nella parte inferiore del corpo che adempie
anche alla funzione di movimento.
Per questa esperienza sono stati presi in esame un calamaro per la classe dei cefalopodi e una cozza
di mare per la classe dei bivalvi.
CALAMARO
La massa corporea del calamaro è racchiusa all’interno del mantello, che presenta una sorta di
pinna lungo ogni lato. Al di sotto del mantello si può riconoscere la testa del calamaro avente otto
braccia e due lunghi tentacoli, tutti dotati di ventosa lungo i margini. La bocca si trova al centro
della braccia ed è dotata di un “becco” di natura proteica che ha lo scopo di uccidere e spezzettare
le prede; in fondo alla bocca si può distinguere la radula.
Gli occhi, invece, sono posti esteriormente alla testa, su entrambi i lati, e sono molto simili a quelli
degli organismi invertebrati. Proprio sotto i bracci si può distinguere un tubicino trasparente che
costituisce il principale mezzo di locomozione dei cefalopodi, il sifone, che è un meccanismo a
propulsione permette piccoli spostamenti in tempi brevissimi.
FASI OPERATIVE E OSSERVAZIONI DI UN CALAMARO
Prima di tutto bisogna preparare un PIANO DI DISSEZIONE su cui procedere e operare senza il rischio
di sporcare e per poter tenere aperto il calamaro. Posato sul piano, con un bisturi o con una forbice
da cucina, si taglia longitudinalmente il mantello del calamaro in modo tale da poter osservare la
massa viscerale. Si nota subito come il capo (testa) del calamaro trovi prosecuzione nella massa
viscerale che è sorretta da una struttura semirigida che sorregge tutto il corpo e che deriva da una
rudimentale conchiglia (gladio o penna).
Dall’alto verso il basso si nota: una struttura tubolare gialla che dovrebbe essere l’ectopancreas e il
fegato, un canale rossastro (esofago) che sale fino ad una sacca anch’essa rossa cioè lo stomaco,
dopo di che il cibo sale ancora verso l’intestino cieco per la digestione completa, infine il bolo
raggiunge il fegato dove viene assorbito.
All’altezza dell’esofago si possono notare tre piccole strutture verdi, cioè i tre cuori dell’animale
(due branchiali e uno sistemico): i reni sono difficili da identificare e si allungano dal cuore verso il
fegato.
COZZA (prerequisiti e osservazioni)
La massa viscerale di una cozza è protetta da due conchiglie (valve) principalmente composte da
CaCO3 e si presentano esternamente di colore nero o nero-viola con sottili cerchi di accrescimento
radiali e concentrici verso la parte appuntita, invece internamente, si presenta di colore
madreperlaceo con una superficie liscia.Le due valve sono tenute insieme da una cerniera con tre –
quattro dentelli. La forma è grossolanamente con il margine valvare arrotondato da un lato e
appuntito dall’altro. Una volta aperto, il mollusco, mostra il mantello che contiene tutti gli organi
interni, tra cui quelli riproduttivi.
5
OSSERVAZIONE DI TESSUTI: CONNETTIVO, OSSEO E MUSCOLARE
OBIETTIVO: OSSERVARE E RICONOSCERE I TESSUTI: connettivo, osseo e muscolare tramite l’esame al
microscopio ottico di vetrini per esami istologici pre-preparati con un ingrandimento 4 e 10X (40x
per il tessuto muscolare
Materiale utilizzato:


Microscopio ottico
Vetrini per esami istologici
Disegno
6
PREREQUISITI: Le cellule del corpo umano sono organizzate secondo strutture gerarchiche ben
precise: più cellule che adempiono alla medesima funzione formano un TESSUTO. Differenti tipi
di tessuto coordinati nello svolgimento delle loro attività formano gli ORGANI. Questi a loro volta
possono considerarsi tra loro in modo tale da svolgere le più importanti funzioni dell’organismo.
Nonostante vi siano nel corpo umano circa 200 tipi di cellule, queste sono raggruppate solo in 4 tipi
di tessuto: connettivo, muscolare, nervoso ed epiteliale.
Il tessuto epiteliale è quel tessuto che ricopre la superficie esterna del corpo e di tutti gli organi,
canali e cavità interne in modo tale da proteggerli. Tenute assieme da particolari strutture come le
giunzioni occludenti e i desmosoni (simili alle giunzioni comunicanti delle cellule vegetali) le
cellule del tessuto epiteliale costituiscono un resistente involucro dell’organismo che non permette
il passaggio di sostanze all’interno dell’organismo tra le varie cellule epiteliali.
Il tessuto muscolare è il responsabile di ogni movimento, volontario o involontario del corpo
umano. La sua caratteristica è quella di riuscire a scontrarsi grazie all’interazione di sue catene
proteiche: la miosina e l’actina. Il reciproco avvicinamento di queste due proteine fa si che la
cellula muscolare riduca le proprie dimensioni e il reciproco allontanamento permette invece il
processo opposto.
A seconda se sono presenti all’interno delle cellule muscolari dei “depositi” di actina e miosina, il
muscolo si divide in: muscolo striato o scheletrico (caratteristiche sono infatti le sue striature),
muscolo cardiaco e muscolo liscio.
Il tessuto connettivo ha invece il compito di sostenere e proteggere gli altri tipi di tessuti. Le cellule
del tessuto connettivo sono immerse in una sostanza detta “matrice” e dei canali permettono la loro
comunicazione. Il tessuto nervoso permette invece il controllo dell’organismo tramite impulsi
elettrochimici.
FASI OPERATIVE (OSSERVAZIONI)
Le osservazioni che si potranno effettuare dopo aver posto un vetrino per esame istologico (vetrino
preparato in laboratorio d’analisi in cui dopo una biopsia vengono prelevate parti di tessuto che
s’intende esaminare tramite uno strumento detto Microtomo) sul microscopio, sono relative al
“Disegno”
7
IL TESSUTO OSSEO
Materiale occorrente:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Un osso di coscia di pollo
Seghetto per ferro (per tagliare a piccoli cilindri l’osso)
HCl 2M
Becher
Lametta nuova (o comunque affilatissima)
Pinzette
Blu di metilene sec. Loffler
Microscopio (tutto l’occorrente per microscopia)
Scatola di Petri
Procedimento:
1. Prelevare l’osso dalla coscia del pollo e privarlo della carne, della cartilagine,dei tendini;
lavarlo e sgrassarlo bene con acqua calda e detersivo;
2. Tagliare alcuni cilindretti di circa 2 cm usando il seghetto per il ferro;
3. Porre in acqua calda e detersivo, liberare dal midollo, sciacquare ben bene e mettere in un
becker con HCl 2M;
4. Chiudere il becher con il coperchio di una scatola Petri, o con pellicola trasparente e
lasciare agire l’acido per 3 ore. Trascorso il tempo l’osso sarà decalcificato e si presenterà
morbido al tatto, tanto che i cilindretti si schiacceranno al semplice contatto;
5. Togliere i pezzi dall’acido e, con le pinze e la lametta aprire con un taglio verticale;
6. Stendere i pezzi aperti sul fondo di una scatola Petri, con la lametta tagliare strisce
sottilissime di tessuto. Si consiglia di scartare il primo taglio di solito rovinato dalla
seghetta;
7. Procedere alla colorazione con blu di metilene sec. Loffler: deporre le sezioni sottilissime
appena tagliate sul portaoggetti su cui si trova una goccia di colorante, coprire col copri
oggetti e attendere circa 5 minuti prima di passare all’osservazione:
Osservazione
8
AZIONE DIGESTIVA DELLA SALIVA SULL’AMIDO
Oggetto: La prima digestione avviene nella bocca
Un importante zucchero complesso polisaccaride è l'amido. Per vedere l'amido contenuto in molti
cibi che noi mangiamo tutti i giorni, come ad esempio: la pasta, il pane, la polenta, le patate...,
Materiale occorrente:
 provetta + 2cc di saliva
 2 provette (una di queste con 1cc di amido al 2% per provetta di saliva) con 2cc amido al
2%
 Una patata
 Reattivo di Lugol
Procedimento:
1. Prova: Si sbuccia la patata, si taglia a pezzettini e si
mette nel frullatore con un po’ d’acqua e si frulla. Il
succo che esce si preleva con una pipetta e si mette in
una provetta. Si preleva con una pipetta pasteur una
goccia di succo di patata e si osserva al microscopio
l’amido come da figura. Successivamente si versa
nella provetta un cc di acqua e saliva, si agita e si
osserverà al microscopio una diminuzione dell’amido.
2. Prova: Riscaldiamo a bagnomaria le due provette per circa 20 m. a 40°C. Aggiungiamo
alle provette il lugol.
Risultati:
Nella provetta con solo amido si determina una colorazione blu in
presenza di tintura di iodio.
Nell’altra con la saliva, l’amido è stato trasformato in zuccheri più semplici
e non si registra la colorazione blu.
Si può verificare , mettendo nella 2° provetta il liquido di Feeling che rivela
con una colorazione rosso-arancione la presenza degli zuccheri semplici che
si sono formati dopo l’azione della ptialina della saliva.
9
RICERCA DEGLI ZUCCHERI
RIDUCENTI E DELL’AMIDO NEGLI ALIMENTI
Descrizione dell’esperienza
Per questa esperienza abbiamo utilizzato due reattivi:

Il reattivo di Feeling A (solfato di rame, che dà alla soluzione un colore azzurro) e feeling
B (soluzione di tartrato di potassio). Il solfato di rame, in presenza di zuccheri, forma un
precipitato di colore rosso mattone. Questo test funziona solo per gli zuccheri riducenti.
Appartengono a questa categoria quasi tutti gli zuccheri ad eccezione del saccarosio.

Il reattivo di Lugol, per ricercare la presenza di amido (a-amilosio) in campioni organici.
Infatti, in presenza di tintura di iodio (di colore marrone), la soluzione contenente amidi
assume una colorazione viola scuro.
Materiale occorrente:
Provette numerate
Portaprovette
Bacchetta di vetro per mescolare
reattivo Fehling
acqua
vari alimenti
contagocce
coltello
mortaio con pestello
fornello
treppiede e reticella
becher
omogeneizzatore (o un frullatore)
-
Reattivi :



Feeling A (solfato di rame, che dà alla soluzione un colore azzurro)
Feeling B (soluzione di tartrato di potassio).
Reattivo di Lugol
Campioni:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Patata;
Cipolla;
Farina;
Zucchero di canna;
Latte;
Fruttosio
10
7. Saliva + farina;
8. Saccarosio;
9. Acqua
Procedimento:
La preparazione dei campioni da analizzare viene effettuata preparando delle soluzioni. Per la
patata e la cipolla si eseguono delle fasi di preparazione differenti; la patata si deve sbucciare,
tagliare a pezzettini e mettere nel frullatore con un po’ d’acqua e frullare. Il succo che esce si
preleva con una pipetta e si mette in una provetta numerata, già sistemata nel porta provette. La
cipolla si deve sbucciare e tagliare a pezzettini, frullarla e il succo prelevato con una pipetta viene
versato in un’altra provetta numerata.
Tutti i campioni così preparati vengono sistemati in un porta provette e numerati.
1. Prova con il reattivo di Lugol.
Si prepara un altro porta provette dove vengono sistemate 8 nuove provette e numerate secondo la
numerazione delle soluzioni già preparate. Si prepara inoltre, una soluzione che chiameremo
bianco formata da solo acqua. Versare in ogni provetta 1ml di soluzione da analizzare e 1 ml di
reattivo di Lugol.
Si osserva una variazione di colore (formazione di colore blu) rispetto al bianco, vuol dire che
l’alimento contiene amido.
Risultati:
COLORAZIONE
ALIMENTO
dopo l’aggiunta del
reattivo di Lugol
POSITIVO
Patata
Blu
si
Cipolla
Giallo
Farina
Blu
NEGATIVO
si
si
Zucchero di canna
Giallo
si
Latte
Giallo
si
Fruttosio
Giallo
si
Farina + Saliva
Saccarosio
Bianco
Giallo - Blu
si
Giallo
si
si
----------------
---------------------
si
Spiegazione dei risultati
Il reattivo di Lugol è una soluzione utilizzata nei laboratori di biologia come colorante per marcare alcune
strutture cellulari durante l'osservazione microscopica o per il riconoscimento della presenza di amido.
11
Composizione: Il reattivo di Lugol è una soluzione acquosa di iodio e ioduro di potassio di colore
marrone chiaro, inodore. In soluzione le molecole di KI (ioduro di potassio) si dissociano e l'anione
I- tende a reagire con lo iodio elementare secondo la reazione:
I2 + KI --> I3- + K+
Preparazione della soluzione: Essa si prepara facendo sciogliere 20 grammi di KI in 100 ml di
acqua distillata e aggiungendo 10 grammi di Iodio cristallino; la soluzione madre così ottenuta
viene quindi diluita in ragione di 1:4 in acqua distillata per ottenere la soluzione di lavoro.
Comunque, servendo spesso come colorante istologico o reattivo per analisi qualitative, nella
pratica di laboratorio esiste una certa variabilità nella quantità delle sostanze componenti. I fumi di
tale reattivo sono velenosi e non devono essere inalati: per la sua preparazione occorre perciò
lavorare sotto la cappa aspirante.
Dal punto di vista del rischio per la salute si ricorda che il reattivo di Lugol è:
- Nocivo per inalazione
- Nocivo a contatto con la pelle
- Altamente tossico per gli organismi acquatici.
Reattività con l'amido: L'amido è formato di due specie molecolari, l'amilosio e l'amilopectina.
Lo ione I3- tende a complessarsi con l'amilosio, legandosi alla parte interna della catena elicoidale
dello stesso, e alterando le proprietà fisiche del polisaccaride. Il complesso risultante assorbe la
luce, producendo una decisa colorazione verso il blu scuro; tale viraggio quindi non dipende da una
reazione chimica. Questo assorbimento dello iodio alla catena è reversibile, per cui con il
riscaldamento il colore sparisce.
OSSERVAZIONI
Con il reattivo di Lugol notiamo che solo la patata e la farina sono positive e quindi contengono
l’amido. Si osserva che la farina + la saliva in laboratorio ha dato un risultato a metà; dove la saliva
si è mescolata con la farina la colorazione aveva una colorazione gialla per effetto dell’enzima
Amilasi, dove la saliva non si era mescolata con la farina la colorazione era blu indice della
presenza dell’amido
2. Prova con il reattivo di Feeling
Si prepara un altro porta provette dove vengono sistemate 8 nuove provette e numerate secondo la
numerazione delle soluzioni già preparate. Anche qui si prepara una soluzione che chiameremo
bianco formata da solo acqua. Versare in ogni provetta 1ml di soluzione da analizzare e 1 ml di
reattivo di feeling A e Feeling B. Le provette vengono poste a bagno maria in un becker e
riscaldate su piastra elettrica.
12
COLORAZIONE
COLORAZIONE
Con Feeling A e B a
freddo
Con Feeling A e B a
caldo
Patata
Azzurro
Azzurro
Cipolla
Azzurro
Rosso
Farina
Azzurro
Azzurro
si
Zucchero di canna
Azzurro
Azzurro
si
Latte
Azzurro
Rosso
si
Fruttosio
Azzurro
Rosso
si
Farina + Saliva
Azzurro
Rosso - Blu
si
Saccarosio
Azzurro
Azzurro
----------------
--------------
ALIMENTO
Bianco
POSITIVO
NEGATIVO
si
si
si
si
---------------------
si
Spiegazione dei risultati ottenuti dall’esperienza
Molti alimenti, di origine sia vegetale che animale, contengono zuccheri, semplici o complessi.La
presenza di zuccheri negli alimenti può essere facilmente dimostrata ricorrendo alla reazione di
Fehling, per questo scopo occorre innanzitutto preparare i due reattivi chiamati Fehling A e Fehling
B.
Reattivo di Fehling A: in 100 cc di acqua distillata o deionizzata
si sciolgono 7 grammi di solfato di rame (CuSO4), questo è un
sale di colore blu, facilmente reperibile in quanto molto usato in
agricoltura e giardinaggio.
Reattivo di Fehling B: in 80 cc di acqua distillata calda si
sciolgono 34 grammi di sale di Seignette (tartrato doppio di sodio
e potassio, reperibile in farmacia) e 12 grammi di idrossido di
sodio (NaOH, la comune soda caustica utilizzata anche per sturare
lavandini ingorgati), si lascia raffreddare la soluzione e poi si
aggiunge acqua sino a 100 cc.
Le due soluzioni vanno conservate separatamente, al momento dell'uso si mescolano in parti uguali
nella quantità necessaria per l'esperienza, la miscela delle due soluzioni, che ha un colore blu
intenso, deve essere utilizzata entro non più di 20-30
minuti dalla preparazione.
Per effettuare la prova si pone in una provetta 1 cc
del liquido in cui si vuol evidenziare la presenza di
zuccheri e si aggiungono 2 cc della miscela
preparata. Si scalda il tutto alla fiamma per alcuni
secondi. In presenza di zuccheri il liquido acquisterà
una colorazione variabile tra il giallo-uovo, l'arancio
ed il rosso mattone, lasciando a riposo la provetta
per un po' di tempo il colore si depositerà sul fondo
sotto forma di un precipitato insolubile di composti di rame.
13
La reazione
Si aggiungono in quantità uguali i due reattivi che insieme costituiscono il “reattivo di Feeling”
(soluzione di solfato di rame e soluzione di carbonato di potassio)
Riscaldando la provetta contenente zuccheri a bagnomaria si vede che questa cambia colore
passando prima al giallo, poi all’arancio, e infine al rosso mattone: questo perché il glucosio riduce
il rame , trasformandolo in ossido rameoso, Cu2O. (Cu 2+
Cu +), Quest’ultimo rimane per
un certo tempo sospeso nella soluzione; quando lasciato raffreddare, si deposita lentamente sul
fondo. Questa reazione è caratteristica del gruppo carbonilico. Questo saggio viene utilizzato per
riconoscere la presenza di monosaccaridi.
Come confronto si può ripetere il test sulla soluzione d’amido di partenza (controllo negativo) e su
una soluzione di glucosio (controllo positivo).
Gli ioni rameici ossidano a ione carbossilato il gruppo carbonilico delle aldeidi e degli zuccheri
riducenti e contemporaneamente si riducono a ossido rameoso:
Nota: La reazione di Fehling, riferita ad un monosaccaride generico è:
Il test viene condotto a caldo in un bagnomaria bollente: un'aldeide o uno zucchero riducente determinano
la formazione di un precipitato che può apparire rosso, giallo oppure verde a seconda della quantità di
ossido rameoso che si è formata; nel contempo si osservano variazioni anche del colore della
soluzione.Questo test dà risultato negativo per il saccarosio. Il saccarosio è infatti uno zucchero non
riducente.Il saccarosio, disaccaride, è formato da una molecola di glucosio e da una di fruttosio legate con
legame -1,2-diglicosidico; per questo non vi sono più gruppi carbonilici liberi con capacità riducenti. Di
conseguenza , né il fruttosio né il glucosio presenti nel saccarosio hanno un gruppo emiacetalico, e non vi è
equilibrio con forme aldeidiche.
14
RICERCA DELLE PROTEINE NEGLI ALIMENTI
Campioni alimentari vengono pestati con l’acqua e l’estratto è poi saggiato col reattivo
del biureto.
Materiale occorrente:
1. Becker da 500 ml;
2. Carta assorbente;
3. Cilindro da 100 ml;
4. Mortaio con pestello
5. Parafilm;
6. Pennarello indelebile;
7. Pipetta di precisione da 1ml, 5ml e 10ml;
8. Porta provette;
9. Provette;
10. Spatola;
11. Spruzzetta.
Reattivi:
Reattivo al Biureto.
Strumentazione:
Bilancia
Campione:
10. Amido di patata;
11. Bianco d’uovo;
12. Carne bianca;
13. Cipolla;
14. Fagioli;
15. Latte;
16. Mela
Reagenti
Reattivo al Biureto
Preparazione
Si prepara sciogliendo 1,5 g di solfato di rame penta idrato
(CuSO4*5H2O) e 6g di tartrato di sodio e potassio in 500 ml di H2O
distillata. La soluzione ottenuta deve essere unita a 300ml di
idrossido di sodio (NaOH) al 10%. Il tutto va portato a volume di 1
litro. Il reattivo così preparato rimane stabile per qualche mese.
15
Metodica
1. Utilizzare provette pulite per ogni campione. Pestello e mortaio vanno puliti attentamente
fra una prova e l’altra. Contrassegnare tante provette quanti i campioni da saggiare;
2. Pestare in un mortaio4-5 grammi di un campione alimentare con circa 10ml di acqua. Se il
campione è liquido versarne 5ml in provetta;
3. Versare il miscuglio (5ml) in una provetta pulita. Ripetere l’operazione per ogni campione;
4. Aggiungere in ogni provetta 1ml di soluzione di idrossido di sodio (NaOH) e poi 1ml di
soluzione di solfato di rame diluito rimescolando il contenuto;
5. Attendere qualche secondo prima di procedere all’analisi dei risultati.
Tabella dei risultati
Campione
Colore
(dopo l’aggiunta del reattivo)
Amido di patata
Bianco d’uovo
Carne bianca
Cipolla
Fagioli
Latte
Mela
Conclusioni sintetiche
16
Interpretazione dei risultati
RICERCA DELLE PROTEINE E DEGLI AA MEDIANTE REAZIONE AL BIURETO
Il reattivo al Biureto interagisce con i legami peptidici e, perciò reagirà con le proteine, per
esempio l’albumina, ma non reagirà con gli amminoacidi liberi, come l’alanina e la glicina. Il
biureto in soluzione è di colore blu chiaro ( per la presenza del solfato di rame), ma in presenza di
proteine vira al violetto.
Altri tipi di molecole possono causare un cambiamento di colore del biureto, ma solo il violetto
indica la presenza di polipeptiti.
Materiale occorrente:
12. Becker da 500 ml;
13. Carta assorbente;
14. Cilindro da 100 ml;
15. Parafilm;
16. Pennarello indelebile;
17. Pipetta di precisione da 1ml;
18. Porta provette;
19. Provette;
20. Puntali blu per micro pipetta;
21. Spatola;
22. Spruzzetta.
Reattivi:
Reattivo al Biureto.
Strumentazione:
Bilancia
Campione:
17. Albumina d’uovo al 6%;
18. Amido di patata al 2%;
19. Soluzione di glucosio al 6%;
20. Latte
17
Preparazione dei reagenti e delle soluzioni:
Reagenti
Reattivo al Biureto
Preparazione
Si prepara sciogliendo 1,5 g di solfato di rame penta idrato
(CuSO4*5H2O) e 6g di tartrato di sodio e potassio in 500 ml di H2O
distillata. La soluzione ottenuta deve essere unita a 300ml di
idrossido di sodio (NaOH) al 10%. Il tutto va portato a volume di 1
litro. Il reattivo così preparato rimane stabile per qualche mese.
Albumina d’uovo al 6%
Soluzione di glucosio al 6%
Amido di patata al 2%
Portare all’ebollizione 900 ml di acqua distillata; dopo aver sciolto
20 g di amido di patata (fecola) in 100ml di acqua distillata, versare
lentamente questa soluzione nei 900ml di acqua bollente. Portare
tutto a ebollizione, mescolando, e lasciar raffreddare, coprendo il
contenitore con della carta stagnola
Metodica
6. Preparare una serie di 5 provette e numerarle da 1 a 5 con il pennarello;
7. Aggiungere in ciascuna provetta 2ml di una delle soluzioni a disposizione per la prova;
8. Aggiungere in ogni provetta con una pipetta graduata o con una micro pipetta, circa 2 ml di
reattivo al biureto;
9. Mescolare il reattivo e la soluzione agitando bene ciascuna provetta;
10. Annotare dopo 2 minuti nella tabella qualsiasi cambiamento di colore abbia luogo a
stabilire se la soluzione considerata contiene proteine.
Tabella dei risultati
Campione
Colore dopo 2 minuti
Acqua distillata
Albumina d’uovo al 6%
Amido di patata al 2%
Soluzione di glucosio
Latte
18
Presenza(+) o assenza (-) di
proteine
IL SANGUE
Il sangue è formato da una sospensione di cellule speciali in un liquido chiamato plasma. In un
uomo adulto, il sangue costituisce circa 1/12 del peso corporeo e corrisponde a 5-6 litri. Il 55 % del
sangue è costituito da plasma, il 45 % da cellule chiamate anche elementi figurati. Il sangue
svolge numerose ed importanti funzioni. Per mezzo dell'emoglobina contenuta negli eritrociti, esso
trasporta l'ossigeno ai vari tessuti e ne preleva l'anidride carbonica (CO2). Esso trasporta sostanze
nutritive (amminoacidi, zuccheri, sali minerali) e raccoglie le particelle escrete che verranno
eliminate attraverso il filtro renale. Il sangue trasporta inoltre ormoni, enzimi e vitamine. Esso
presiede anche alla difesa dell'organismo attraverso l'azione di fagocitosi da parte dei leucociti, il
potere battericida del siero e mediante la risposta immunitaria di cui sono protagonisti i linfociti.
Il plasma
Il siero libero da cellule, o plasma, può essere ottenuto per centrifugazione. Il plasma è un fluido
leggermente alcalino, con caratteristico colore giallino, costituito per il 90 % da acqua e per il 10 %
da sostanza secca. Nove parti di questa sono costituite da sostanze organiche, mentre una parte è
costituita da minerali. Le sostanze organiche del plasma sono formate da glucidi (glucosio), lipidi
(colesterolo, trigliceridi, fosfolipidi, lecitina, grassi), proteine (globuline, albumine, fibrinogeno),
glicoproteine, ormoni (gonadotropine, eritropoietina, trombopoietina), amminoacidi e vitamine. Le
sostanze minerali sono dissolte sotto forma ionica, cioè dissociate in ioni positivi e negativi.
Preparazione dello striscio di sangue
Materiale occorrente:
- ago sterilizzato
- 20 vetrini portaoggetti puliti
- coprioggetti puliti
- balsamo del Canadà o altro medium per preparati permanenti
- alcool etilico o metilico a 95°
- acqua distillata
- colorante Giemsa
- recipienti bassi (si possono preparare anche con foglio di alluminio)
- microscopio con almeno 200 ingrandimenti
19
PRELIEVO DEL SANGUE
Il sangue si preleva nei laboratori di analisi autorizzati. Utilizzando un ago sterilizzato, si punge il
polpastrello.
ESECUZIONE DELLO STRISCIO
Si deposita una piccola goccia di sangue
vicino all'estremità destra di un vetrino.
Come
mostrato
dalla
figura
7,
avvicinatevi alla goccia con un secondo
vetrino, finchè essa aderirà e si disporrà
per capillarità lungo tutto lo spigolo.
L'angolo fra i due vetrini deve essere di
30-40 gradi. Quindi muovete il vetrino
inclinato
verso
sinistra
con
un
movimento costante e rapido, in modo da
realizzare lo striscio.
Lo striscio dovrebbe coprire circa la
metà del vetrino. E' importante che la
quantità di sangue non sia eccessiva,
altrimenti i globuli rossi possono nascondere i leucociti. Se riuscite a realizzare una graduale
transizione nello spessore dello striscio, dovreste ottenere una zona con una soddisfacente
distribuzione delle cellule. Una goccia di sangue può essere utilizzata per numerosi strisci, infatti,
per realizzare uno striscio è sufficiente lasciare sul vetrino una macchia di sangue di circa 3 mm di
diametro. E' molto utile fare più strisci, infatti non sempre essi riescono bene, e con diversi
tentativi, è più facile averne uno riuscito in modo soddisfacente.
Per evitare la formazione di coaguli, ciascuno striscio deve essere effettuato con sangue fresco e
subito dopo averlo depositato. A tale scopo, è bene farsi aiutare da un'altra persona. In modo che
mentre una deposita il sangue, l'altra effettua gli strisci. Osservate al microscopio gli strisci per
verificare che alcuni siano riusciti correttamente, altrimenti fatene degli altri. I globuli rossi non
devono essere sovrapposti nè troppo scarsi da risultare isolati e troppo distanti fra loro.
Una volta eseguito correttamente, si fa asciugare rapidamente lo striscio di sangue all'aria e si
procede alla colorazione.
Le colorazioni utilizzate sono modificazioni della colorazione dì base di Romanowsky e utilizzano
coloranti post -vitali perchè agiscono sulle cellule fissate.
20
Si utilizzano due coloranti, uno acido che si fissa alle componenti basiche (citoplasma) ed uno
basico che si fissa alle componenti acide della cellula (acidi nucleici e nucleoproteine).
May Grunwald Giemsa richiede 30' ma è ottima per la differenziazione degli elementi
cellulari
PROCEDIMENTO:

si utilizza la il colorante May Grunwald, con cui sì copre il vetrino e si lascia agire per 5'

si diluisce con acqua tamponata (circa 1:2) e si lascia per altri 5"

si elimina il colorante

si copre i! vetrino con una soluzione di Giemsa (1 /2Q in acqua tamponata) e si lascia agire
per 20'

si sciacqua con acqua tamponata (KH2PO4 5.47 g/L + Na2HP04 3.8 g/L)

si lascia asciugare il vetrino tenendolo quasi in verticale sul lato corto
MONTAGGIO COPRIOGGETTI
A questo punto, il vostro striscio è pronto per l'osservazione, ma se volete conservarlo a lungo,
dovete trasformarlo in un preparato permanente. A tale scopo, dopo aver lasciato asciugare il
vetrino, fate cadere sullo striscio una goccia di balsamo del Canadà o di un analogo liquido di
montaggio. Se il balsamo dovesse essere un po' troppo viscoso, potete riscaldare leggermente (non
oltre 40 °C) il vetrino per favorire lo scorrimento del balsamo tra i vetrini.
L'ESAME MICROSCOPICO
L'esame al microscopio dello striscio di sangue va fatto in due tempi:

prima bisogna osservare il vetrino a piccolo ingrandimento (oculare 10x ed obiettivo 20x)
per valutare la qualità dello striscio, la distribuzione cellulare e la presenza di aggregati
piastrinici

poi, scelta una zona dove gli eritrociti formano uno strato uniforme, si passa
all'osservazione a forte ingrandimento {oculare 10x ed obiettivo 100x ad immersione).
OSSERVAZIONE
Un ingrandimento di 200 volte è sufficiente per osservare e identificare i differenti tipi di cellula.
Tuttavia, un ingrandimento superiore vi permette di osservare meglio le cellule nei loro dettagli.
Potete osservare subito lo striscio usando sia obiettivi a secco che ad immersione. In questo ultimo
21
caso, se avete montato un coprioggetti, dovete aspettare almeno un giorno perchè il balsamo si sia
un po' asciugato, altrimenti quando muoverete il vetrino l'olio farà spostare il coprioggetti.
Per i vari tipi cellulari è possibile osservare:
RBC

variazioni di volume: micro- normo- macro-citosi

variazioni di colore: ìpo- ramno-cromia (non si parla dì ipercromia perché il colore è dato
dalla concentrazione dell'Hgb e questa non può superare il limite dato dalla cellula)

variazioni di forma: poichilocitosi

distribuzione: isolati, impilati, agglutinati

anormalità: policromasia (RBC bluastri}, reticolociti, nucleati, corpi di Howell Jolly, Corpi
di Heinz, parassiti
WBC

stima numerica: leucopenia - leucocitosi

variazioni di volume

aspetto del citoplasma: colore, quantità rispetto al nudeo, granuli (corpi di Dohle,
formazioni tondeggianti grigio-blu nei neutrofili), corpi inclusi (parassiti, batteri)

aspetto del nucleo: forma, colore, struttura della cromatina e dei nucleoli

conteggio differenziate
PLT

stima numerica: adeguata, inadeguata, aumentata. Per stima adeguata si indica la presenza
di 7-20 piastrine per campo.

variazioni di volume macropiastrine

presenza di aggregati piastrinici
Eritrociti
Gli eritrociti sono le cellule più numerose del sangue: circa 4-6 milioni /mm3. Essi sono chiamati
anche emazie, oppure globuli rossi. Nell'uomo e in tutti i mammiferi,
gli eritrociti sono privi di nucleo e hanno la forma di una lente
biconcava. Negli altri vertebrati (pesci, anfibi, rettili e uccelli), essi
possiedono il nucleo. I globuli rossi sono ricchi di emoglobina, una
proteina capace di legarsi in modo labile all'ossigeno. Quindi, queste
cellule sono incaricate di rifornire di ossigeno i tessuti e in parte
22
di recuperare l'anidride carbonica che essi producono come scarto. La maggior parte della CO2
è tuttavia trasportata dal plasma, sotto forma di carbonati in soluzione. Nei globuli rossi dei
mammiferi, la mancanza del nucleo lascia più spazio all'emoglobina e la forma biconcava aumenta
il rapporto tra la superficie e il volume citoplasmatico della cellula. Queste caratteristiche rendono
più efficiente la diffusione dell'ossigeno da parte di queste cellule.
Piastrine
La principale funzione delle piastrine, o trombociti, è di fermare la perdita di sangue nelle
ferite (emostasi). A tale scopo, esse si aggregano e liberano fattori che promuovono la coagulazione del
sangue. Fra queste c'è la serotonina che riduce il calibro dei vasi lesionati e rallenta il flusso ematico, la
fibrina che intrappola cellule e forma il coagulo. Anche se appaiono di forma tondeggiante, le piastrine non
sono propriamente delle cellule. Negli strisci colorati con il Giemsa, hanno un colore porpora intenso. Il
loro diametro è di circa 2-3 µm, quindi sono assai più piccole degli eritrociti. La loro densità nel sangue è di
200000-300000 /mm3.
Leucociti
A differenza dei globuli rossi, i leucociti hanno il nucleo. Esso risulta ben visibile al microscopio
dopo la colorazione dello striscio. Il nucleo di queste cellule può presentare lobature multiple, o
essere indentato o reniforme. La forma del nucleo dei vari tipi di leucocita è generalmente diversa,
insieme alla diversa colorazione dei granuli, ci aiuta al riconoscimento di queste cellule.
I leucociti, o globuli bianchi, sono incaricati della difesa dell'organismo. Nel sangue essi sono
assai meno numerosi dei globuli rossi. La densità di leucociti nel sangue è di 5000-7000 /mm3. I
leucociti si dividono in due categorie: granulociti e cellule linfoidi (o agranulociti). Il termine di
granulociti è dovuto alla presenza di granuli nel citoplasma di queste cellule. Questi granuli sono
differenti nei vari tipi di granulocita e ci aiutano a distinguerli. Infatti, questi granuli hanno una
differente affinità verso i coloranti neutri, acidi o basici e fanno assumere al citoplasma un colore
differente. I granulociti si distinguono dunque in neutrofili, eosinofili (o acidofili), basofili. Le
cellule linfoidi, invece, si distinguono in linfociti e monociti. Come vedremo più avanti, anche la
forma del nucleo ci aiuta nel riconoscimento dei leucociti.
Ciascun tipo di leucocita è presente nel sangue in proporzioni diverse:
granulocita neutrofilo 50 - 70 %
granulocita eosinofilo 2 - 4 %
granulocita basofilo 0,5 - 1 %
linfocita 20 - 40 %
monocita 3 - 8 %
I neutrofili sono molto attivi nel fagocitare batteri e sono presenti
in grandi quantità nel pus delle ferite. Purtroppo, queste cellule
23
non sono capaci di rinnovare i lisosomi utilizzati nel digerire i microbi e muoiono dopo averne
fagocitati alcuni
Gli eosinofili aggrediscono parassiti e fagocitano i complessi
antigene-anticorpo.
I basofili secernono sostanze anticoagulanti, vasodilatatrici come
l'istamina e la serotonina. Anche se possiedono capacità
fagocitaria, la loro funzione principale è quella di secernere
sostanze che mediano la reazione di ipersensibilità.
I linfociti sono cellule che, oltre a essere presenti del sangue,
popolano gli organi e i tessuti linfoidi, nonchè la linfa che circola
nei vasi linfatici. Gli organi linfoidi comprendono il timo, il
midollo osseo (negli uccelli la bursa), la milza, i linfonodi, le
tonsille palatine, le placche di Peyer e il tessuto linfoide dei tratti
respiratorio e digerente.
La maggior parte dei linfociti circolanti nel sangue si trova allo stato di riposo. Essi hanno l'aspetto
di piccole cellule con nucleo compatto che occupa quasi tutto il volume cellulare. Di conseguenza,
il citoplasma è molto ridotto. I linfociti degli organi e dei tessuti linfoidi possono invece essere
attivati in varia misura a seguito della stimolazione antigenica. Nel sangue, i linfociti rappresentano
il 20-40% di tutti i leucociti e possiedono una dimensione leggermente superiore a quella dei
globuli rossi. I linfociti sono i costituenti principali del sistema immunitario che costituisce una
difesa contro l'attacco di microrganismi patogeni quali virus, batteri, funghi e protisti. I linfociti
producono anticorpi e li dispongono sulla membrana. Un anticorpo è una molecola proteica in
grado di legarsi a una molecola di forma complementare, definita come antigene, e di riconoscerla.
24
Struttura di un rene di maiale
Materiale occorrente
—
—
—
—
—
—
Reni di maiale
Bisturi
Pinzette
Ago da dissezione
Bacinella a bordo basso
Guanti da chirurgo
Struttura del rene
I reni sono organi di enorme importanza come regolatori dell'omeostasi dell'intero organismo.
Essi hanno la funzione di depurare il sangue dai prodotti del catabolismo azotato (urea ed acido
urico) e di mantenere costante la composizione del sangue eliminando varie sostanze che vi si
trovassero eventualmente in eccesso. Inoltre mantengono l'equilibrio idrico e dei sali minerali, e
di conseguenza controllano volume e pressione del sangue; regolano il pH, uno spostamento
troppo ampio del quale, in un senso o nell'altro, sarebbe mortale. Non ultime vanno ricordate la
stimolazione dell'emopoiesi tramite l'eritro- poietina e l'azione fondamentale sulla biosintesi della
vitamina D.
Il flusso del sangue attraverso ciascun rene è di circa 600-650 cc al minuto. Inoltre, come
dispositivo naturale di sicurezza, essi hanno una capacità circa due volte superiore a quella che
occorre per mantenere l'organismo in buona salute. Perciò, quando diviene necessaria
l'asportazione di un rene malato, quello che rimane compie agevolmente un lavoro doppio.
Ireni, rispetto agli altri organi addominali, hanno ima posizione arretrata; infatti entrambi sono
posti ai lati della spina dorsale, all'altezza delle ultime costole. Essi sono a forma di fagiolo e,
nella concavità rivolta verso l'interno, si trova l'ilo, attraverso il quale passano i vasi renali e
l'uretere. Il
rene definitivo
non presenta
più la
metameria
embrionale,
anche se nel
neonato ne ha
ancora qualche
traccia nella
lobatura
esterna.
Fig. 41.3 - Glomerulo di Malpighi visto al microscopio elettronico una volta rimossa la capsula di Bowmann.
Fig. 41.2 - Struttura del rene. 1 Capsula fibrosa, 2 Zona corticale, 3 Piramidi di Malpighi (zona midollare), 4 Colonne di Bertin, 5
Uretere, 6 Bacinetto renale, 7 Calici renali maggiori, 8 Apici delle piramidi, 9 Calici renali minori.
25
DISSEZIONE DEL RENE DI MAIALE
Materiale occorrente
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Reni di maiale
Bisturi
Pinzette
Ago da dissezione
Bacinella a bordo basso
Guanti da chirurgo
Fig.1 – Rene integro in cui si nota la zona dell’ilo.
Nella concavità rivolta verso l’interno, si trova l’ilo,
attraverso il quale passano i vasi renali e l’uretere
Fig. 3 – Sezione del rene in cui si vede il bacinetto renale e
l’imbocco dell’uretere
Esecuzione
Fig. 2 – Sezione del rene in cui si vedono
gli apici delle piramidi di Malpighi che si
“affacciano sui calici renali
1)
2)
Osservazione del rene integro.
Dopo aver infilato i guanti, aprire a metà il
rene praticando l’incisione lungo il borgo
(Fig.2). Eseguire il lavoro nell’apposita
bacinella. Osservare accuratamente la
struttura interna
26
ANALISI DELLE URINE
Introduzione
L'urina è il liquido prodotto dai reni per eliminare dall'organismo i prodotti di scarto e l'eccesso di
acqua. L'emissione di urina viene definita diuresi. L’esame delle urine permette di diagnosticare
disfunzioni a carico dei reni, ma anche per vari disordini cardiaci, epatici e metabolici.
Come si esegue
Ci sono due tipi diversi di raccolta dell'urina, a seconda del tipo di esame da eseguire: il campione
estemporaneo consiste nella raccolta delle prime urine del mattino; il campione temporizzato,
invece, raccoglie le urine emesse nell'arco di 24 ore
L'urina va raccolta e conservata in appositi contenitori sterili dopo aver eseguito un'accurata igiene
dei genitali, soprattutto per le donne, che dovrebbero astenersi durante il periodo mestruale.
Per una corretta analisi, il campione estemporaneo deve essere raccolto da non più di due ore,
mentre il campione temporizzato va conservato in frigorifero per tutta la durata della raccolta.
Materiale occorrente:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Striscette colorate;
Soluzione da analizzare;
Provette da centrifuga;
Carta assorbente;
Densimetro da 1000mg/l a 1100 mg/l;
Cilindro graduato da 500ml;
Porta provette;
Pipette Pasteur;
Preparazione della soluzione che simula la composizione dell’urina:
In un matraccio da un litro si versano circa 800 - 900 ml di acqua distillata vengono sciolte un poco
sostanze che potrebbero trovarsi nelle urine ( albumina, un po’ di sangue proveniente da una fettina
di manzo, glucosio ecc)
Procedimento:
Si pone nel porta provette una provetta da centrifuga. Con la pipetta Pasteur si preleva la soluzione
da analizzare e si riempie la provetta in modo tale che tutti i reattivi posti sulla striscetta siano
immersi nel liquido in esame. Si immerge la striscetta e dopo un secondo si leva e si poggia sulla
carta assorbente. Dopo un paio di secondi si osservano i cambiamenti di colore che sono avvenuti.
Si riempie il cilindro graduato, s’immerge il densimetro per aver un confronto tra il valore della
densità misurato e quello trovato sulla striscetta
27
I colori relativi ai singoli reattivi posti sulle striscette sono così identificati:
1
Bianco
Leucocidi
2 Verde scuro Peso specifico
3
Arancione
PH
4
Bianco
Nitriti
5
Giallo
Sangue
6
Giallino
Proteine
7
Giallo
Glucosio
8
Bianco
Chetoni
9
Grigio
Urobilinogeno
10
Beige
Bilirubina
Risultato dell’analisi →
Leucocidi
Peso specifico
PH
Nitriti
Sangue
Proteine
Glucosio
Chetoni
Urobilinogeno
Bilirubina
Negativo
1,005 mg/l
5
Negativo
3,00
30
≥ 1000
3+
Negativo
Negativo
L’analisi delle urine è suddivisa in tre esami:
ESAME FISICO
Volume: in un adulto varia da 1200 a 1500 ml nell'arco delle 24 ore. Un aumento del volume delle
urine può essere dovuto all'assunzione di diuretici, patologie renali croniche, diabete; una
diminuzione
a
disidratazione
o
a
patologie
renali.
Colore: in condizioni normali l'urina ha un colore giallo-paglierino o ambra. Diventa giallo oro in
caso di assunzione di antibiotici o vitamine; giallo-arancio quando c'è un eccesso di urobilinogeno;
marrone per la presenza di bilirubina; rosso limpido per la presenza di emoglobina, mioglobina o
porfirine; rosso torbido per la presenza di sangue o di urati; bruno-nerastro per la presenza di
metaemoglobina, alcaptonuria, melanina; blu-verde per la presenza di indacani o in seguito ad
infezione da pseudomonas. L'assunzione di alcuni alimenti o farmaci può modificare il colore
dell'urina.
Aspetto: in condizioni normali l'urina è trasparente. E' torbida in presenza di carbonati, fosfati,
acido urico, proteine, globuli bianchi, batteri, spermatozoi; è lattescente in caso di piuria; può
contenere precipitati per presenza di fosfati e urati.
Odore:
le
urine
possono
odorare
di
ammoniaca
in
caso
di
infezione
batterica.
Peso specifico: è compreso tra 1010 e 1030; una diminuzione è segno di insufficienza renale
cronica.
ESAME CHIMICO
pH: varia da 5,5 e 7,5; può arrivare a 4,5 in caso di dieta a base di carne o a 8,0 in chi segue una
dieta
vegetariana.
Glucosio: deve restare al di sotto di 150 mg/L; se la glicemia supera i 180 mg/L si ha glicosuria.
Proteine: deve essere inferiore a 15 mg/dL; in gravidanza può raggiungere anche i 50 mg/dL. La
proteinuria patologica può essere minima (0,5 g/L) nella calcolosi renale, nel rene policistico e
nella glomerulonefrite cronica; moderata (da 0,5 a 4 g/L) nella nefropatia diabetica, nella
glomerulonefrite cronica o acuta, nella sindrome nefrosica e nel mieloma multiplo; è grave
(superiore a 4g/L) nella glomerulonefrite acuta, nel lupus eritematoso e nella sindrome nefrosica.
28
Emoglobina: in condizioni normali è assente; indica presenza di sangue nelle urine.
Corpi chetonici: la loro presenza si può riscontrare nelle donne in gravidanza, nei bambini in
seguito
ad
episodi
febbrili
o
in
presenza
di
diabete
mellito.
Bilirubina: sostanza di colore giallo-rosso prodotta dalla scissione dell’emoglobina, pigmento
rosso presente nei globuli rossi del sangue. In condizioni normali dovrebbe essere assente; la sua
presenza indica danno epatico, carcinoma del pancreas, epatiti virali o ittero.
Urobilinogeno: in condizioni normali non supera i 0,2 mg/dL; un aumento indica danno epatico,
emolisi o stipsi; una diminuzione si verifica in caso di ostruzione biliare, transito intestinale
accelerato o assunzione di antibiotici.
ESAME MICROSCOPICO
Ematuria: la presenza occasionale di globuli rossi può essere dovuta ad intenso sforzo fisico, forti
stati emozionali o esposizione a basse temperature; in caso di persistenza, è necessario eseguire
un'urografia.
Leucocituria: la presenza di leucociti indica un processo infiammatorio o infettivo (cistite, uretrite,
calcolosi renale, pielonefrite, cancro alla vescica).
Cilindruria: i cilindri sono agglomerati di proteine e di altri elementi che si formano nei tubuli
renali. La loro presenza può indicare disfunzioni renali.
Sali e cristalli: se in forte quantità, possono indicare una calcolosi renale.
Calcoli: sono indice di ipercalciuria idiopatica, iperparatiroidismo o iperossaluria (sali di calcio).
Conta di Addas: in condizioni normali, nel corso di 24 ore vengono eliminati con le urine 1
milione di globuli rossi, 2 milioni di globuli bianchi e fino a 10mila cilindri ialini.
Valori standard
Colore
Aspetto
pH
Glucosio
Proteine
Emoglobina
Corpi chetonici
Bilirubina
Urobilinogeno
Leucociti
Peso specifico
Giallo
Limpido
5,5-7,5
<10 mg/dL
<15 mg/dL
Assente
Assenti
Assente
<0,20 mg/dL
Assenti
1010-1030
L’esame delle urine può dare risultati diversi da
quelli standard, ma non significa necessariamente
che sia dovuto ad una malattia: è importante non
allarmarsi e far valutare i risultati delle analisi da
un medico.
29
OSSERVAZIONE DI VETRINI PREPARATI SUL SEDIMENTO URINARIO
Obiettivo: osservare il sedimento urinario su vetrini preparati in laboratorio
autorizzato
Il sedimento urinario è una parte fondamentale dell'esame delle urine. Per ottenere un campione
idoneo per lo studio del sedimento urinario si utilizzano 5-10 mL di urine che vengono versati in
una provetta da centrifuga a fondo conico; il campione deve essere centrifugato per 10 minuti a
velocità moderata, in genere una velocità compresa fra 1.000 e 1.200 rpm, infatti una velocità
maggiore potrebbe distruggere gli elementi più fragili, in particolare i cilindri, perdendo
interessanti elementi per una corretta interpretazione. Dopo la centrifugazione, è necessario
eliminare accuratamente il sovranatante e si risospende, agitando delicatamente, il sedimento in
modo da non danneggiare gli elementi presenti. A questo punto, il sedimento risospeso può essere
osservato direttamente o dopo opportuna colorazione. In entrambi i casi, una piccola goccia del
campione viene posta al di sopra di un vetrino portaoggetto che si copre poi con un
vetrino coprioggetto, evitando la formazione di bolle, oppure possono essere utilizzati appositi
vetrini con camere a spessore costante. L'osservazione microscopica inizia utilizzando un basso
ingrandimento (100 x) questo permette di visualizzare campi microscopici abbastanza ampi,
consentendo una visione di insieme del preparato; successivamente si utilizza un maggior
ingrandimento (400 x) osservando numerosi campi microscopici per poter effettuare il
riconoscimento e la conta degli elementi presenti. Nel referto, normalmente, viene riportata
l'indicazione del numero medio di elementi presenti in alcuni campi microscopici esaminati a forte
ingrandimento (in genere 400 x).
L’esame microscopico del sedimento urinario si esegue sulla parte che si deposita in fondo alla
provetta dopo la centrifugazione. Permette di evidenziare la presenza di leucociti (globuli bianchi),
eritrociti (globuli rossi), cellule epiteliali, cristalli, cilindri, batteri e miceti.
> Leucociti
La presenza di globuli bianchi nelle urine, se superano il valore di riferimento, è un indice
aspecifico di infezione alle vie urinarie e renali.
> Eritrociti
I globuli rossi normalmente devono essere assenti nell’urina o in quantità modeste: la presenza è
detta ematuria.
> Cellule epiteliali
La presenza di poche cellule epiteliali nelle urine è rappresentata dal normale ricambio cellulare
dell’epitelio che riveste le vie urinarie.
> Cristalli
Sono spesso presenti nelle urine anche in assenza di quadri patologici. I più comuni cristalli a pH
basico sono: i fosfati amorfi (precipitazioni fini), il fosfato di calcio (di forma prismatica), i fosfati
tripli, il carbonato di calcio (di forma sferica). I più comuni a pH acido sono: i cristalli di acido
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urico, gli urati amorfi, l’ossalato di calcio. Tra i cristalli rilevabili in corso di stati patologici vi
sono: la leucina (di colore giallastro e aspetto oleoso), la cistina (lamine incolori), la tiroxina (aghi
di colore giallastro), i cristalli di sulfadiazina.
> Cilindri
Sono agglomerati di proteine o cellule che si formano nei tubuli renali. Normalmente non presenti,
la loro presenza indica una sofferenza renale. La loro composizione è indice di diverse disfunzioni
renali.
> Batteri e miceti
In condizioni normali l’urina è sterile. La presenza di batteri (associata a leucociti) può indicare
un’infezione delle alte o basse vie urinarie. I miceti si riscontrano spesso in soggetti
immunodepressi, diabetici o sottoposti a terapia antibiotica. Il più comune è la Candida. Quando
sono presenti batteri o funghi, associati a leucociti, l’esame verrà integrato da urinocoltura.
Le informazioni contenute nella tabella sono a carattere informativo, divulgativo, e non devono essere in
alcun modo usate per diagnosi su se stessi o altri, non per scopo terapeutico, non per automedicazione.
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Test di Verifica
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