Il sangue - Biotecnologie

Il sangue
SANGUE
• SANGUE : SISTEMA BIFASICO
• FASE LIQUIDA
• PLASMA
• SOLUZIONE SALI MINERALI E ORGANICI
• FASE SOLIDA
• CELLULE NUCLEATE (g. bianchi)
• CELLULE ANUCLEATE (g. rossi)
• FRAMMENTI CITOPLASMATICI (piastrine)
EMOCROMO
• Prevede il conteggio del numero dei globuli rossi
(eritrociti), dei globuli bianchi (leucociti) e delle
piastrine (trombociti), nonchè la determinazione
quantitativa dell’emoglobina.
È detto anche esame emocromocitometrico
• Con il termine formula leucocitaria si intende la
percentuale di ciascun tipo di globulo bianco
(granulociti neutrofili, eosinofili e basofili monociti,
linfociti) presente in un campione.
Emogramma normale
- Eritrociti
- Leucociti
- Piastrine
4-6 milioni/mmc
4-10 mila/mmc
sino a 350.000/mmc
- Linfociti
- Monociti
- Neutrofili
- Eosinofili
- Basofili
20-35%
3-7%
55-65%
0-3%
0-2%
Determinazione della formula leucocitaria
Sfrutta due caratteristiche fondamentali delle cellule
ematiche:
1-le dimensioni dei globuli bianchi
2-l’attivita’ perossidasica
Le perossidasi sono enzimi presenti negli elementi della
serie mieloide e la marcatura di questo enzima permette
di evidenziare due popolazioni, Perox positive e Perox
negative
La parte solida
• QUALI SONO LE CELLULE DEL SANGUE ?
• CHE ASPETTO HANNO ?
• CHE RUOLO SVOLGONO ?
Lo stricio(smear) di sangue
periferico
•
•
•
•
•
Uno striscio di sangue periferico è costituito da un vetrino per microscopia
ricoperto da un sottile ed omogeneo strato di sangue venoso, colorato con un
colorante ed esaminato in microscopia ottica.
L’esame microscopico del sangue periferico viene usato per complementare ed
implementare le informazioni ottenute mediante gli analizzatori automatici di
sangue(contatori di cellule), che forniscono informazioni quantitative rigurado
alle cellule ematiche e possono persino identificare campioni con cellule anomale.
Tuttavia, la corretta identificazione delle cellule abnormi richiede un
microscopista esperto, uno striscio di sangue ben eseguito ed un microscopio a
luce con buone caratteristiche ottiche
Nella pratica corrente, analizzatori automatizzati di varia complessità vengono
utilizzati in tutti i laboratori di ematologia per ottenere la conta cellulare e
l’elaborazione grafica delle informazioni ottenute. Questi strumenti sono anche in
grado di richiamare l’attenzione su cellule atipiche eventualmente presenti nel
campione. Sarà poi l’operatore che rivede le informazioni raccolte per ciascun
campione a decidere se è necessaria anche l’esecuzione dello striscio .
•
La tecnica push slide, svilupata da Maxwell Wintrobe costituisce il metodo
standard per la preparazione dello striscio periferico, secondo la procedura
mostrata di seguito.Nello specifico occorre:
•
Porre un vetrino per microscopia con una estremità smerigliata su una sperficie
piatta
Marcare il vetrino scrivendo il nome del paziente, il numero identificativo del
campione, e la data di preparazione dello striscio.
Adagiare una gocciolina di sangue di 2-3 mm verso l’estremità del vetrino dal lato
della smerigliatura con un applicatore, un capillare o direttamente con il
polpastrello.
Tenere il vetrino con il lato corto tra il pollice e l’indice stringendolo all’estremità
più lontana dalla smerigliatura
Prendi un secondo ventrino (spreader slide) stringendolo tra il pollice e l’indice
dell’altra mano all’estremità smerigliata.
Poggia il margine di questo vetrino(spreader) sul vetrino inferiore di fronte alla
goccia di sangue(sul lato più lontano alla smerigliatura)
Ritrarre il vetrino spreader verso l’esremità smerigliata fino a che tocca la goccia
di sangue. Lasciare che il sangue diffonda per capillarità lungo il margine del
vetrino spreader.
Spingere in avanti lo spreader mantenendo un angolo di circa 30 gradi ed un
movimento uniforme.
•
•
•
•
•
•
•
• Adagiare una gocciolina
di sangue di 2-3 mm
verso l’estremita del
vetrino dal lato della
smerigliatura con un
applicatore, un capillare
o direttamente con il
polpastrello
• Poggiare il margine
di questo vetrino
(spreader) sul
vetrino inferiore di
fronte alla goccia di
sangue(sul lato più
lontano alla
smerigliatura)
• Ritrarre il vetrino
spreader verso
l’estremità
smerigliata fino a
che tocca la goccia
di sangue. Lasciare
che il sangue
diffonda per
capillarità lungo il
margine del vetrino
spreader
• Spingere in avanti lo
spreader
mantenendo un
angolo di circa 30
gradi ed un
movimento uniforme
• Spingere in avanti lo
spreader
mantenendo un
angolo di circa 30
gradi ed un
movimento uniforme
• Ora non resta che
colorare
Uno striscio di sangue ben
eseguito dovrebbe essere
spesso all’estremità
smerigliata e via via più
sottile verso il lato opposto.
La zona di morfologia(cioè
l’area con lo spessore
ottimale per l’analisi
microscopica) dovrebbe
essere lunga almeno 2 cm. Lo
striscio dovrebbe occupare la
parte centrale del vetrino
lasciando libere le estremità
Esame dello striscio di sangue
periferico.
•
•
L’esame dello striscio di sangue periferico richiede un approccio sistematico al
fine di recuperare tutte le possibili informazioni. Inoltre tutti i preparati
debbono essere valutati nella medesima maniera, per assicurare la consistenza
delle informazioni. Si raccomandano le seguenti procedure.
Eseguire una analisi a basso ingrandimento(oculare 10x, obiettivo 10x) per
valutare la qualità dello striscio , valutare il numero approssimativo di cellule
bianche e piastrine ed evidenziare la presenza di rouleaux, aggregati piastrinici e
leucocitari ed altre anomalie visibili a basso ingrandimento. Quindi scegliere un
area ottimale per l’osservazione ad alto ingrandimento. Questa dovrebbe essere
una porzione integra dello striscio, priva di artefatti di preparazione dove le
cellule rosse siano separate da una distanza pari ad 1/3 del loro diametro. I
globuli rossi dovrebbero avere un colore rosa mentre i neutrofili mostrano un
aspetto increspato, con materiale nucleare blu-porpora e granuli citoplasmatici
dal lilla al rosa violetto. Una preparazione e colorazione ottimale dello striscio di
sangue è critica per l’esame morfologico ed uno striscio inadeguato non dovrebbe
essere esaminato.
•
•
•
Dopo l’esame a basso ingrandimento , viene selezionato un obiettivo 40x o 100x
(ingrandimento totale 400x o 1000x utilizzando un oculare 10x) e l’area di
morfologia viene esaminata con un consistente pattern di scansione per evitare
di contare le stesse cellule due volte. Deve essere eseguita una conta
differenziale di almeno 100 cellule bianche( meglio 500 o 1000 ed ogni anomalia
morfologica a carico dei globuli rossi, globuli bianchi e piastrine osservata
durante la conta differenziale deve essere accuratamente registrata.
Ciascuna anomalia morfologica osservata deve essere quantificata (da lieve a
marcata o da 1+ a 4+) . I tecnici di laboratorio biomedico sono ben addestrati alla
quantificazione riproducibile delle anomalie morfologiche.
Una grossolana stima della conta delle cellule bianche cell/ml, può essere
ottenuta contando il numero totale di leucociti in 10 campi microscopici a 500x,
dividend oil totale per 10 e moltiplicando per 3000. Questi valori dovrebbero
essere vicini a quelli ottenuti con il contatore cellulare. Se il valore ottenuto non
è confrontabile con quello della conta automatica, occorre recuperare il campione
originale, confermare l’identità del paziente, ripetere la conta automatica e
preparare un nuovo striscio
PROFILO CITOLOGICO DEL
SANGUE
Un ingrandimento di 200
volte è sufficiente per
osservare e identificare i
differenti tipi di cellula.
Tuttavia, un ingrandimento
superiore consente di
osservare meglio le cellule
nei loro dettagli. Lo striscio
può essere osservato usando
sia obiettivi a secco che ad
immersione.
• GLI ERITROCITI
(RBC) SONO LE
CELLULE PIÙ
NUMEROSE DEL
SANGUE
• VALORI NORMALI
• NELL’UOMO 4.5 - 6
milioni/mmc
• NELLA DONNA 4 - 5.5
milioni/mmc
I granuli, che rappresentano l’accumulo di rRNA, sono sempre un reperto patologico
indicativo di anemia sideroblastica, anemia megaloblastica, talassemia ed
avvelenamento da piombo
Hanno dimensioni di circa 1mm e sono costituiti da residui di cromatina nel citoplasma
degli eritrociti.Sono indice di immaturità di queste cellule e frequenti nei reticolociti.
Aumentano in anemia grave e in corso di splenectomia
Fagosomi contenenti granuli ferruginosi frequenti nelle anemie emolitiche,
sideroblastiche ed a cellule falciformi
Le piastrine
•
•
LA PRINCIPALE FUNZIONE DELLE PIASTRINE, O
TROMBOCITI, È DI FERMARE LA PERDITA DI SANGUE
IN SEGUITO A FERITE (EMOSTASI). A TALE SCOPO,
ESSE SI AGGREGANO E LIBERANO FATTORI CHE
PROMUOVONO LA COAGULAZIONE DEL SANGUE. FRA
QUESTE C'È LA SEROTONINA CHE RIDUCE IL CALIBRO
DEI VASI LESIONATI E RALLENTA IL FLUSSO
EMATICO, LA FIBRINA CHE INTRAPPOLA CELLULE E
FORMA IL COAGULO. ANCHE SE APPAIONO DI FORMA
TONDEGGIANTE, LE PIASTRINE NON SONO
PROPRIAMENTE DELLE CELLULE. NEGLI STRISCI
COLORATI CON IL GIEMSA, HANNO UN COLORE
PORPORA INTENSO. IL LORO DIAMETRO È DI CIRCA 2-3
µM, QUINDI SONO ASSAI PIÙ PICCOLE DEGLI
ERITROCITI.
VALORI NORMALI: DA 150.000 A 350.000 /mmc
•
•
Valori superiori al normale
per carcinomi, carenza di
ferro, da troppo esercizio
fisico, da febbre
reumatica, da
infiammazioni, da leucemie,
da morbo di Hodgkin, da
osteomieliti, da parto, da
policitemia, da
splenectomia, da traumi,
uso di vit B12.
Valori inferiori da anemia
aplastica, deficit di vit
B12, infezioni virali,
leptospirosi, leucemia,
linfomi, malaria, porpora,
trasfusioni, antibiotici,
barbiturici, diuretici,
fenilbutazone, (FANS),
ipoglicemizzanti,
sulfamidici.
Le piastrine
I LEUCOCITI (WBC)
• I leucociti, o globuli bianchi, sono deputati alla difesa
dell'organismo. Nel sangue essi sono assai meno
numerosi dei globuli rossi. Il numero dei leucociti nel
sangue è di 4000-10000 /mm3. I leucociti si dividono
in due categorie: cellule mieloidi e cellule linfoidi. Il
termine di granulociti è dovuto alla presenza di granuli
nel citoplasma di queste cellule. Questi granuli sono
differenti nei vari tipi di granulocita e ci aiutano a
distinguerli. Infatti, i granuli hanno una differente
affinità per i coloranti neutri, acidi o basici e fanno
assumere al citoplasma un colore differente. I
granulociti si distinguono dunque in neutrofili,
eosinofili (o acidofili), basofili. Le cellule linfoidi,
invece, sono rappresentate dai linfociti.
Formula leucocitaria
• Ciascun tipo di leucocita è presente
nel sangue in proporzioni diverse:
• granulocita neutrofilo 55 - 65 %
granulocita eosinofilo 0 - 3%
granulocita basofilo 0 - 2 %
linfocita 20 - 35 %
monocita 3 - 7 %
Neutrofili
I neutrofili sono molto
attivi nel fagocitare
batteri e sono presenti
in grandi quantità nel
pus delle ferite.
Purtroppo, queste cellule
non sono capaci di
rigenerare i lisosomi
utilizzati nel digerire i
microbi e muoiono dopo
averne fagocitati alcuni.
Eosinofili
I basofili secernono sostanze
anticoagulanti e vasodilatatrici
come l'istamina e la serotonina.
Anche se possiedono capacità
fagocitaria, la loro funzione
principale è quella di secernere
sostanze che mediano la
reazione di ipersensibilità.
Linfociti
I linfociti sono cellule che, oltre a essere
presenti nel sangue, popolano gli organi e i
tessuti linfoidi, nonchè la linfa che circola nei
vasi linfatici. Gli organi linfoidi comprendono il
timo, il midollo osseo (negli uccelli la borsa di
Fabrizio), la milza, i linfonodi, le tonsille
palatine, le placche di Peyer e il tessuto
linfoide dei tratti respiratorio e digerente.
Linfociti
•
La maggior parte dei linfociti
circolanti nel sangue si trova allo
stato di riposo(resting). Essi
hanno l'aspetto di piccole cellule
con nucleo compatto che occupa
quasi tutto il volume cellulare. Di
conseguenza, il citoplasma è
molto ridotto. I linfociti degli
organi e dei tessuti linfoidi
possono invece essere attivati in
varia misura a seguito della
stimolazione antigenica. Nel
sangue, i linfociti rappresentano
il 20-35% di tutti i leucociti e
possiedono una dimensione
leggermente superiore a quella
dei globuli rossi.
Monociti
• I monociti sono precursori dei macrofagi. Sono le cellule
del sangue di dimensione maggiore. Quando nel midollo
osseo raggiungono la maturità, vengono immessi nella
circolazione sanguigna dove permangono per 24-36 ore.
Migrano poi nel tessuto connettivo, dove diventano
macrofagi e si muovono nei tessuti. In presenza di un
focolaio infiammatorio, i monociti migrano attivamente dai
vasi sanguigni e iniziano una intensa attività fagocitaria. Il
ruolo di queste cellule non si esaurisce nella fagocitosi
poichè mostrano anche un'intensa attività di secrezione.
Essi producono sostanze che hanno funzioni difensive,
come il lisozima, gli interferoni e citochine che modulano
la funzionalità di altre cellule. I macrofagi cooperano nella
difesa immunitaria, espongono sulla membrana molecole
digerite e le presentano alle cellule più specializzate,
come i linfociti T e B.