Caratterizzazione funzionale della biosintesi degli aromi delle uve

Review n. 14 – Italus Hortus 18 (2), 2011: 39-61
Caratterizzazione funzionale della biosintesi degli aromi delle uve durante lo sviluppo dell’acino e controllo della qualità aromatica delle uve
D’Onofrio Claudio*
Laboratorio di Ricerche Viticole ed Enologiche, Dipartimento di Coltivazione e Difesa delle Specie
Legnose “G. Scaramuzzi”, Università di Pisa
Ricezione: 1 giugno 2011; Accettazione: 25 giugno 2011
F un c t i on a l c h a ra c te ris a tion of
aroma biosynthesis during berry
development and management of
grape aroma quality
Abstract. Grapevine is one of the most important
crops in the world and many research groups have
focused their attention on it. The technological potential of a grape variety depends on some compounds
derived from secondary metabolism, such as flavanoids and flavour compounds, determining the
organolectic parameters used to define wine quality.
Grape-derived flavour compounds and some flavour
precursors modified during fermentation are produced
during berry development and the final mixture
depends on variables, which include the grape variety
used, the environmental conditions during the growing
season, the management of the vineyard and of the
ripening stage at the time of harvest. Grape flavour
management in the vineyard requires knowledge of
the derivation of individual flavour and aroma characteristics and the effects that different concentrations
and interactions between these compounds have on
flavour potential. Hundreds of secondary metabolites
that potentially contribute to wine aroma have been
identified in grape berries. The main groups of grape
berries flavour metabolites include terpenoids
(monoterpenes, sesquiterpenes, C13-norisoprenoids),
shikimate pathway derivatives (volatile phenols and
benzene derivatives), thiols, methoxypyrazines,
aliphatic aldehydes and alcohols. Recent technology
applications in the field of functional genomics, the
massive sequencing of expressed genome sections,
the decodification of whole grape genome, together
the evolution of techniques for analysis of volatiles,
yield many progress in functional characterisation on
aroma biosynthesis in berries. The analysis of aroma
evolution during the berry development of several
varieties achieved many aspects on the influence of
cultivation site, light intensity, temperature, leaf
removal, abiotic and biotic stresses on the biosynthesis of grape aromas. The analysis of correlation
among flavour compounds and gene expression patterns during berry development and in elicited cell
*
[email protected]
suspension is a useful tool for the selection and functional characterisation of genes involved in aroma
biosynthesis and it achieved the characterisation of a
large number genes involved in terpene, thiols and
methoxypyrazines biosynthesis. The above knowledge on grape and wine aroma research, will improve
decision making along the chain of production for the
management of aroma to improve wine typicity.
Key words: aroma gene’s, aroma precursors, berry
development, GC-MS, gene expression, grape
aroma, SPE, SPME.
Gli aromi del vino e delle uve
Il fascino esercitato dal vino sul consumatore è
dovuto alla complessità delle sensazioni che esso è in
grado di dare, alla loro variabilità e non uniformabilità. In tale ambito la finezza, la persistenza e la complessità aromatica di un vino sono caratteristiche
molto ricercate dal consumatore moderno.
L’aroma del vino è costituito da alcune centinaia
di composti di varia origine, con concentrazioni che
variano da diversi mg/L a qualche frazione di ng/L, di
piccola dimensione (< 300 Da) e volatili alle normali
condizioni atmosferiche, che generano una sensazione di odore quando raggiungono l’epitelio olfattivo.
Grazie all’enorme variabilità di note espresse, gli
aromi rappresentano i componenti che maggiormente
definiscono i parametri di qualità e di tipicità del
vino, inoltre, alcune componenti della frazione aromatica possono essere assunte come marker tecnologici e di conservazione del vino rivestendo un ruolo
importante nella rintracciabilità di filiera e nella difesa delle produzioni locali e regionali.
Gli aromi del vino sono attribuibili ad aldeidi,
alcoli, esteri, idrocarburi, chetoni e furani. In relazione alla loro genesi essi possono essere classificati in:
• aromi primari o varietali: sostanze presenti nelle
uve che conferiscono al vino l’impronta aromatica
del vitigno;
• aromi secondari o pre-fermentatici e fermentativi:
sostanze che si originano dal metabolismo dei lie39
D’Onofrio
viti e dei batteri che conducono le fermentazioni
alcolica e malolattica;
• aromi terziari o post-fermentativi: sostanze derivate da reazioni chimiche post-fermentative che
intervengono nel corso dell’evoluzione e dell’affinamento del vino.
Gli aromi del vino sono, pertanto, il risultato della
concomitanza di:
• metabolismo dell’uva, dipendente dall’ecosistema
viticolo (vitigno/portinnesto, clima, terreno, tecniche colturali);
• biochimismi pre-fermentativi (ossidazioni, idrolisi)
che si verificano nel corso della pigiatura e della
macerazione;
• metabolismo dei microrganismi responsabili della
fermentazione alcolica e malolattica, dipendente
anche dai composti delle uve non direttamente
coinvolti nella produzione degli aromi;
• reazioni chimiche che avvengono durante l’evoluzione e l’affinamento dei vini.
Conseguentemente, il profilo aromatico di un vino
è l’espressione di tanti fattori che insieme contribuiscono a definire un carattere aromatico che è tipico e
distintivo di ogni tipologia di vino ed è strettamente
legato alla varietà, al territorio e all’andamento stagionale.
Aromi varietali e qualità aromatica delle uve
Un vino viene particolarmente apprezzato quando
degustandolo si percepiscono l’originalità del vitigno
e il territorio nel quale il vino è stato prodotto. Gli
aromi varietali, pertanto, nell’essere importanti nel
determinare le caratteristiche qualitative del vino e nel
permettere il riconoscimento del vitigno nel vino,
sono tra i composti che maggiormente determinano le
caratteristiche qualitative delle uve e da cui dipende il
potenziale tecnologico di un vitigno. Lo studio delle
caratteristiche aromatiche delle uve ha permesso di
valorizzare vitigni con buone potenzialità enologiche,
ma poco coltivati, contribuendo al mantenimento della
biodiversità ed alla valorizzazione di prodotti legati al
territorio. Il controllo della qualità aromatica delle uve
nel vigneto richiede le conoscenze sulla provenienza
dei vari composti che li caratterizzano e su come le
concentrazioni e le interazioni tra questi influenzano il
potenziale aromatico. Al fine di poter opportunamente
intervenire in modo mirato con le tecniche colturali
per modulare la qualità aromatica nel vigneto, è
necessario individuare i momenti di massima biosintesi delle singole classi di composti nel corso dello sviluppo dell’acino e conoscere nel dettaglio l’influenza
dei vari fattori colturali sulla loro biosintesi.
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Aromi varietali e precursori d’aroma
Le principali classi di composti che costituiscono
gli aromi varietali sono terpeni (monoterpeni e sesquiterpeni), C13-norisoprenoidi, derivati della via biosintetica dello scichimato (detti anche derivati del benzene o benzenoidi), tioli volatili (detti anche mercaptani), metossipirazine, alcoli alifatici e aldeidi a 6 atomi
di carbonio (fig. 1).
Gli aromi varietali sono presenti nelle uve e nei
vini sia in forma libera che coniugata non volatile e
inodore. Gli aromi varietali coniugati, detti anche
“precursori d’aroma”, rilasciano gli agliconi odorosi
durante la vinificazione e la conservazione dei vini
conferendo al vino le note aromatiche varietali (Di
Stefano et al., 1998; Maicas e Mateo, 2005; Cabrita et
al., 2006; Ugliano e Moio, 2008).
Gli aromi presenti nell’uva già in forma libera
vengono anche definiti “aromi varietali primari”,
mentre gli agliconi che si liberano nel corso delle fasi
di pre-fermentazione, fermentazione e affinamento
dagli aromi coniugati presenti nell’uva sono anche
detti “aromi varietali secondari”.
In relazione alla presenza di aromi varietali liberi e
coniugati le uve vengono classificate in:
• “uve aromatiche”, quelle in cui gli aromi liberi
sono presenti in concentrazioni superiori alla loro
soglia olfattiva e, quindi, immediatamente percettibili con la degustazione dell’uva;
• “uve neutre” o “a sapore semplice” o “non aromatiche”, quelle in cui le forme libere degli aromi
sono presenti in concentrazioni inferiori alla loro
soglia olfattiva e, di conseguenza, non percettibili
con la degustazione delle uve.
I precursori d’aroma dei monotepeni, C13-norisoprenoidi, derivati del benzene e alcoli alifatici C6
sono coniugati degli zuccheri (eterosidi), e nello specifico si tratta di glucosidi semplici in cui l’aglicone
è legato al glucosio, o glicosidi disaccaridici in cui
Fig. 1 - Principali classi di aromi varietali dell’uva.
Fig. 1 - Main classes of grape aroma.
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
α-L-arabinofuranosio o α-L-ramnopiranosio o il β-Dapiofuranosio sono legati al glucosio e quindi all’aglicone (fig. 2) (Francis e Newton, 2005). I tioli, invece,
non sono presenti nell’uva come S-coniugati della
cisteina (Tominaga et al, 1998) o del glutatione
(Fedrizzi et al., 2009).
Gli eterosidi rilasciano gli agliconi odorosi, durante la vinificazione e la conservazione dei vini, per
idrolisi enzimatica attraverso azione degli enzimi dell’uva, dei lieviti o esogeni, o per idrolisi acida promossa dagli acidi del mosto e del vino. La composizione e le proprietà sensoriali del pool di composti
rilasciati attraverso questi due meccanismi sono fondamentalmente differenti: l’idrolisi enzimatica implica la rottura del legame glicosidico e, quindi, non
induce ulteriori trasformazioni nella struttura chimica
dell’aglicone rilasciato, mentre l’idrolisi acido-catalizzata comporta la rottura del legame etere tra il glucosio e l’aglicone con formazione di un carbocatione
reattivo, che può subire ulteriori trasformazioni dando
un vasto assortimento di composti. L’idrolisi enzimatica degli eterosidi implica l’intervento di glicosidasi
che agiscono in modo sequenziale: prima un enzima
specifico che rompe il legame disaccaridico (α-Lramnosidasi, α-L- arabinosidasi, β-D-apiosidasi) e poi
una β-D-glucosidasi che libera l’aglicone odoroso dal
glucosio (Gunata et al., 1988). Sia l’uva che i lieviti
possiedono delle glicosidasi capaci di idrolizzare questi eterosidi dell’uva, ma nelle condizioni di vinificazione, questa idrolisi è relativamente limitata, sia
perché le β-glicosidasi hanno un pH ottimale di attività intorno a 5-6, sia perché esse sono fortemente ini-
Fig. 2 - Struttura degli aromi glicoconiugati.
Fig. 2 - Structure of glycoconjugates aroma.
bite dal glucosio. Poiché l’attività enzimatica presente
naturalmente nell’uva e nei lieviti non è sufficiente a
liberare tutto il potenziale aromatico, si può fare ricorso a preparati enzimatici esogeni a forte attività β-glicosidasica.
Gli agliconi S-coniugati dei tioli vengono idrolizzati principalmente nel corso della fermentazione
alcolica per azione della β-liasi dei lieviti che rompe il
legame carbonio-zolfo (Peyrot de Gachons et al.,
2002). I tioli coniugati sono responsabili della particolare sensazione descritta come “ritorno aromatico di
Sauvignon”, che si percepisce bruscamente per via
retro-nasale dopo vari secondi dal momento della
degustazione delle uve per azione di una reazione
dovuta agli enzimi della nostra mucosa orale che libera gli agliconi di questi composti.
Fattori che regolano la biosintesi degli aromi
varietali
La produzione e la composizione finale degli
aromi delle uve, prodotti nel corso dello sviluppo
degli acini, dipende da vari fattori, tra cui il vitigno, le
condizioni pedo-climatiche e le tecniche colturali, che
congiuntamente alle tecniche di vinificazione, sono
responsabili delle differenze che caratterizzano i vini
ottenuti da uno stesso vitigno.
Il genotipo rappresenta indubbiamente il fattore più
importante. Sulla base dei vari profili aromatici sono
stati realizzati raggruppamenti di vitigni aventi tendenze biosintetiche simili a seconda della natura e del contenuto dei composti terpenici in esse presenti (Di
Stefano, 1996a). I monoterpeni prevalgono nelle uve
aromatiche, tra cui il Moscato bianco (D’Onofrio et
al., 2010a), mentre nel Sangiovese (Di Stefano et al.,
1996c; Lanati et al., 2000; D’Onofrio et al., 2008) e
Ciliegiolo (D’Onofrio et al., 2010b) i monoterpeni e i
C13-norisoprenoidi sono tra loro in concentrazioni più
simili. Nelle uve di Aleatico prevalgono i monoterpeni
come nel Moscato bianco, ma con una netta prevalenza del geraniolo anziché del linalolo (D’Onofrio et al.,
2010a). Nelle uve di Vermentino, un vitigno considerato ad uva neutra, vi è una leggera prevalenza dei
monoterpeni sui derivati del benzene e C13-norisoprenoidi e una significativa presenza di aromi liberi anche
se in concentrazioni molto inferiori a quelle riscontrate
nelle uve tipicamente aromatiche del Moscato bianco e
Aleatico, ma completamente assenti nelle uve di
Sangiovese (caratteristica tipica delle uve non aromatiche). Pertanto, dal punto di vista aromatico, il
Vermentino si colloca in una posizione intermedia tra i
vitigni tipicamente a uve non aromatiche e i vitigni a
uve aromatiche (D’Onofrio et al., 2010c). Mentre alcune classi di aromi sono ubiquitarie, tra cui appunto
41
D’Onofrio
monoterpeni e C13-norisoprenoidi, alcuni vitigni sono
dotati di aromi specifici che non sono rilevabili in altre
cultivar, come ad esempio le metossipirazine ed i tioli
che caratterizzano i Cabernet, il Sauvignon blanc e
pochi altri vitigni (Kalua e Boss, 2009; RodríguezBencomo et al., 2009), e i sesquiterpeni che sono tra i
principali responsabili dell’aroma dei vini di Syrah
(Wood et al., 2008).
Tra i diversi fattori colturali che influenzano il
contenuto in aromi delle uve vi sono l’ambiente di
coltivazione (Borsa et al., 2007), il microclima dei
grappoli (Reynolds et al., 1996; Lee et al., 2007), la
rimozione delle foglie basali (Zoecklein et al., 1998;
D’Onofrio et al., 2010c), l’esposizione diretta del
grappolo alla radiazione solare e l’escursione termica
giornaliera (Belancic et al., 1997), i livelli produttivi
ed il diradamento dei grappoli (Reynolds et al., 1996;
Prajitna et al., 2007), lo stadio di maturazione delle
uve (Palomo et al., 2007). Un elevato contenuto in
calcare dei terreni favorisce la persistenza e la finezza
aromatica e l’accumulo di C13-norisoprenoidi, mentre
la concimazione aumenta la concentrazione di carotenoidi la cui sintesi può, però, essere ridotta se i grappoli sono in ombra.
Profili aromatici e dinamiche di espressione genica
Al fine di poter controllare in modo adeguato la
qualità aromatica del vigneto, oltre a conoscere l’influenza dei vari fattori colturali sulla biosintesi di questi composti, è necessario individuare i momenti di
massima biosintesi delle singole classi di composti nel
corso dello sviluppo dell’acino al fine di poter intervenire in modo mirato con le tecniche colturali.
Quindi è necessario determinare sia i picchi di accumulo dei singoli composti nel corso dello sviluppo
dell’acino sia conoscere nel dettaglio le dinamiche di
espressione dei geni responsabili della loro biosintesi.
In passato gli studi in merito alle dinamiche di accumulo degli aromi e di espressione genica nel corso
dello sviluppo dell’acino sono state spesso disincentivate dalla mancanza di metodologie affidabili, semplici ed economiche, capaci di identificare e quantificare
una così grande quantità di composti, spesso complessi, e per l’agevole determinazione dell’espressione del
gran numero di geni coinvolti, oltre che dai molteplici
effetti esercitati dall’ambiente sulla componente aromatica delle uve.
Tecniche di analisi degli aromi ed evoluzione dei profili aromatici durante lo sviluppo dell’acino
La determinazione e la quantizzazione degli aromi
delle uve, sia liberi che coniugati, viene fatta princi42
palmente attraverso estrazione in fase solida (SPE:
solid phase extraction) o con micro-estrazione in fase
solida dello spazio di testa (HS-SPME: head space
solid phase micro extraction) e determinazione
mediante gas-cromatografia accoppiata a spettrometria di massa (GC-MS). Inoltre i precursori non volatili e gli aromi coniugati possono essere analizzati
direttamente con apparato per cromatografia liquida
accoppiata a spettrometria di massa (LC-MS).
Sostanzialmente i più diffusi protocolli per l’analisi degli aromi delle uve prevedono l’analisi separata
della componente libera degli aromi e di quella coniugata, generalmente eterosidica. La metodologia SPE,
così come riportato da Di Stefano (1991), consiste
nell’estrazione della componente solubile degli acini
freschi in un tampone tartarico a pH 3,2 e successiva
separazione delle componenti di interesse con passaggio su cartucce contenenti resine C18 che legano sia
gli aromi liberi che glicosilati. Dalle cartucce vengono
eluiti prima gli aromi liberi, che sono concentrati a
piccolo volume e analizzati con l’apparato GC-MS, e
poi vengono eluiti gli aromi glicosilati che sono successivamente trattati con delle glicosidasi in modo da
liberare gli agliconi che vengono recuperati con ulteriore passaggio sulle resine C18 e quindi analizzati
alla GC-MS. Con l’estrazione di tipo HS-SPME,
generalmente gli acini vengono macinati e posti in un
piccolo recipiente chiuso dove viene inserita una fibra
ricoperta di materiale sorbente in modo da adsorbire
le sostanze volatili che vengono poi desorbite direttamente nell’iniettore dell’apparato GC-MS. Il protocollo SPE sopra descritto presenta una buona ripetibilità e consente una facile separazione degli aromi liberi da quelli glicosilati, mentre l’SPME descritta rileva
meglio alcuni composti, ma non consente una facile
determinazione degli aromi glicosilati dato che l’aggiunta delle glicosidasi direttamente nel campione di
uve macinate difficilmente riesce a liberare gli agliconi degli eterosidi a causa della presenza del glucosio
che inibisce questi enzimi. Lo spettrometro di massa
accoppiato al gascromatografo consente una facile
identificazione qualitativa dei vari composti volatili
attraverso il confronto degli spettri di massa con quelli degli standard o di specifici database. La determinazione quantitativa viene invece fatta confrontando le
aree dei picchi del cromatogramma con quelle dei singoli standard oppure confrontando l’area dei picchi di
tutti i composti di interesse con quella di uno standard
interno appositamente aggiunto al campione, ottenendo così una determinazione di tipo semiquantitativa.
In generale, il contenuto totale di aromi, e particolarmente di terpeni e derivati del benzene è molto elevato nei fiori, e insieme ai C13-norisoprenoidi e com-
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
posti alifatici C6, sono già presenti nell’uva acerba,
anche se a concentrazioni basse, per poi aumentare
progressivamente nel corso della maturazione in concomitanza con l’accumulo degli zuccheri. Mentre,
altre classi di aromi, come le metossipirazine, si accumulano molto prima dell’invaiatura ed il loro contenuto si riduce notevolmente durante la maturazione
(Ryona et al., 2008; Kalua e Boss, 2009), e altre ancora, come i benzenoidi, compaiono solo durante la
maturazione (Kalua e Boss, 2009).
A tale proposito è necessario porre l’attenzione
su alcune considerazioni che riguardano le modalità
di espressione della concentrazione degli aromi nelle
uve. Dal punto di vista produttivo ed enologico risulta conveniente esprimere le concentrazioni per unità
di peso di tessuto, e quindi nel caso specifico per
peso dell’acino, ma ai fini dello studio delle dinamiche di biosintesi e di accumulo appare più conveniente esprimere tale contenuto per singolo acino, in
modo da evitare gli eventuali effetti di diluizione che
si possono verificare in seguito al rapido accumulo
di acqua e altri componenti all’interno dell’acino, e
avere, pertanto, una indicazione più precisa sull’effettiva attività di biosintesi e di accumulo.
Prendendo in considerazione il contenuto in terpeni,
C13-norisoprenoidi, derivati del benzene e composti
alifatici a C6, rilevati in fiori chiusi e aperti, e acini
ad intervalli regolari di 10-11 giorni dall’allegagione
alla surmaturazione in Moscato bianco, un vitigno
aromatico, ed esprimendo le concentrazioni per
grammo di tessuto, gli aromi appaiono particolarmente abbondanti nei fiori e presenti sin dalle prime
fasi di sviluppo degli acini per poi aumentare notevolmente di concentrazione nel corso della maturazione fino a raggiungere un picco di concentrazione
che precede la vendemmia (fig. 3) (D’Onofrio et al.,
2010a). Esprimendo le medesime concentrazioni per
singolo fiore o acino (fig. 4), sparisce il picco di
concentrazione nei fiori e appare ben evidente che
l’accumulo comincia ad aumentare significativamente sin dalla fine della fase erbacea, e non è più visibile l’apparente stasi nell’accumulo che invece risulta
evidente esprimendo le medesime concentrazioni per
grammo di tessuto a causa dell’effetto di diluizione
conseguente al rapido accrescimento dell’acino. Il
picco di aromi liberi, rappresentato principalmente
da terpeni, indicherebbe il momento di massima attività biosintetica per questi composti. In riferimento
alle varie classi di aromi, i terpeni e i derivati del
benzene sono apparsi particolarmente abbondanti nei
fiori, e tutte le classi di aromi considerate sono risultate presenti già dalle prime fasi di sviluppo dell’acino (fig. 5). Inoltre, appare chiaro che vi è una forte
Fig. 3 - Curva di crescita dell’acino e concentrazioni delle
componenti libere e glicosilate degli aromi, in fiori (chiusi e
aperti) e acini di “Moscato bianco” espresse in μg per grammo di
tessuto. (D’Onofrio et al., dati non pubblicati).
Fig. 3 - Trend of berry development and total, free and
glycolconjugates aroma compounds in flowers (bud flowers and
open flowers) and during berry development of Moscato bianco.
Concentration expressed as μg per g of tissue. (D’Onofrio et al.,
unpublished data).
Fig. 4 - Curva di crescita dell’acino e concentrazioni delle
componenti libere e glicosilate degli aromi in fiori (aperti e
chiusi) e acini di “Moscato bianco” espresse in μg per fiore o
acino. (D’Onofrio et al., dati non pubblicati).
Fig. 4 - Trend of berry development and of single class of aroma
compounds in flowers (bud flowers and open flowers and during
berry development of Moscato bianco. Concentration expressed as
μg per flower or berry. (D’Onofrio et al., unpublished data).
prevalenza dei monoterpeni sulle altre componenti
aromatiche, mentre nel Sangiovese, un vitigno non
aromatico, il contenuto totale in aromi nelle varie
fasi fenologiche di sviluppo dell’acino è apparso
inferiore fino a 4 volte, e a differenza del Moscato,
in questo vitigno non vi è la netta prevalenza dei terpeni che vanno a coprire le note aromatiche delle
altre classi di aromi, ma terpeni, C13-norisoprenoidi e
derivati del benzene hanno tra loro concentrazioni
simili implicando una maggiore complessità aromatica dei vini (D’Onofrio et al., 2008). Maggiori dettagli sulle dinamiche di accumulo degli aromi nel
43
D’Onofrio
Fig. 5 - Curva di crescita dell’acino e concentrazioni delle varie
classi di aromi in fiori (aperti e chiusi) e acini di “Moscato
bianco” espresse in μg per fiore o acino. (D’Onofrio et al.,
dati non pubblicati).
Fig. 5 - Trend of berry development and of single class of aroma
compounds in flowers (bud flowers and open flowers and during
berry development of Moscato bianco. Concentration expressed
as μg per flower or berry. (D’Onofrio et al., unpublished data).
corso dello sviluppo dell’acino sono forniti nelle
specifiche sezioni delle varie classi di aromi.
La genomica funzionale e l’espressione genica nella
caratterizzazione della biosintesi degli aromi
Le recenti innovazioni tecnologiche nel campo
della genomica funzionale hanno reso possibile
importanti progressi anche per la vite. In tal senso,
l’ampio sequenziamento delle sequenze espresse,
dette ESTs (Expressed Sequence Tags), ha rappresentato un’acquisizione di grande importanza per la
genomica funzionale: la vite è una delle specie meglio
caratterizzate in termini di ESTs, tanto che attualmente in Genbank le ESTs di Vitis vinifera oltrepassano le
360.000 accessioni, la maggior parte delle quali relative alle varie fasi di sviluppo dell’acino. Nuovi scenari
si sono poi aperti in seguito al sequenziamento completo del genoma della vite (Jaillon et al., 2007;
Velasco et al., 2007), evento che ha agevolato la possibilità di identificazione delle sequenze geniche. È
proprio grazie all’analisi dell’omologia delle sequenze
genomiche e delle ESTs con sequenze già annotate in
altri organismi che recentemente sono stati individuati
e caratterizzati tutta una serie di geni coinvolti nella
biosintesi degli aromi della vite. In tale ambito, l’analisi della correlazione tra l’accumulo dei composti
aromatici e l’espressione genica nei fiori e durante lo
sviluppo dell’acino si è rilevato un ottimo strumento
per la selezione dei più promettenti geni candidati
coinvolti nella biosintesi dei terpeni (D’Onofrio et al.,
2010a), tioli (Kobayashi et al., 2011) e metossipirazione (Dunlevy et al., 2010). Inoltre, come prima già
evidenziato, la conoscenza delle dinamiche di espressione genica nel corso dello sviluppo dell’acino sono
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di fondamentale importanza per identificare le fasi
fenologiche nelle quali questi geni sono maggiormente espressi al fine di poter intervenire in modo mirato
e puntuale per modulare adeguatamente la qualità aromatica delle uve.
Allo stato attuale l’espressione genica può essere
agevolmente determinata con costi contenuti attraverso la RT-PCR real-time, i microarrays a DNA e tecniche di sequenziamento veloce di ultima generazione
tipo pirosequenziamento. La PCR real-time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in
tempo reale (rtq-PCR), è un metodo di amplificazione
e quantificazione simultanea del DNA. La PCR realtime rileva la fluorescenza emessa durante la reazione
come un indicatore della quantità di ampliconi prodotti in ogni singolo ciclo. Il segnale fluorescente
aumenta proporzionalmente all’aumento della quantità di prodotto di PCR, per cui, rilevando la quantità
di fluorescenza emessa in ogni singolo ciclo di PCR è
possibile monitorare la reazione di PCR durante la
fase esponenziale, nel corso del quale il primo incremento significativo dei prodotti di PCR è correlato
alla quantità di stampo presente all’inizio della reazione: tanto più è elevato il numero di copie di stampo
all’inizio della reazione tanto più è precoce un significativo incremento della fluorescenza emessa. La PCR
real-time, combinata con la PCR Retro Trascrizionale
(RT-PCR), permette di quantificare l’espressione relativa di un gene ad un tempo specifico, in particolare
tessuto o una particolare cellula. I DNA microarrays
sono divenuti uno strumento di fondamentale importanza per la diagnostica medica, la farmacogenomica
e la biologia dello sviluppo animale e vegetale. Il
principio concettuale di questa metodologia è la capacità di analisi dell’espressione contemporanea di molti
geni attraverso la disposizione in “arrays” su chip di
oligomeri di DNA sintetico designati sulla base di
sequenze di genoma espresse. Il pirosequenziamento
è una delle nuove tecniche di sequenziamento ad elevato parallelismo, basata sul principio del sequencing
by synthesis che si basa sull’utilizzo di una serie di
enzimi che producono luce in presenza di ATP quando un nucleotide viene incorporato nel filamento ad
opera della DNA polimerasi. Per ogni ciclo viene
introdotto un unico nucleotide e l’incorporazione nel
filamento dei nucleotidi genera una quantità di luce
che è proporzionale al numero di basi incorporate in
un’unica aggiunta di nucleotidi. La luce emessa viene
rilevata da un sensore CCD che ne registra l’intensità,
sulla base della quale si ricostruisce la sequenza.
Questo tipo di tecnica risulta particolarmente utile per
la valutazione dell’espressione genica nelle specie in
cui è stato sequenziato il genoma, tra cui appunto la
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
vite, che tra l’altro, grazie al grosso lavoro di annotazione genica che è stato svolto, il suo genoma è diventato quello di riferimento per gli studi nelle specie
arboree da frutto.
In molti studi di genomica funzionale sono state
utilizzate con successo anche le sospensioni cellulari,
le quali, oltre ad essere economiche, offrono la possibilità di controllare facilmente e accuratamente le
condizioni ambientali permettendo di effettuare esperimenti durante tutto il corso dell’anno e di attribuire
specifici effetti ad un determinato fattore. Inoltre, la
possibilità di utilizzare le sospensioni cellulari per
attivare la sintesi di determinati composti per mezzo
di appropriati elicitori, congiuntamente all’analisi dell’espressione genica, rappresenta un ottimo mezzo per
individuare i presunti geni coinvolti in specifiche vie
biosintetiche. In tale ambito le sospensioni cellulari di
vite sono state utilizzate con successo per avere informazioni sui fattori che stimolano la biosintesi degli
aromi nelle uve (D’Onofrio et al., 2009a; Thibon et
al., 2011) e per individuare una serie di geni coinvolti
nella biosintesi dei sesquitepeni (D’Onofrio et al.,
2009a).
Le classi degli aromi varietali
Tra le varie classi di aromi varietali, i terpeni
(monoterpeni, sesquiterpeni), C 13-norisoprenoidi,
derivati del benzene, alcoli e aldeidi C6 sono composti che sono stati generalmente identificati nelle uve di
tutti i vitigni fin ora analizzati, mentre le metossipirazine e i tioli sono più specifici per alcune varietà.
Terpeni
I terpeni appartengono alla più ampia classe di
metaboliti secondari delle piante e quelli che maggiormente contribuiscono a determinare gli aromi delle
uve e dei vini sono i monoterpeni, ai quali si aggiungono i sesquiterpeni particolarmente importanti in
alcuni vini. I monoterpeni sono composti a 10 atomi
di carbonio e i sesquiterpeni a 15 atomi di carbonio. I
terpeni comprendono anche i carotenodi (tetraterpeni
a 40 atomi di carbonio) dai quali derivano i C13-norisoprenoidi.
I monoterpeni sono tipicamente aromi varietali e
alti livelli di monoterpeni si ritrovano generalmente
nelle uve aromatiche. Approssimativamente nelle uve
sono stati identificati 70 monoterpeni, presenti come
idrocarburi semplici, aldeidi, alcoli (anche conosciuti
come monoterpenoli), acidi e esteri. I più frequenti
sono i monoterpenoli, tra cui il linalolo e i suoi epossidi piranici e furanici, nerolo, geraniolo, citronellolo,
α-terpineolo, ossido di nerolo e ossido di rosa che
conferiscono gradevoli note floreali di rosa (geraniolo, nerolo, ossido di rose), di coriandolo (linalolo), di
canfora (linalol ossido), ma anche note verdi (ossido
di nerolo) ed erbacee non sempre piacevoli. Nel vino
la loro soglia di percezione varia da frazioni a centinaia di microgrammi per litro.
Nell’acino i monoterpeni possono trovarsi nell’uva
sia in forma libera che glicosilata e sono stati individuati principalmente nella buccia (Gholami et al.,
1995) anche se è ancora poco chiara la situazione
riguardo alla compartimentalizzazione tra i differenti
tessuti del frutto. I monoterpeni sono molto abbondanti nei fiori (Wilson et al., 1984, D’Onofrio et al.,
2010a) e sono presenti in tutte le fasi di sviluppo dell’acino dove l’accumulo riprende significativamente
alla fine della fase erbacea in correlazione con l’accumulo degli zuccheri, per poi diminuire nell’ultima
fase della maturazione (Asporundi et al., 2007) precedendo spesso la data di vendemmia, come evidenziato
in Moscato bianco e Sangiovese (D’Onofrio et al.,
2010a), Moscato d’Amburgo (Fenoll et al., 2009),
Airén, Chardonnay e Macabeo (Garcia et al., 2003) e
in uve da tavola (Yang et al., 2011). I più abbondanti
eterosidi monotepeni sono apiosilglicosidi e arabinosilglicosidi, seguiti dai rutinosidi e poi dai monoglucosidi, e sono contenuti in quantità pressoché simili
nelle diverse parti dell’acino, mentre la proporzione
relativa fra composti liberi e legati varia in funzione
della cultivar. Generalmente nell’acino la frazione
eterosidica dei monoterpeni è da 3 a 10 volte più
abbondante di quella libera, persino nelle uve aromatiche (Gunata et al., 1988; D’Onofrio et al., 2010a),
rimane inoltre sempre più elevata di quella libera e
aumenta in concentrazione nel corso della maturazione (D’Onofrio et al., 2010a; Fenoll et al., 2009;
Hellin et al., 2010) suggerendo che lo stoccaggio
degli alcoli terpenici avviene per la maggior parte in
forma legata, ad eccezione del linalolo la cui frazione
libera è talvolta superiore a quella legata nelle uve
mature (Fenoll et al., 2009) o addirittura per tutta la
durata della maturazione.
I sesquiterpeni sono presenti nelle uve esclusivamente in forma libera e ne sono stati identificati alcuni come idrocarburi a odore resinoso e alcuni come
alcoli. Il farnesolo rappresenta uno dei principali componenti volatili dei mosti di alcune varietà quali il
Boal e il Verdello (Câmara et al., 2004), Baga
(Coelho et al., 2006), Syrah (Parker et al., 2007), ed è
risultato molto abbondante nei fiori di Moscato bianco (fig. 6) e di Sangiovese, con lievi picchi talvolta
rilevati nel corso della fase erbacea (D’Onofrio et al.,
2010a). Alcuni sesquiterpeni, tra cui il β-cariofillene,
sono stati identificati nelle uve di Cabernet sauvignon
45
D’Onofrio
Fig. 6 - Curva di crescita dell’acino e concentrazione dei
sesquiterpeni in fiori e acini di “Moscato bianco” espressa in μg
per grammo di tessuto. (D’Onofrio et al., dati non pubblicati).
Fig. 6 - Trend of berry development and total sesquiterpenes
aroma in flowers (bud flowers and open flowers) and during berry
development of Moscato bianco. Concentration expressed as μg
per g of tissue. (D’Onofrio et al., unpublished data).
Fig. 7 - Via biosintetiche dei terpenoidi. MVA: via biosintetica
citosolica dell’acido mevalonico; MEP: via biosintetica plastidiale
del 2-metil-D-eritritol-4-fosfato. (modificata da
Aharoni et al., 2005).
Fig. 7 - Terpenoids biosynthetic pathways. MVA: cytosol
mevalonic acid pathway; MEP: plastidial 2-methyl-D-erythritol-4phosphate pathway. (modified from Aharoni et al., 2005).
e Riesling (Kalua e Boss, 2009; 2010). Il ruolo sensoriale dei sesquiterpeni nei vini è però ancora poco
chiaro; solo recentemente è stata identificata una relazione tra la concentrazione del sesquiterpene “rotundone” e la tipica nota di pepe nero dell’uva e nel vino
di Syrah (Wood et al., 2008). Il rotundone è stato
individuato anche nella Vespolina, un’uva trentina,
dove aumenta progressivamente in concentrazione nel
corso della maturazione (Caputi et al., 2011).
I processi di biosintesi e accumulo dei terpeni nell’acino sono fortemente influenzati dalle condizioni
climatiche, ambientali e colturali. Tra i diversi parametri che caratterizzano il clima, la temperatura ricopre sicuramente un ruolo determinante. Temperature
troppo elevate durante la maturazione dell’uva riducono la sintesi dei composti aromatici e accelerano la
degradazione di quelli maggiormente termolabili:
nelle annate e nelle zone più fresche la quantità totale
di terpeni aumenta più lentamente nel corso della
maturazione rispetto alle zone calde, ma raggiunge a
maturità un valore più elevato. Per il vitigno
Traminette, però, è stato evidenziato che i siti più
caldi favoriscono l’accumulo dei terpeni (Ji e Dami,
2008), inoltre, la defogliazione precoce, che quindi
dovrebbe comportare una maggiore temperatura dell’acino nel corso del giorno, ha indotto un maggiore
accumulo di monoterpeni rispetto al controllo (fig.
13) (D’Onofrio et al., 2010b).
et al., 2005). Entrambe le vie biosintetiche conducono
alla formazione dell’isopentenil-pirofosfato (IPP) e
del suo isomero, il dimetilallil-pirofosfato (DMAPP),
che costituiscono le unità di base a 5 atomi di carbonio (C5), dette anche unità isoprene, dalla cui condensazione sequenziale si ottengono gli scheletri di base
dei vari terpeni. Monoterpeni e carotenoidi vengono
sintetizzati soprattutto nei plastidi attraverso la via del
MEP, mentre i sesquiterpeni sono sintetizzati principalmente nel citosol attraverso la via dell’MVA
(Tholl, 2006). Tuttavia, non esiste un’assoluta separazione compartimentale in quanto tra i due percorsi
biosintetici avviene uno scambio di intermediari dal
citosol al plastidio (figg. 7 e 8) confermato dall’evidenza che mentre la via biosintetica dell’MVA non
contribuisce alla formazione dei monoterpeni, la via
del MEP contribuisce alla formazione di sesquiterpeni
(Dudareva et al., 2006).
Il processo biosintetico dei terpeni può essere suddiviso in tre fasi: nella prima fase vengono prodotte le
unità di base a 5 atomi di carbonio (IPP e DMAPP),
nella seconda queste vengono condensate per formare
i prenil-pirofosfati che nella terza fase sono convertiti
nei prodotti finali. Nella via biosintetica del MEP (fig.
8), il primo enzima è la 1-deossi-D-xilulosio-5-fosfato
sintasi (DXS) che condensa il piruvato con la gliceraldeide-3-fosfato producendo il deossi-D-xilulosio-5fosfato (DXP), sul quale per azione della DXP-reduttoisomerasi (DXR) viene sintetizzato il 2-C-metil-Deritritolo-4-fosfato (MEP). La CDP-ME sintetasi
(CMS) catalizza la trasformazione del MEP in 2-Cmetil-eritritolo (CDP-ME), dal quale per azione della
CDP-ME chinasi (CMK) si orina il 2-C-metil-eritritolo-2-fosfato (CDPME-2P). Il CDPME-2P, per catalisi
Caratterizzazione funzionale delle vie biosintetiche
I terpeni sono sintetizzati attraverso due distinte
vie biosintetiche (fig. 7): la via dell’acido mevalonico
(MVA), attiva nel citosol, e la via del 2-C-metil-Deritritolo-4-fosfato (MEP), attiva nei plastidi (Aharoni
46
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
Fig. 8 - Enzimi coinvolti nelle vie biosintetiche dell’acido mevalonico (MVA) e del 2-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP).
(Rodríguez-Concepción 2006, modificata)
Fig. 8 - Enzymes involved in the mevalonic acid pathway (MVA) and 2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway (MEP)
(Rodríguez-Concepción 2006, modified)
della ME-2,4-cPP sintasi (MCS) si trasforma in 2,4ciclodifosfato (ME-2,4-cPP) che è convertito in 1idrossi-2-metil-2-butenil-difosfato (HMBPP o
HMBDP) dall’enzima HMBPP sintasi (HDS). Il
HMBPP da origine a isopentenil-pirofosfato (IPP) e
dimetilallil-pirofosfato (DMAPP) per azione dell’enzima HMBPP reduttasi (HDR). L’isomerizzazione tra
IPP e DMAPP avviene ad opera dell’enzima IPP isomerasi (IDI). L’IPP e DAMPP sono quindi condensati
in prenil-pirofosfati per azione delle isoprenil-trasferasi. Al momento attuale di questa prima parte delle
suddetta via biosintetica plastidiale l’unico gene che è
stato individuato e funzionalmente caratterizzato nella
vite è il DXS, che ha permesso di sviluppare un metodo per stabilire se una vite produce uve aromatiche
oppure neutre (Emanuelli et al., 2010). In riferimento
alla via biosintetica dell’MVA (fig. 8), il primo enzima è la aceto-acetil tiolasi (AACT) che catalizza la
condensazione di due molecole di acetil-CoA per la
formazione dell’acetoacetil-CoA che è poi convertito
in 3-idrossi-3-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) dalla
HMG-CoA sintasi (HMGS), il quale è ridotto a acido
mevalonico (MVA) per catalisi della HMG-CoA
riduttasi (HMGR). Il MVA è convertito in mevalonato-5-fosfato (MVP o MVA-5-P) dalla mevalonato chinasi (MVK o MK) e questo a mevalonato-5-disfosfato
(MVPP o MVA-5-PP) per azione della fosfo-mevalonato-chinasi (PMK). Per catalisi della fosfo-mevalonato-carbossilasi (PMD o DPMDC) l’MVPP è trasformato in isopentenil-pirofosfato (IPP) e dimetilallil-pirofosfato (DMAPP), tra loro isomerizzati dalla
IPP isomerasi (IDI), che sono poi condensati per azione delle prenil-transferasi formando tutta una serie di
molecole precursori di alcune classi di composti, tra
cui anche il farnesil-pirofosfato (FPP) che è il precursore dei sesquiterpeni. Nella vite i geni di questa
prima parte della via biosintetica dell’MVA sono stati
tutti individuati attraverso l’analisi dell’omologia di
sequenza ed esperimenti di espressione genica condotti su sospensioni cellulari di acino di vite indotte a
47
D’Onofrio
produrre aromi per mezzo di elicitazione con jasmonati (D’Onofrio et al., 2006; 2009a). Questi esperimenti hanno dimostrato che trattando le sospensioni
cellulari di acini di Cabernet Sauvignon con metiljasmonato (MeJA) e acido jasmonico (JA) si ottiene
la produzione di oltre 25 sesquiterpeni, dei quali il più
abbondante è il β-cariofillene. Attraverso l’analisi dell’espressione genica per mezzo dell’analisi dei
microarrays e la RT-PCR real-time è stato possibile
evidenziare un’ampia serie di geni differenzialmente
espressi e che i geni HMGS, HMGR e DPMDC della
via biosintetica del’MVA che conduce alla produzione dei sesquiterpeni sono indotti dal trattamento con
jasmonati e soppressi dall’acido salicilico (fig. 9).
Inoltre, un altro aspetto molto importante per le possibili implicazioni pratiche che questa ricerca ha messo
in risalto è che i jasmonati oltre ad attivare la via biosintetica dei terpenoidi attivano anche quella dei fenoli, compreso antociani, tannini e stilbeni (D’Onofrio
et al., 2009a).
La condensazione dell’IPP e DMAPP, di tipo
testa-coda, avviene per azione di enzimi detti isoprenil-trasferasi, formando i prenil-pirofosfati tra cui il
Fig. 9 - Espressione dei geni della via biosintetica del mevalonato
in sospensioni cellulari indotte con metil-jasmonato (MeJA) o
acido jasmonico (JA). SA: acido salicilico. Gli istogrammi
indicano l’espressione, determinata attraverso la PCR real-time,
dei relativi geni rispetto alle sospensioni cellulari non trattate. I
valori rappresentano le medie e le barre l’errore standard delle tre
repliche. (modificata da D’Onofrio et al., 2009a).
Fig. 9 - Expression of genes of the mevalonate pathway in berry
cell suspension induced by methyl jasmonate (MeJA) and
jasmonic acid (JA) treatments. Graphs show the expression of
each gene relative to the control cell culture as determined by
real-time PCR. Values represent means + s.e. of three replicates.
(modified from D’Onofrio et al., 2009a).
48
Fig. 10 - Distribuzione delle terpene sintasi individuate con
l’analisi dell’omologia di sequenze delle sequenze genomiche e
delle EST. Tra parentesi, il primo numero indica i geni candidati
individuati e il secondo quelli selezionati sulla base delle
correlazioni tra espressione genica e accumulo dei singoli aromi
nei fiori e nel corso dello sviluppo dell’acino di “Aleatico”,
“Moscato bianco”, “Sangiovese” e “Vermentino”, e in sospensioni
cellulari di “Cabernet Sauvignon” indotte con elicitori
(D’Onofrio et al., dati non pubblicati).
Fig. 10 - Distribution of terpene synthases identified by analysis of
Vitis genomic and ESTs homology of sequence. In bracket the first
number indicates the number of identified genes and the second
indicate the number of genes selected by analysis of the
correlations among gene expressions and aroma trends in flowers
and during berry development in ‘Aleatico, ‘Moscato bianco’,
‘Sangiovese’ and ‘Vermentino’ and cell suspension of Cabernet
Sauvignon grapevine varieties (D’Onofrio et al., unpublished).
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
geranil-pirofosfato (GPP), precursore dei monoterpeni, farnesil-pirofosfato (FPP), precursore dei sesquiterpeni, e geranilgeranil-pirofosfato (GGPP) dalla cui
ulteriore condensazione si forma il tetraterpene licopene, precursore dei carotenoidi da cui poi derivano i
C13-norisoprenoidi. Al momento nessuna isopreniltrasferasi è stata individuata e caratterizzata nella vite.
La conversione dei prenil-pirofosfati nei prodotti
finali avviene per azione di una grande famiglia di
enzimi conosciuti come terpene sintasi, e successive
reazioni di ossidazione, deidrogenazione, metilazione,
acilazione e glicosilazione (Duradeva et al., 2004).
Grazie all’ampio sequenziamento delle sequenze
espresse e al sequenziamento completo del genoma,
nella vite sono state individuate 71 terpene sintasi, il
più ampio gruppo di terpene sintasi fin ora individuato in una singola specie (D’Onofrio et al., 2010a;
Martin et al., 2010), distribuite nelle sottofamiglie a,
b, c, e, f, g di terpene sintasi delle piante (fig. 10). Tra
queste, il gruppo di ricerca in biologia molecolare del
Laboratorio di Ricerche Viticole ed Enologico del
Dipartimento di Coltivazione e Difesa delle Specie
Legnose dell’Università di Pisa, analizzando le correlazioni tra l’accumulo degli aromi e l’analisi dell’espressione genica nei fiori e nel corso dello sviluppo
dell’acino di Aleatico e Moscato bianco (vitigni ad
uve aromatiche), Sangiovese e Vermentino (vitigni ad
uve neutre) (D’Onofrio et al., 2008; 2010a) e in
sospensioni cellulari di Cabernet Sauvignon indotte
con elicitori (D’Onofrio et al., 2006; 2009a), ne sono
state selezionate 26 su cui è stata concentrata la successiva fase di caratterizzazione funzionale. Tra le
putative sesquiterpene sintasi individuate la maggior
parte ha presentato un picco di espressione nei boccioli fiorali mentre una sola ha mostrato un picco d’espressione nei fiori aperti con un pattern d’espressione
che ben correla con la produzione di α-farnesene (fig.
11A). La regione codificante è stata clonata in cellule
di E. coli BL21 ed il saggio enzimatico della proteina
ricombinante utilizzando come substrato il farnesilpirofosfato, precursore generale dei sesquiterpeni,
confermando che questo gene è effettivamente una αfarnesene sintasi di Vitis vinifera (D’Onofrio et al.,
2010a; Martin et al., 2010). In riferimento alla biosintesi dei monoterpeni, l’attività è stata focalizzata su
alcune putative linalolo e geraniolo sintasi. In
Aleatico e Moscato bianco è stato osservato un picco
di linalolo libero durante la maturazione dell’acino,
oltre a quello presente nei fiori, e tra le putative linalolo sintasi analizzate la maggioranza hanno presentato un picco d’espressione solo nei boccioli fiorali,
mentre solo una ha mostrato un pattern d’espressione
con un picco anche nel corso della maturazione che
Fig. 11 - Correlazioni tra espressione genica e accumulo dei
singoli aromi nei fiori e nel corso dello sviluppo dell’acino. A)
Correlazione tra α-farnesene e la sesquiterpene sintasi VvTSseq_2
in fiori (aperti e chiusi) e acini di “Moscato bianco”; B)
Correlazione tra linalolo libero e la linalolo sintasi VvTSm_2 in
acini di “Aleatico”; C) Correlazione tra trans-piran-linalol-ossido
libero e espressione genica della putativa piran-linalol-epossidasi
VvCytP450_1 in acini di “Moscato bianco”. Lettere differenti
indicano valori di espressione genica statisticamente differenti per
P ≤ 0,05 (da D’Onofrio et al., 2010a, modificato).
Fig. 11 - Correlations among gene expressions and aroma trends
in flowers and during berry development. A) Correlation between
α-farnesene levels and the expression of the putative Vitis vinifera
sesquiterpene synthase gene (VvTSseq_2) in flowers (bud flowers
and open flowers) and berries of ‘Moscato bianco’; B)
Correlation between free linalool levels and the expression of the
putative linalool synthase gene VvTSm_2 in berries of ‘Aleatico’;
B) Correlation between free trans-pyran-linalool oxide
concentration and the expression of a putative Vitis vinifera transpyran-linalool-epoxidase gene (VvCytP450_1) in berries of
‘Moscato bianco’. Different letters indicate statistically different
values (P ≤ 0.05) according to Tukey’s test for gene expression
level (from D’Onofrio et al., 2010a, modified).
49
D’Onofrio
correla con l’accumulo di linalolo libero (fig. 11B).
Nelle uve molto importanti sono anche gli ossidi furanici e piranici del linalolo (Di Stefano et al., 1996b)
derivanti dal linalolo per azione di specifiche epossidasi che potrebbero essere dei citocromi P450.
Attraverso l’analisi della correlazione tra l’accumulo
degli aromi nei fiori e nel corso dello sviluppo dell’acino e l’espressione genica, sono state selezionate due
putative linalolo epossidasi di cui una presenta un
picco di espressione nei fiori chiusi e l’altra un picco
di espressione nel corso della maturazione in corrispondenza con la massima concentrazione degli ossidi
del linalolo in Moscato bianco (fig. 11C), Aleatico e
Sangiovese (D’Onofrio et al., 2010a).
C13-norisoprenoidi
I norisoprenoidi, conosciuti anche come apocarotenoidi, derivano dalla degradazione ossidativa dei
carotenoidi e nelle uve predominano quelli a 13
atomi di carbonio (C13-norisoprenoidi) che conferiscono note aromatiche floreali e fruttate ai vini sia
rossi che bianchi.
Chimicamente i C13-norisoprenoidi vengono suddivisi in due gruppi principali: i megastigmani e i non
megastigmani. I megastigmani sono C13-norisoprenoidi ossigenati sul carbonio 7 (serie damascone) o sul
carbonio 9 (serie ionone). Questo gruppo è costituito
da un numero considerevole di composti volatili, tra
cui quelli più importanti per gli aromi dei vini sono il
β-damascenone e il β-ionone. Il β-damascenone è
dotato di soglia olfattiva particolarmente bassa (2
ng/L) e possiede un complesso odore di fiori, frutti
Fig. 12 - Cambiamento delle concentrazioni di carotenoidi e C13norisoprenoidi nel corso dello sviluppo dell’acino di Moscato
(modificata da Baumes et al., 2002).
Fig. 12 - Change in the levels of carotenoids and C13norisoprenoid glycoconjugates during the maturation of Muscat
berries (from Baumes et al., 2002, modified).
50
esotici, composta di mele e miele; il β-ionone possiede un odore caratteristico di violetta e al pari del βdamascenone ha una soglia olfattiva bassa (7 ng/L)
(Loscos et al., 2007). Altri composti appartenenti a
questo gruppo sono: 3-idrossi-β-damascone (a nota
aromatica di tè e tabacco), β-damascone (fruttato e
tabacco), 3-oxo-α-ionolo (tabacco). Tra i norisoprenoidi non megastigmani i più importanti sono il TDN
(1,1,6-trimetil-1,2-diidronaftalene) che svolge un
ruolo essenziale nella formazione della nota aromatica
di cherosene dei vini riesling invecchiati, e gli actinidoli, che possiedono un odore di canfora. I C13norisoprenoidi si trovano nelle uve essenzialmente
come arabinosilglucosidi e ramnosilglucosidi
(Cabrita et al., 2006).
Nell’acino i carotenoidi, precursori dei norisoprenoidi, sono presenti principalmente nella buccia a
concentrazioni 2-3 volte superiori a quelle della
polpa, e generalmente sono assenti nel mosto e nei
vini anche se sono stati ritrovati in alcuni passiti Porto
(Guedes de Pinho et al., 2004). I carotenoidi sono sintetizzati a partire dall’allegagione, aumentando di
concentrazione fino alla fine della fase erbacea per
poi essere degradati a C13-norisoprenoidi glicosilati
nel corso della maturazione (fig. 12) (Baumes et al.,
2002; D’Onofrio et al., 2010b), ed è stato dimostrato
che vi è una correlazione diretta tra la differenza in
concentrazione dei carotenoidi nelle uve all’invaiatura
e alla maturazione e il contenuto in C13-norisoprenoidi
dei vini (Crupi et al., 2010). La possibilità di incrementare la presenza di C13-norisoprenoidi nell’acino
d’uva è dunque legata, almeno in via teorica, da una
parte all’incremento del substrato nei tessuti della
bacca, ovvero dei carotenoidi, e dall’altra all’aumento
della specifica attività di trasformazione dei carotenoidi in norisoprenoidi.
La biosintesi dei carotenoidi e dei rispettivi C13norisoprenoidi dipende molto dai fattori climatici e
colturali (Bureau et al., 1998). L’illuminazione favorisce la biosintesi dei carotenoidi dall’allegagione alla
fine della fase erbacea (Bureau et al., 1998) e poi,
dalla scomparsa della clorofilla, ne favorisce la loro
degradazione e trasformazione in C13-norisoprenoidi
nel corso della maturazione (Hardie et al., 1996;
D’Onofrio et al., 2010b). Nello specifico, una serie di
prove effettuate su Sangiovese coltivato in diversi siti,
Ciliegiolo e Moscato bianco, hanno evidenziato che
l’asportazione precoce delle foglie dalla zona dei
grappoli effettuata in pre-fioritura o all’allegagione
stimola la biosintesi dei carotenoidi nel corso della
fase erbacea dell’acino e ne favorisce poi la successiva degradazione (fig. 13) (D’Onofrio et al., 2010b)
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
Fig. 13 - Contenuto in xantofille, luteina e β-carotene, delle uve di
Moscato bianco nel vigneto di Benazzo Casa nel 2008.
CTRL_PreINV: acini del controllo non defogliato prelevati in
pre-invaiatura; CTRL_VEN: acini del controllo non defogliato
prelevati alla vendemmia; DEF.PostBL._PreINV: acini del
defogliato in post-fioritura prelevati in pre-invaiatura;
DEF.PostBL._VEN: acini del defogliato in post-fioritura prelevati
alla vendemmia. I valori sopra gli istogrammi indicano le
variazioni percentuali rispetto al CTRL_PreINV per CTRL_VEN
e DEF.PostBL._PreINV e rispetto al DEF.PostBL._PreINV per
DEF.PostBL._VEN (da D’Onofrio et al., 2010b).
Fig. 13 - Xanthophylles, lutein and β-carotene in Moscato bianco
2008 berries of Benazzo Casa vineyard. CTRL_PreINV: preverason berries of non defoliated vines; CTRL_PreINV: vintage
berries of non defoliated vines; CTRL_VEN: pre-verason berries
of non defoliated vines; DEF.PostBL._PreINV: pre-verason
berries of vines defoliated at post-bloom; DEF.PostBL._VEN:
vintage berries of vines defoliated at post-bloom. The values on
bars indicate the variation in percentage compared to
CTRL_PreINV for CTRL_VEN and DEF.PostBL._PreINV and
compared to DEF.PostBL._PreINV for DEF.PostBL._VEN
(from D’Onofrio et al., 2010b).
Fig. 14 - Contenuto in monoterpeni, C13-norisoprenoidi e totale
(monoterpeni+C13-norisoprenoidi) delle 6 prove di defogliazione
precoce (pre e post-fioritura) delle uve di Sangiovese, Ciliegiolo e
Moscato bianco. CTRL: controllo non defogliato; DEF.Pre or
PostBL.: defogliato in pre o post-fioritura; DEF.INV.: defogliato
all’invaiatura. In A i valori sopra gli istogrammi indicano le
variazioni percentuali medie dei monoterpeni e C13-norisoprenoidi
rispetto al CTRL, mentre in B indicano le variazioni percentuali
del peso dell’acino rispetto al controllo.
(da D’Onofrio et al., 2010b, modificata).
Fig. 14 - Monoterpenes, C13-norisoprenoids and total
(monoterpenes+C13-norisoprenoids) of grapes of early defoliation
(pre and post-bloom) treatments. CTRL: non-defoliated; DEF.Pre
or PostBL.: defoliated at pre or post-bloom; DEF.INV: defoliated
at veraison. In A the values on bars indicate the mean variation in
percentage of aroma compared to CTRL while in B indicate the
variation in percentage of berry weight compared to CTRL
(from D’Onofrio et al., 2010b, modified).
Fig. 15 - Origine dei norisoprenoidi per degradazione dei
carotenoidi.
Fig. 15 - C13-norisopernoids origin from cleavage of carotenoids.
traducendosi in una maggiore produzione di C13-norisoprenoidi fino a farla più che raddoppiare (fig. 14)
(D’Onofrio et al., 2010b). Anche la defogliazione
effettuata in Riesling nel corso della fase erbacea ha
stimolato la biosintesi dei carotenoidi nell’acino e il
conseguente accumulo di C 13 -norisoprenoidi
(Kwasniewski et al., 2010).
Caratterizzazione funzionale delle vie biosintetiche
I carotenoidi precursori dei norisoprenoidi sono: βcarotene e luteina, presenti nelle uve a concentrazioni
di mg/kg (rappresentando l’85% dei carotenoidi totali),
e le xantofille neoxantina, violaxantina, luteo-xantina,
flavoxantina, zeaxantina, lutein-5,6-epossido presenti
nelle uve in concentrazioni di μg/kg (Bureau et al.,
1998; Mendes-Pinto, 2009). I carotenoidi sono sintetizzati nel plastidio a partire dal licopene, un tretraterpene
prodotto nella via biosintetica del MEP (fig. 8), per
azione di ciclasi che formano l’α-carotene e il β-carotene, dai quali per successive reazioni di idrossilazione e
di epossidazione si formano le xantofille.
La biosintesi dei C13-norisoprenoidi per degradazione ossidativa dei carotenoidi avviene attraverso tre
fasi consecutive: nella prima i carotenoidi vengono
trasformati dalle ossidasi in carbonili di C13-norisoprenoidi, che hanno lo scheletro ossidato dei corrispettivi carotenoidi; nella seconda fase il grado di
ossidazione dei composti ottenuti in quella precedente
viene modificato dall’intervento di ossidasi e riduttasi; nella terza fase avviene la glicosilazione, tramite
glicosiltransferasi, di quei composti norisoprenoidi
aventi un gruppo ossidrilico (fig. 15) (Baumes et al.,
2002). Sebbene la formazione dei norisoprenoidi può
avvenire per via chimica e fotochimica (MendesPinto, 2009), la prevalenza dei C 13-norisoprenoidi
nelle uve suggerisce soprattutto una degradazione di
51
D’Onofrio
tipo enzimatico. A tale proposito, nella bacca di vite è
stato individuato un enzima specifico, detto carotenoide diossigenasi 1 (VvCCD1: Vitis vinifera carotenoid
cleavage dioxygenase 1), responsabile della degradazione ossidativa dei carotenoidi e quindi della formazione dei C13-norisoprenoidi (Mathieu et al., 2005).
D’altra parte, mentre lo β-ionone deriva direttamente
dalla degradazione del β-carotene e α-carotene, la formazione di β-damascenone, TDN, TPB e vitispirani
comprende successive reazioni chimiche spontanee
con intermediari chetonici.
Derivati della via biosintetica dello scichimato
I derivati della via biosintetica dello scichimato
che concorrono a definire l’aroma varietale sono
anche detti derivati del benzene o benzenoidi. Alcuni
di essi conferiscono gradevoli note speziate, agrumate
e floreali, mentre altri se presenti in concentrazioni
elevate apportano sgradevoli odori di farmaceutico,
fenolico e sintetico (Tomasi et al., 2007). Su questa
classe di composti aromatici sono stati effettuati pochi
studi e di conseguenza non si hanno molte informazioni a disposizione.
Nell’uva i benzenoidi più frequenti e in quantità
maggiori sono: alcol benzilico, 2-fenil etanolo, alcol
omovanillico, diidroconiferil alcol e 4-vinil guaiacolo
(Di Stefano et al., 1998; Lanati et al., 2000; Cabrita et
al., 2006; Pinna et al., 2009), mentre quelli più importanti per il loro impatto aromatico sono alcol benzilico, vanillina, metil-vanillato, acetovanillone, alcol
omovanillico, diidroconiferil alcol e zingerone.
Alcuni benzenoidi, quali alcol benzilico, vanillina e 4vinil guaiacolo, esistono nell’uva sia in forma libera
che legata, solitamente con prevalenza di quest’ultima, altri, quali metil-benzoato, zingerone e alcol diidroconiferilico, esistono solo in forma legata (Di
Stefano et al., 1998; Cabrita et al., 2006; Pinna et al.,
2009). Il profilo di questa classe di molecole aromatiche varia molto in funzione del vitigno.
In riferimento all’evoluzione dei benzenoidi
durante le fasi di sviluppo dell’acino sono ancora
pochissime le informazioni disponibili in letteratura.
Da un recente studio condotto sul Cabernet Sauvignon
è emerso che i benzenoidi compaiono solo dopo l’invaiatura e subiscono un significativo incremento nell’ultima fase della maturazione (Kaula e Boss, 2009).
Al contrario, in un altro studio, condotto sulla
Malvasia di Cagliari, considerando solo la fase di
maturazione dell’uva è stato osservato che questi
composti sono presenti quasi esclusivamente come
glicosidi e tendono a diminuire (Pinna et al., 2009).
Negli acini di Moscato bianco, Sangiovese,
Ciliegiolo, Vermentino e Aleatico tali composti
52
aumentano nel corso della maturazione (D’Onofrio et
al., 2010a, b, c).
Caratterizzazione funzionale delle vie biosintetiche
La fenilalanina è l’intermediario comune per la
biosintesi dei benzenoidi (Dudareva et al., 2006) e
deriva dal corismato proveniente dallo scichimato formatosi dall’eritroso-4-fosfato e fosfoenolpiruvato (dal
corismato si formano direttamente anche l’acido pidrossibenzoico, l’acido p-aminobenzoico, metil-salicilato). La fenilalanina è convertita in acido cinnamico da cui derivano l’acido p-cumarico, l’acido caffeico, ferulico e sinapico, che possono poi essere trasformati in esteri metilici. È stato dimostrato che l’eugenolo e l’isoeugenolo derivano dal coniferil-acetato
proveniente dall’acido ferulico (Koeduka et al.,
2006). Gli altri benzenoidi derivano dagli esteri dei
suddetti acidi attivati con il CoA, che vengono ridotti
per formare le aldeidi e gli alcoli. I benzenoidi si possono anche generare per degradazione dall’acido cinnamico attraverso la perdita di 2 atomi di carbonio
dalla catena laterale. Sebbene le vie biosintetiche dei
benzenoidi sopra menzionate non sono state direttamente studiate nella vite, si può presupporre che siano
attive come nelle altre piante.
Tioli
I composti solforati di tipo tiolico (mercapatani)
contribuiscono alla definizione degli aromi di vari
prodotti alimentari, tra cui il vino, nel quale sono
responsabili di una grande varietà di note e sfumature
aromatiche (es. gemma di cassis, bosso, pompelmo,
frutto della passione) ma, in funzione della concentrazione che può variare dall’ordine di ng/L a mg/L,
anche di alcuni odori indesiderati.
I tioli che si ritrovano nel vino derivano principalmente dalle uve, anche se alcuni sono prodotti dal
metabolismo dei lieviti. I principali tioli volatili sono:
• 4-sulfanil-4-metilpentan-2-one o 4-mercapto-4metil-pentan-2-one (4-MMP); è la prima molecola
scoperta come composto caratteristico dell’aroma
di Sauvignon blanc e possiede uno spiccato odore
di bosso e di ginestra ed è estremamente odoroso,
la sua soglia di percezione nei vini è di 3 ng/L e,
poiché il suo tenore va da diverse decine ad un
centinaio di ng/L, il suo impatto sensoriale nei vini
Sauvignon è rilevante;
• 3-sulfanilesan-1-ol o 3-mercaptoesan-1-olo (3MH); il cui aroma ricorda quello del pompelmo e
del frutto della passione, ha una soglia olfattiva di
60 ng/L e nel Sauvignon risulta essere molto odoroso dato che è presente a concentrazioni di diverse centinaia di ng/L;
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
• 4-sulfanil-4-metilpentan-2-ol o 4-mercapto-4metilpentan-2-olo (4-MMPOH); ha un odore di
buccia di agrumi e il suo ruolo sensoriale è più
limitato poiché il tenore nei vini raramente supera
la sua soglia di percezione (55 ng/L);
• 3-sulfanilesil-O-acetato o 3-mercaptoesan-1-olo
acetato (3-MHA); ha un aroma complesso che
evoca il bosso, la scorza di pompelmo e il frutto
della passione, la sua soglia di percezione è di 4
ng/L e in certi vini di Sauvignon se ne trovano
anche alcune centinaia di ng/L, questo composto
viene sintetizzato soprattutto per azione di un’esterasi dei lieviti attraverso l’acetilazione del 3-MH.
Altri tioli sono: 3-sulfanil-3-metilbutan-1-ol
(3MMB; porro cotto), 3-metilltiopropan-1-ol (3MMP;
patate, cavolfiore), dimetilsolfuro (ribes nero, cavolo,
zolfo, benzina, asparago cotto, mais, pomodoro), 2furan-metanotiolo (caffè tostato, carne, pane, popcorn), 2-metil-3-furantiolo (carne), benziltiolo
(gomma). È stato evidenziato che spesso gli enantiomeri di questi composti possono presentare differenti
soglie olfattive e possono essere differentemente presenti nei vari vitigni (Tominaga e Dubordieu, 2006)
I tioli non sono presenti nell’uva esclusivamente
come precursori inodori S-coniugati della cisteina o
del glutatione (Tomiaga et al, 1998; Fedrizzi et al.,
2009) e sono distribuiti in maniera non uniforme nell’acino: nel Sauvignon i precursori cisteinil del 4MMP e del suo alcol 4-MMPOH sono presenti per il
20% nella buccia e per l’80% nella polpa, mentre
quello del 3-MH è equamente distribuito tra buccia e
polpa (Peyrot de Gachons et al., 2000).
Nel corso della maturazione dell’uva, la comparsa
del precursore del 4-MMP precede quella del 3-MH,
dinamica dalla quale dipendono le sfumature di bosso
più marcate del Sauvignon se la vendemmia è effettuata precocemente, e sentori più fruttati se la vendemmia
è tardiva. Recentemente è stato evidenziato che alcuni
tioli coniugati alla cisteina e al glutatione aumentano
di concentrazione soprattutto nel corso dell’ultima fase
della maturazione (fig. 16) (Capone et al., 2011).
Analizzando l’accumulo dei tioli coniugati in diversi
tessuti della varietà aromatica Koshu è stato rilevato
che questi composti sono scarsamente presenti nei
vinaccioli e nel fusto, mentre nelle foglie sono più
abbondanti che nell’acino; in questi ultimi cominciano
ad accumularsi a partire da 11 settimane dalla fioritura
raggiungendo un picco a 16-18 settimane per poi diminuire di concentrazione (Kobayashi et al., 2010). Nella
varietà aromatica Koshu, l’accumulo dei tioli coniugati
nel corso dello sviluppo dell’acino è risultato essere
più rapido in vigneti di bassa altitudine rispetto a quelli
Fig. 16 - Concentrazione del precursore del 3-MH (μg/kg) nel corso della maturazione di cloni di Sauvignon blanc coltivati nell’Adelaide
Hills. Le barre impilate rappresentano la media di tre repliche. La deviazione standard delle tre repliche era minore del 15%. Inserto:
espansione delle prime tre fasi fenologiche di campionamento (modificata da Capone et al., 2011).
Fig. 16 - Concentrations of 3-MH precursor diastereomers (μg/kg) during ripening for five Sauvignon blanc clones colocated in an
Adelaide Hills vineyard. The stacked bars represent the mean of each precursor diastereomer derived from three replicates. The relative
standard deviations for the averages were < 15% (Inset) Expansion of the first three time points.(from Capone et al., 2011, modified).
53
D’Onofrio
Fig. 17 - Ipotetica via biosintetica di 3-MH-S-glut e 3-MH-S-cyt
in viti esposte a condizioni di stress (da Kobayashi et al., 2011).
Fig. 17 - Hypothetical pathway for the biosynthesis of 3MH-S-glut
and 3MH-S-cys in grapevine exposed to environmental stress
conditions (from Kobayashi et al., 2011).
collocati ad altitudini maggiori (Kobayashi et al.,
2010), inoltre nelle varietà Koshu, Chardonnay e
Merlot, le infezioni di botrite, gli stress idrici e in particolare le radiazioni ultraviolette hanno stimolano la
biosintesi del glutatione e di 3-MH coniugato al glutatione o alla cisteina (Kobayashi et al., 2011). È anche
stato riportato che le infezioni di botrite stimolato la
biosintesi dei tioli in sospensioni cellulari trattate inoculate con botrite (Thibon et al., 2011).
Inoltre, alcune indagini hanno evidenziato che il
deficit idrico moderato, soprattutto se si verifica appena
dopo l’invaiatura, induce un aumento della concentrazione dei tioli, particolarmente marcato se accompagnati da temperature non troppo elevate (Choné, 2001).
Una adeguata concimazione azotata del vigneto favorisce la biosintesi dei tioli e quindi l’espressione aromatica delle uve Sauvignon (Choné, 2001). L’applicazione
di formulati a base di rame sulle viti di Sauvignon e di
Cabernet Sauvignon induce una netta diminuzione dell’aroma dei vini a causa della reattività di questo elemento con i tioli (Darriet et al., 2001).
Caratterizzazione funzionale delle vie biosintetiche
La produzione dei tioli che si ritrovano nel vino
può avvenire attraverso diversi meccanismi, alcuni dei
quali dipendono dal metabolismo dei lieviti nel corso
della fermentazione. I tioli coniugati alla L-cisteina o
al glutatione (un tripeptide formato da acido glutammico cisteina e glicina) si formano nell’uva per via
54
enzimatica e vengono poi degradati, liberando l’aglicone odoroso, nel corso della fermentazione grazie
alla β-liasi dei lieviti. Nelle uve la via biosintetica che
conduce alla formazione dei tioli coniugati non è
ancora nota. Vi sono alcune evidenze che indicherebbero una probabile origine di alcuni precursori di tioli
da aldeidi insaturi a 6 atomi di carbonio o da alcoli
prodotti per azione di lipossigenasi da acidi grassi, ai
quali l’addizione del glutatione avverrebbe per azione
di glutatione trasferasi. Questi composti coniugati
verrebbero poi trasportati nel vacuolo dove avverrebbe la rimozione dei gruppi glutammici e di glicina,
rispettivamente per azione di γ-glutamil-transpeptidasi e di peptidasi, per formare i composti coniugati alla
cisteina (Ohkama-Ohtsu et al., 2007). Recentemente,
analizzando la correlazione tra accumulo dei tioli
coniugati e l’espressione genica in differenti vitigni
(Chardonnay, Koshu e Merlot) sottoposti a vari tipi di
stress (raggi ultravioletti, stress idrico, shock ad alte e
basse temperature, inoculo con botrite) è stata proposta una specifica via biosintetica e di questa sono state
individuate e funzionalmente caratterizzate 2 glutatione-S-transferasi (VvGST3 e VvGST4) (fig. 17), ipotizzando, inoltre, che la produzione enzimatica degli
aromi tiolici possa essere il risultato dell’azione di
detossificazione delle cellule danneggiate da condizioni di stress (Kobayashi et al., 2011).
Metossipirazine
Le metossipirazine sono composti eterociclici azotati, provenienti dal metabolismo degli amminoacidi.
Esse sono state identificate in vari vegetali, tra cui
peperone, asparago e pisello, e nelle uve sono soprattutto tipiche dei vitigni bordolesi, tra cui in particolarmente Semillon, Sauvignon blanc, Merlot, Cabernet
Sauvignon e Cabernet Franc. L’aroma delle metossipirazine richiama note vegetali o verdi (peperone
verde, pisello, asparago) associate al frutto immaturo
e spesso poco gradite dal consumatore. In alcune
regioni viticole la nota di peperone verde, associata
alla presenza di metossipirazine, è considerata un fattore di tipicità dei vini di Cabernet Sauvignon, mentre
in altre denota una mancanza di maturità quando
eccessiva.
Le principali metossipirazine identificate nelle uve
sono:
• 2-metossi-3-isobutilpirazina (IBMP), con tipiche
note di peperone verde;
• 2-metossi-3-isopropilpirazina (IPMP), che conferisce note di asparago e pisello dolce;
• 2-metossi-3-sec-butilpirazine (SBMP), responsabile della nota di olio di galbano.
La soglia olfattiva di questi composti è di pochi
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
ng/L, per cui sono sufficienti minime quantità a renderle percettibili. L’IBMP è generalmente la più
abbondante nelle uve e nei vini, dove ha una soglia di
percezione di 10-15 ng/L e spesso raggiunge concentrazioni di circa 50 ng/L che la rendono sgradevole
(Belancic e Agosin, 2007). L’IBMP ha una soglia di
percezione di circa 2 ng/L, ma spesso nei vini non
raggiunge questi livelli di concentrazione, e lo stesso
vale per SBMP. Altre pirazine sono state identificate
nelle uve e nei vini, quali la 2-metossi-3-metilpirazina
e 2-metossi-3-etilpirazina, ma sono entrambe poco
odorose.
Nell’acino le metossipirazine sono localizzate
essenzialmente nella buccia (Roujou De Boubée et
al., 2000) e la concentrazione aumenta progressivamente nel corso della fase erbacea fino a raggiungere
il massimo intorno o poco prima dell’invaiatura per
poi decrescere progressivamente (Ryona et al., 2008;
Kalua e Boss, 2008). In genere, la degradazione
delle metossipirazine nel corso della maturazione
dell’uva è inizialmente rapida per poi rallentare in
prossimità della raccolta, ed è fortemente influenzata
dall’andamento climatico. Alcuni lavori hanno evidenziato un forte effetto del terroir e dell’andamento
climatico sia sulla degradazione delle pirazine, ma
soprattutto sulla loro sintesi nel corso della fase
erbacea. Tra i fattori climatici che possono contribuire all’accumulo e degradazione delle metossipirazine, la radiazione luminosa è uno dei più importanti. Secondo alcuni autori, la radiazione solare stimolerebbe l’accumulo nel corso della fase erbacea
(Hashizume e Samuta, 1999), mentre secondo altri
ne ridurrebbe la concentrazione (Ryona et al., 2008;
Robinson et al., 2011). Altri autori sostengono che
durante la maturazione la radiazione solare favorirebbe la degradazione delle metossipirazine (Kalua e
Boss, 2008) e secondo altri invece la diminuzione
della loro concentrazione in maturazione è da imputare esclusivamente all’effetto diluizione (fig. 18)
(Ryona et al., 2008). In Cabernet Sauvignon e
Merlot è stato rilevato un decremento della concertazione di IBMP nelle uve conseguente alla rimozione
precoce delle foglie nella zona dei grappoli
(Scheiner et al., 2010) ed è stato ipotizzato che nel
corso della maturazione l’IBMP diminuisce perché
viene demetilata e ritrasformata nel suo immediato
precursore, il 3-isobutil-2-idrossipirazina (Ryona et
al., 2010). Le basse temperature favoriscono l’accumulo delle metossipirazine nelle uve (Belancic e
Agosin, 2007) e la concentrazione di questi composti
nelle uve è anche influenzata dal vigore, carico produttivo e disponibilità idrica (Roujou de Boubee et
al., 2000; Chapman et al., 2004).
Fig. 18 - Concentrazione dell’IBMP in uve in ombra (●) o esposte
alla luce (○) nel corso della stagione vegetativa. Le barre indicano
l’errore standard delle tre repliche (tre piante per trattamento). Le
differenze statistiche tra i trattamenti sono state valutate con il t
test (** p ≤ 0,05; * p ≤ 0,08; ns, non significativo). (modificata da
Ryona et al., 2008).
Fig. 18 - IBMP concentrations of shaded (●) and exposed berries
(○) during the growing season. The error bars reflect standard
error for the three replicates (three vines per treatment).
Significant differences between treatments were evaluated by a
paired t test (**, p ≤ 0.05; *, p ≤ 0.08; ns, not significant).
(modified from Ryona et al., 2008).
Caratterizzazione funzionale delle vie biosintetiche
Per la biosintesi delle metossipirazine sono state
proposte diverse vie biosintetiche che coinvolgono
amminoacidi e gruppi 1,2-dicarbonilici. Gli amminoacidi valina, leucina e isoleucina sono rispettivamente i
precursori di IPMP, IBMP e SBMP. Questi amminoacidi, attraverso un meccanismo non ancora noto, originano gli intermediari 3-alchil-2-idrossipirazine (HP)
che vengono poi metilati a metossipirazine attraverso
l’azione di metiltransferasi. Analizzando la correlazione tra accumulo di metossipirazine ed espressione
genica nel corso dello sviluppo dell’acino di Cabernet
Sauvignon sono stati proposti gli schemi per la biosintesi della IBMP e IPMP (fig. 19) e funzionalmente
caratterizzate le due O-metil-transferasi (rispettiva-
Fig. 19 - Ipotetico schema biosintetico dell’IPMP (2-metossi-3isopropilpirazina) e IBMP (2-metossi-3-isobutilpirazina)
rispettivamente dagli amminoacidi valina e leucina. La reazione
finale di metilazione delle idrossipirazine in metossipirazine è
catalizzata da una OMT (O-metil-transferasi).
(modificata da Dunlevy et al., 2010).
Fig. 19 - Proposed pathway for the biosynthesis of 3-isopropyl-2methoxypyrazine (IPMP) and 3-isobutyl-2-methoxypyrazine
(IBMP) from the amino acids valine and leucine, respectively. The
final step involving methylation of hydroxypyrazine to
methoxypyrazine is catalysed by an OMT.
(modified from Dunlevy et al., 2010).
55
D’Onofrio
mente VvOMT1 e VvOMT2) che ne catalizzano la
metilazione finale (fig. 20; Dunlevy et al., 2010).
Alcoli e aldeidi alifatici a 6 atomi di carbonio
Le aldeidi e gli alcoli a sei atomi di carbonio (C6),
insieme alle metossipirazine, sono i composti responsabili dell’aroma erbaceo. A bassa concentrazione
(indicativamente inferiore a 0,5 mg/L) queste molecole concorrono positivamente all’aroma complessivo
del vino, ma a dosi più elevate forniscono note organolettiche poco gradite di tipo erbaceo, di frutta acerba, di foglia stropicciata e talvolta di amaro.
Gli alcoli C6 più frequentemente trovati nell’uva
sono l’esanolo ed alcuni suoi isomeri, quali il cis-3esenolo ed il trans-2-esenolo. Essi possono essere presenti sia in forma libera che in forma legata glicosidica (Cabrita et al., 2006; Di Stefano et al., 1998;
Lanati et al., 2000; Pinna et al., 2009): nella Malvasia
di Casorzo e Malvasia di Schierano gli alcoli C6 sono
stati identificati solo come aromi liberi, mentre nella
Malvasia aromatica di Candia sono presenti sia come
aromi liberi che glicosilati, con prevalenza dei primi
(Borsa et al., 2008). Per quanto riguarda le aldeidi C6,
quelle individuate nell’uva sono esanale, trans-2-esenale, eptanale e trans-2-eptenale (Kalua e Boss,
2009). Aldeidi e esteri rappresentano i maggiori componenti volatili nelle uve mature di Riesling, mentre
nel Cabernet Sauvignon prevalgono gli alcoli (Kalua e
Boss, 2010). Analizzando l’evoluzione dei composti
volatili C6 durante lo sviluppo dell’acino in Cabernet
Sauvignon è emerso che gli esteri raggiungono la
loro massima concentrazione nel corso della fase
erbacea per poi diminuire nel corso della maturazione fino a raggiungere quantità irrilevanti. Mentre, le
aldeidi subiscono un significativo incremento durante
la maturazione seguito da un decremento verso la
fine di questa fase. Gli alcoli sono anch’essi sempre
presenti per tutto l’accrescimento dell’acino, ma raggiungono quantità significative solo verso la fine
della maturazione (Kalua e Boss, 2009). Nel corso
della maturazione il maggiore aumento della concentrazione degli alcoli a scapito di quella degli aldeidi
rappresenta un aspetto positivo poiché, avendo gli
alcoli una soglia di percezione molto maggiore
rispetto a quella delle aldeidi, risulta meno evidente
la nota erbacea. Inoltre, gli alcoli C6 durante la vinificazione, in presenza di acidi carbossilici, sono maggiormente suscettibili di essere trasformati in esteri,
che possiedono gradevoli note fruttate. Recentemente
è stato evidenziato che nel vitigno Marechal Foch,
coltivato in prossimità del lago di Seneca nel Penn
Yan (NY), la vendemmia tardiva e la cimatura riducono la concentrazione degli alcoli C6 dal 3% e 33%
(Sun et al., 2011).
Caratterizzazione funzionale delle vie biosintetiche
Le aldeidi e gli alcoli alifatici della vite derivano
dalla via biosintetica delle lipossigenasi, attraverso la
quale gli acidi linoleico e linolenico sono trasformati
in aldeidi a 6 e 9 carboni e ossiacidi a 9 e 12 carboni
Fig. 20 - Concentrazione delle metossipirazine e livelli di espressione delle VvOMT nel corso dello sviluppo dell’acino. A) concentrazione
di IBMP e IPMP espresse in ng/kg di peso fresco degli acini, tr: presenza di tracce; nd: non rilevato. B) Espressione relativa di VvOMT1 e
VvOMT2 in acini determinata per mezzo di PCR real-time ed espressa come numero di copie (modificata da Dunlevy et al., 2010).
Fig. 20 - MP levels and VvOMT gene expression in whole berries throughout development. A) IBMP and IPMP concentrations, expressed
as ng/kg of fresh weight, in developing grape berries, tr signifies that only trace levels were detected and nd signifies not detectable. B)
Relative expression of VvOMT1 and VvOMT2, expressed as copy number, in the berry samples as quantified by Real-Time PCR
(modified from Dunlevy et al., 2010).
56
Biosintesi e qualità degli aromi delle uve
(fig. 21) (Kalua e Boss, 2009). Gli acidi grassi liberati
dalle acil-idrolasi (che includono lipasi, fosfolipasi e
galactolipasi) sono ossidati per azione delle lipossigenasi formando idroperossidi che sono poi trasformati
in aldeidi e ossiacidi per azione delle idroperossidi
liasi. Infine le aldeidi sono isomerizzate dalle enolisomerasi e ridotte ad alcoli dalle alcol deidrogenasi.
Nella vite sono state individuate varie alcol deidrogenasi (Torregrosa et al., 2008) la cui espressione ed attività aumenta in condizioni di stress. Analizzando l’accumulo di 2-esenal, 3-esenal e esanal, dei rispettivi
alcoli e esteri acetati nel corso dello sviluppo dell’acino di Cabernet Sauvignon e Riesling, è stato ipotizzato
che: l’attività della alcol-deidrogenasi dopo l’invaiatura è maggiore nelle uve di Cabernet Sauvignon; l’attività dell’idroperossi-liasi è maggiore nelle uve di
Riesling; la enal-isomarasi, responsabile dell’isomerizzazione del Z-3-hesenal in E-2-esenal, sarebbe attiva
principalmente nel corso della maturazione. L’attività
della alcol acil-transferasi è maggiore nelle uve di
Riesling (per cui la maggiore presenza di esteri rende i
vini di Riesling più fruttati rispetto a quelli di Cabernet
Sauvignon) e in entrambi i vitigni si riduce nel corso
della maturazione, e quindi i vini di entrambi questi
vitigni prodotti con uve vendemmiate precocemente
risultano più fruttati (Kalua e Boss, 2010).
Aroma delle specie americane: aroma foxy
I principali vitigni del nord dell’America, Vitis
lambrusca e Vitis rotundifolia e i loro ibridi, sono
molto conosciuti per il loro caratteristico aroma che è
stato definito “volpino” (foxy). Questo termine deriva,
probabilmente, dal tipico odore muschiato di queste
uve, odore che ricorda quello di un animale (forse una
volpe). Il più noto composto responsabile dell’aroma
foxy è l’antranilato di metile, che possiede una particolare fragranza di fruttato. Da studi condotti sulla
cultivar Washington Concord è emerso che la biosintesi dell’antranilato di metile coinvolge una alcol aciltrasferasi che catalizza la formazione di tale composto
da antraniloil-CoA e metanolo. Altri composti che
concorrono nel determinare il caratteristico aroma
foxy sono: 2-ammino acetofenone e il 2 e 3-mercaptopropionato di etile che hanno odore solforato e di frut-
Fig. 21 - Via biosintetica delle lipossigenasi che evidenzia i percorsi comuni della biosintesi nelle uve dei composti volatili a 6 atomi di
carbono (da Kalua e Boss, 2009).
Fig. 21 - Lipoxygenase (LOX) pathway in grape showing the common routes of C6 compound biosynthesis (from Kalua and Boss, 2009).
57
D’Onofrio
tato se presenti a basse concentrazioni; 4-idrossi-2,5dimetil-3-furanone, comunemente denominato furaneolo; 4-metossi-2,5-dimetil-3-furanone detto anche
metossifuraneolo, con caratteristico odore di fragola
tipico della cultivar Isabella o Uva fragola. La maggior parte dei suddetti composti è stata identificata a
basse concentrazioni in alcuni vini di Vitis vinifera
(Moio e Etievant, 1994; Guedes De Pinho, 1994) ed è
stato evidenziato che l’antranilato di metile e quello di
etile sono coinvolti nel determinare il particolare
aroma del Pinot noir della Borgogna. Questi composti
volatili si accumulano nell’acino principalmente nel
corso della fase di maturazione (Shure e Acree, 1994).
Conclusioni
Data l’importanza degli aromi varietali nel determinare le caratteristiche di qualità e tipicità dei vini, e
quindi il potenziale tecnologico dei vitigni, la ricerca
sulla caratterizzazione funzionale della biosintesi
degli aromi nelle uve al fine di poter modulare adeguatamente la qualità aromatica delle stesse sta attirando l’attenzione di molti ricercatori. I recenti progressi nell’ambito della genomica funzionale, congiuntamente al sequenziamento del genoma della vite
e lo sviluppo di nuove tecnologie per l’analisi dell’enorme quantità di composti che concorrono a determinare gli aromi delle uve e dei vini, hanno consentito di
acquisire importanti conoscenze su: a) dinamiche di
accumulo degli aromi nel corso dello sviluppo dell’acino in diversi vitigni; b) dinamiche di espressione dei
geni responsabili della biosintesi di questi composti e
loro conseguente caratterizzazione funzionale; c)
influenza che i vari fattori colturali hanno su questi
importanti processi biosintetici. Particolarmente utile
si è rilevata l’analisi delle correlazioni tra dinamiche
di accumulo degli aromi ed espressione genica nei
fiori e nel corso dello sviluppo dell’acino di Aleatico,
Cabernet Sauvignon, Chardonnay, Koshu, Moscato
bianco, Merlot e Sangiovese, e in sospensioni cellulari
di acino di Cabernet Sauvignon, che ha consentito di
individuare e caratterizzare vari geni coinvolti nelle
vie biosintetiche delle principali classi di aromi delle
uve. Lo studio delle dinamiche biosintetiche degli
aromi nel corso dello sviluppo dell’acino ha permesso, inoltre, di meglio evidenziare gli effetti del sito di
coltivazione, della forma di allevamento, dell’illuminazione, delle temperature, della defogliazione e di
alcuni stress abiotici e biotici, sulla qualità aromatica
delle uve. Tutte queste conoscenze, e quelle che certamente seguiranno nell’immediato futuro, saranno
sicuramente di notevole supporto alla viticoltura per
una adeguata modulazione della qualità aromatica
58
delle uve al fine di poter esaltare ulteriormente e con
costanza le caratteristiche di tipicità dei vini, che, congiuntamente all’approfondita caratterizzazione genotipica dei vitigni, saranno utili per la valorizzazione
delle produzioni viti-vinicole, in generale, e di quelle
di nicchia, in particolare.
Riassunto
Gli aromi delle uve svolgono un ruolo fondamentale nella definizione dei parametri qualitativi e di
tipicità del vino, nel quale sono i composti che maggiormente permettono il riconoscimento del vitigno,
caratteristica molto apprezzata dal consumatore. Nel
vigneto, il controllo della qualità aromatica delle uve
richiede una approfondita conoscenza sulle dinamiche
biosintetiche dei singoli composti che la caratterizzano nonché sui fattori colturali che ne determinano l’espressione. Lo sviluppo delle tecnologie per l’analisi
dell’enorme quantità di composti che concorrono a
determinare gli aromi delle uve e dei vini e i recenti
progressi nell’ambito della genomica funzionale,
hanno consentito di acquisire ampie conoscenze sulle
dinamiche di accumulo degli aromi nel corso dello
sviluppo dell’acino e sulla caratterizzazione funzionale
dei relativi geni, permettendo di individuare le specifiche fasi fenologiche in cui questi composti sono maggiormente sintetizzati. In particolare, l’analisi delle
correlazioni tra dinamiche di accumulo degli aromi ed
espressione genica nel corso dello accrescimento dell’acino ed in sospensioni cellulari trattate con elicitori
ha reso possibile la caratterizzazione funzionale di
geni coinvolti nella biosintesi dei monoterpeni, sesquiterpeni, tioli e metossipirazine, tutti composti di notevole importanza per la determinazione degli aromi
delle uve e dei vini. Questi studi hanno permesso di
approfondire le conoscenze sull’influenza del sito di
coltivazione, del sistema di allevamento, dell’illuminazione, delle temperature, della defogliazione e di stress
abiotici e biotici sulla biosintesi degli aromi nelle uve,
consentendo di acquisire specifiche conoscenze che
saranno di supporto per l’adeguata modulazione della
qualità aromatica al fine di poter ulteriormente esaltare
le caratteristiche di tipicità dei vini.
Parole chiave: accrescimento dell’acino, aromi varietali, GC-MS, geni degli aromi, espressione genica,
precursori d’aroma, SPE, SPME
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