d-ROMs Test

d-ROM s
Test
COD. MC 006
1 x 25 mL
COD. MC 001
1 x 50 mL
COD. MC 002
2 x 50 mL
COD. MC 003
4 x 50 mL
Brevetto: DIACRON INTERNATIONAL S.a.S. Grosseto (Italia)
DETERMINAZIONE COLORIMETRICA DEI METABOLITI REATTIVI DELL'OSSIGENO
(DERIVATI DEI RADICALI LIBERI) NEL PLASMA E NEL SIERO
Principio
I radicali liberi dell’ossigeno sono atomi singoli o raggruppati, uno dei quali,
almeno, appartiene all’ossigeno e possiede uno o più elettroni spaiati in uno dei
suoi orbitali più esterni.
A causa della loro estrema reattività, i radicali liberi tendono a reagire
praticamente con qualsiasi molecola organica vengono a contatto, generando,
così, derivati o metaboliti reattivi dell’ossigeno (reactive oxygen metabolites,
ROM). Questi ultimi, pur dotati di un discreto potere ossidante, sono
relativamente più stabili dei radicali che li hanno generati e, pertanto, possono
essere quantificati.
Nel d-ROMs test, i ROM (principalmente gli idroperossidi, ROOH),
contenuti nel campione biologico da analizzare, in presenza di ferro (liberato
dalle proteine plasmatiche da un tampone acido, il reagente R2 del kit),
generano, per la reazione di Fenton, radicali alcossilici (R−O*) e perossilici (R−
OO*) che, reagendo con un’ammina aromatica sostituita (A−NH2, contenuta in
una miscela cromogena, il reagente R1 del kit), ossidano quest’ultima
trasformandola in un derivato colorato in rosa ([A−NH2*]+), secondo le reazioni:
1A) R−OOH + Fe2+→ R−O* + Fe3+ + OH1B) R−O* + A−NH2 → R−O- + [A−NH2*]+
Per i radicali alcossilici
2A) R−OOH + Fe3+→ R−OO* + Fe2+ + H+
2B) R−OO* + A−NH2 → R−OO- + [A−NH2*]+
Per i radicali perossilici
Tale derivato, infine, viene quantificato fotometricamente. Infatti, l’intensità
del colore sviluppato sarà direttamente proporzionale alla concentrazione dei
ROM, in accordo con la legge di Lambert-Beer.
Composizione e modalità di conservazione del kit
Reagente R1
Reagente R2
Calibratore
Miscela cromogena (ammina aromatica sostituita)
Tampone acetato (pH 4.8), conservanti e stabilizzanti
Siero Liofilo
Confezioni disponibili
CODICE
MC 006
MC 001
MC 002
MC 003
Reagente R1
1 x 0.5 mL
1 x 0.5 mL
1 x 1 mL
1 x 2 mL
Reagente R2
1 x 25 mL
1 x 50 mL
2 x 50 mL
4 x 50 mL
Calibratore
1 x 1 mL
1 x 1 mL
1 x 1 mL
1 x 1 mL
I reagenti vanno conservati a 2 - 8 °C e al riparo dalla luce diretta. In
queste condizioni essi rimangono stabili fino alla data di scadenza riportata sulla
confezione.
Campione
Il test può essere effettuato sia su siero che su plasma eparinato. Non
usare plasma−citratato o plasma−EDTA.
Preparazione del calibratore
Aprire il flaconcino contenente il calibratore con le dovute precauzioni,
evitando qualsiasi perdita del contenuto. Aggiungere, quindi, 1 mL di acqua
distillata. Riporre il tappo di gomma sul flaconcino e agitare delicatamente,
evitando di fare schiuma, per consentire al liofilizzato di sciogliersi
completamente e correttamente. Lasciare riposare per 15 minuti e, quindi,
capovolgere il flaconcino un paio di volte. Prima dell’ uso assicurarsi che tutto il
siero liofilo si sia disciolto.
Condizioni di lavoro e modalità di analisi
Lunghezza d'onda
Cammino ottico
Temperatura
Modalità
505 (500 – 510) nm
Cinetica
1 cm
25 – 30 – 37 °C
o 546 (540 – 550) nm
End-point
In ciascuna seduta analitica, dopo aver portato i reagenti alla temperatura
di lavoro, bisogna preparare sempre un bianco reagente e uno calibratore (o
calibratore) a titolo noto. La concentrazione del calibratore é riportata nella sua
etichetta.
Nella procedura cinetica si procede secondo lo schema:
Reagente R2
Reagente R1
H2O distillata
Calibratore
Campione
Bianco reagente
1 mL
10 µL
10 µL
−
−
Calibratore
1 mL
10 µL
−
10 µL
−
Campione
1 mL
10 µL
−
−
10 µL
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente e lasciate ad
incubare a 37°C per 1 minuto. Terminata l’incubazione, esse vanno sottoposte a
lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a 505 nm o 546 nm sia
immediatamente che successivamente, nelle stesse condizioni di lavoro (37°C),
dopo 1, 2 e 3 min. Ai valori di assorbanza ottenuti per lo calibratore e per il
campione bisogna sottrarre, quindi, il valore di assorbanza del bianco reagente.
Diacron srl
Via Zircone, 8 – 58100 Grosseto
Tel. 0564 467064
I risultati del test saranno espressi in Unità Carratelli (U CARR) applicando la
seguente formula:
U CARR = (∆Abs/min) x F
dove:
•
(∆Abs/min) sono le differenze medie dei valori di assorbanza misurati a 1,
2, 3 e 3 minuti;
F è un fattore di correzione con un valore predeterminato calcolato
utilizzando il siero di controllo a titolo noto (valore indicativo a 37 °C: 9000).
Nella procedura end-point si procede secondo lo schema:
Bianco reagente
Calibratore
Campione
Reagente R2
1 mL
1 mL
1 mL
Reagente R1
10 µL
10 µL
10 µL
H2O distillata
5 µL
−
−
Calibratore
−
5 µL
−
Campione
−
−
5 µL
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente e lasciate ad
incubare a 37°C per 90 minuti. Appena terminata l’incubazione, esse vanno
sottoposte a lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a 505 nm o a 546 nm.
Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per lo calibratore bisogna
sottrarre, quindi, il valore di assorbanza del bianco reagente (“azzeramento con
bianco reagente”). Anche in questo caso, i risultati del test saranno espressi in U
CARR, applicando la seguente formula:
Abs campione
U CARR
=
x
[calibratore]
Abs calibratore
dove:
•
•
(Abs campione) e (Abs standard) sono i valori di assorbanza misurati (per
il campione e per lo calibratore, rispettivamente);
[calibratore] è la concentrazione dello calibratore.
1 U CARR = 0.08 mg H2O2/dL
Il metodo è lineare fino a 500 U CARR
Nota: in ambedue i procedimenti, è possibile operare con una miscela di lavoro
preparata mescolando il reagente R1 con il reagente R2 nel rapporto di 1:100 e
utilizzando il campione come starter. Tale miscela è stabile per circa 12 ore se
conservata a 2 − 8°C, al riparo dalla luce.
Interpretazione dei risultati
Il valore di riferimento del test, determinato su un campione di circa 5.000
soggetti sani, è compreso fra 250 e 300 U CARR (corrispondenti all’intervallo
compreso fra 20.00 e 24.00 mg H 2O2/dL), indipendentemente dal sesso e
dall’età. Tuttavia, i neonati presentano valori sensibilmente più bassi, le gravide
più alti. E’ consigliabile, comunque, che ogni laboratorio determini i propri valori
di riferimento. Valori superiori a 300 U CARR configurano, dopo una fascia
border-line (301 − 320 U CARR), livelli progressivamente crescenti di stress
ossidativo, come indicato in tabella:
ROM
ROM
Stress ossidativo
(U CARR)
(mg H2O2/dL)
(gravità)
Condizione border-line
300 − 320
24.08 − 25.60
Stress ossidativo lieve
321 − 340
25.68 − 27.20
Stress ossidativo medio
341 − 400
27.28 − 32.00
Stress ossidativo elevato
401 − 500
32.08 − 40.00
> 500
> 40.00
Stress ossidativo elevatissimo
Range normale: 250 – 300 U CARR (pari a 20.08 − 24.00 mg H2O2/dL)
Valori inferiori a 250 U CARR possono osservarsi in atleti oppure in corso
di trattamento corticosteroideo o antiossidante.
Stabilità del calibratore
Il calibratore liofilizzato è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla
confezione se conservato a +2 / +8 °C.
Una volta ricostituito, il siero é stabile per circa 10 giorni se conservato a
+2/+8 °C o per 10 mesi se congelato a −20 °C.
Se il prodotto deve essere congelato, si consiglia di suddividerlo in piccole
aliquote, prima di procedere al congelamento. Quando necessario, scongelare
una piccola aliquota e mescolarla capovolgendola più volte con delicatezza.
Dopo essere stata scongelata, ciascuna aliquota di siero ricostituito può essere
usata una sola volta.
Bibliografia essenziale
Cornelli U, et al. Intern. Union of Angiology’s Bulletin. 1999. 15: 7-10.
Cesarone MR, et al. International Angiology. 1999. 18 (2): 127-130.
Alberti A, et al. Res Chem Intermed. 2000. 26 (3): 253-67.
Trotti R., et al. 2001. Haematologica. 86: 85-91.
Gerardi GM, et al. Clin Chem Lab Med. 2002. 40 (2): 104-110.
d-Roms Rev 3
d-ROM s
Test
COD. MC 006
1 x 25 mL
COD. MC 001
1 x 50 mL
COD. MC 002
2 x 50 mL
COD. MC 003
4 x 50 mL
Patent: DIACRON INTERNATIONAL S.a.S. Grosseto (Italy)
COLORIMETRIC DETERMINATION OF REACTIVE OXYGEN METABOLITES
(FREE RADICALS–DERIVED COMPOUNDS) IN BLOOD PLASMA AND SERUM
Principle
Free radicals of oxygen are either single or grouped atoms, one of which,
at least, belongs to the oxygen and it possesses one or more “unpaired”
electrons in its/their external orbital(s).
Because their greatest reactivity, practically free radicals have the potential
to “attack” any organic molecule, thus generating a class of compounds which
are called Reactive Oxygen Metabolites (ROMs). Despite their fair oxidant
power, ROMs are relatively more stable compared to their “parent” free radicals
and, therefore, they can be adequately detected and quantified.
In the d-ROMs test, ROMs (hydroperoxides, ROOH, primarily) of a
biological sample, in presence of iron (that is released from plasma proteins by
an acidic buffer, the R2 reagent of kit), are able to generate alkoxyl (R−O*) and
peroxyl (R−OO*) radicals, according to the Fenton’s reaction. Such radicals, in
turn, are able to oxidize an alkyl-substituted aromatic amine (A−NH2, that is
solubilized in a chromogenic mixture, the R1 reagent of kit) thus transforming
them in a pink-colored derivative ([A−NH2*]+), according to the reactions:
1A) R−OOH + Fe2+→ R−O* + Fe3+ + OH1B) R−O* + A−NH2 → R−O- + [A−NH2*]+
For alkoxyl radicals
2A) R−OOH + Fe3+→ R−OO* + Fe2+ + H+
2B) R−OO* + A−NH2 → R−OO- + [A−NH2*]+
For peroxyl radicals
Finally, this colored-derivative is photometrically quantified. Indeed, the
intensity of developed colour is directly proportional to the concentration of
ROMs, according to the Lambert-Beer’s law.
Components list and storage modalities of kit
R1 reagent
R2 reagent
Calibrator
Chromogenic mixture (aromatic alkyl-amine)
Acetate buffer (pH 4.8), preservatives and stabilizers
Lyophilized serum
Available packaging
CODE
MC 006
MC 001
MC 002
MC 003
R1 reagent
1 x 0.5 mL
1 x 0.5 mL
1 x 1 mL
1 x 2 mL
R2 reagent
1 x 25 mL
1 x 50 mL
2 x 50 mL
4 x 50 mL
Calibrator
1 x 1 mL
1 x 1 mL
1 x 1 mL
1 x 1 mL
All the reagents must be stored at 2 – 8 °C. In such conditions, if kept away
from direct sunlight, they remain stable until the expiry date found on the
packaging.
Sample
d-ROMs test can be carried out either on blood (heparinized) plasma or
serum. Do not use neither citrate−plasma nor EDTA–plasma.
Calibrator Preparation
Open the control serum vial carefully avoiding any loss off material. Then
reconstitute with 1 mL of freshly distilled water. Replace the rubber stopper vial
and shake gently, avoiding any foam, to allow the complete and correct
dissolution. Leave to stand for 15 minutes and then invert the vial twice.
Before the use, make sure that all traces of dry material are dissolved.
Work conditions and procedure
Wavelenght
Optical path
Temperature
Mode
505 (500 − 510) nm
Kinetics
1 cm
25 – 30 – 37 °C
End-point
o 546 (540 − 550) nm
Before carrying out the test, when the reagents are at working temperature,
a blank reagent and a calibrator (or calibrator) with assigned value should be
prepared for each series of assays. This value is reported in the sticker on the
control serum vial.
According to the kinetic mode, the following procedure should be
performed:
Reagent blank
Calibrator
Sample
R2 reagent
1 mL
1 mL
1 mL
R1 reagent
10 µL
10 µL
10 µL
Distilled H2O
10 µL
−
−
Calibrator
−
10 µL
−
Sample
−
−
10 µL
All the solutions should be delicately mixed and after 1 min of incubation at
37 °C they can undergo photometric reading, by measuring their absorbance (at
505 nm or 546 nm) immediately and after 1, 2 and 3 min, in the same operating
conditions (37 °C). Afterwards, the absorbance value of reagent blank must be
subtracted from that of the calibrator and the samples.
Finally, the results of d-ROMs test will be expressed as Carratelli Units
(CARR U), according to the following formula:
CARR U = (∆Abs/min) x F
where:
•
•
(∆Abs/min) are the mean differences of the absorbances recorded at 1, 2,
and 3 min;
F is a correction factor with an assigned value – approximately 9000 at 37
°C (according to the results obtained with the calibrator).
According to the end-point mode, the following procedure should be
performed:
Reagent blank
Calibrator
Sample
R2 reagent
1 mL
1 mL
1 mL
R1 reagent
10 µL
10 µL
10 µL
Distilled H2O
5 µL
−
−
Calibrator
−
5 µL
−
Sample
−
−
5 µL
All the solutions should be delicately mixed and after 90 min of incubation
at 37 °C they must undergo immediately photometric reading, by measuring their
absorbance (at 505 nm or 546 nm), in the same operating conditions (37 °C).
Afterwards, the absorbance value of reagent blank must be subtracted from that
of the calibrator and the samples (“zero adjustment with the reagent blank”).
The results of d-ROMs test will be expressed as Carratelli Units (CARR U),
according to the following formula:
Abs sample
CARR U
=
X
[calibrator]
Abs calibrator
where:
•
Abs sample and Abs calibrator are the measured absorbance values (for
the sample and the calibrator, respectively);
•
[calibrator ] is the concentration of calibrator.
1 CARR U = 0.08 mg H2O2/dL
The method is linear up to 500 CARR U
Note. In both the procedures, it is possible to operate with a “working solution”
obtained by mixing R1 reagent with R2 reagent (according a ratio of 1:100).
Therefore, the sample can be used as “starter”. Such working solution is stable
up to 12 hours, if stored at 2 − 8°C and protected from direct sunlight.
Interpretation of results
Reference values of d-ROMs test, as calculated on a sample of
approximately 5.000 apparently healthy subjects, are between 250 and 300
CARR U (i. e. between 20.00 and 24.00 mg H2O2/dL), independently on gender
and age. However, newborns exhibits very low values while pregnant women
have more high values. In any case, every laboratory should determine its own
reference value. Values higher than 300 CARR U indicate, after a border-line
bracket (301 − 320 CARR U), progressively increasing levels of oxidative stress:
ROMs
ROMs
Oxidative stress
(CARR U)
(mg H2O2/dL)
(severity)
Border-line range
300− 320
24.08 − 25.60
Low level oxidative stress
321− 340
25.68 − 27.20
Middle level of oxidative stress
341− 400
27.28 − 32.00
High level of oxidative stress
401− 500
32.08 − 40.00
> 500
> 40.00
Very high level of oxidative stress
Normal range: 250 – 300 CARR U (i. e. 20.08 – 24.00 mg H2O2/dL)
Lower than 250 CARR U values can be observed either in athletes or
during corticosteroid or antioxidant therapy.
Calibrator Stability
The lyophilized control serum is stable up to the expiry date when stored at
+2 / +8 °C. The expiry date is illustrated on the side of each pack.
Once reconstituted the components of the serum are stable up to 10 days if
stored at + 2 / + 8 °C or up to 10 months if frozen at −20 °C.
If the product has to be frozen, we suggest to split up them in small
aliquots, before proceeding to the freezing. When necessary, defrost a small
aliquot and mix them delicately by inversion before using. Once defrosted, each
aliquot of reconstituted serum can be used only one time.
References
Cornelli U, et al. Intern. Union of Angiology’s Bulletin. 1999. 15: 7-10.
Cesarone MR, et al. International Angiology. 1999. 18 (2): 127-130.
Alberti A, et al. Res Chem Intermed. 2000. 26 (3): 253-67.
Trotti R., et al. 2001. Haematologica. 86: 85-91.
Gerardi GM, et al. Clin Chem Lab Med. 2002. 40 (2): 104-110.