Bersellini Emanuela

UNITA’ DI RICERCA POLITECNICA DELLE MARCHE
Direttore Scientifico: Prof. Giorgio Tosi
L’analisi vibrazionale è divenuta una tecnica molto versatile e adatta allo studio dei materiali in
svariati campi della chimica, della biologia e dell’ingegneria. Negli ultimi anni l’analisi
vibrazionale è stata molto usata nello studio di proprietà funzionali di campioni biomedici e di
biomolecole, dove possono essere identificati i diversi componenti molecolari e la loro
distribuzione in una matrice. In questo contesto la microspettroscopia FTIR Imaging permette, nei
settori biomedico e dei biomateriali, di sviluppare nuovi metodi di acquisizione delle immagini per
lo studio delle caratteristiche composizionali, strutturali e morfologiche di svariati sistemi, primi fra
tutti quelli biologici. Mediante tale tecnica e con l’ausilio di opportuni algoritmi, possono essere
valutati numerosi parametri quali la natura molecolare, la quantità relativa, la distribuzione dei vari
componenti. Ci si avvale di spettrometri a sorgente convenzionale, multidetectors o a luce di
sincrotrone con risoluzione spaziale fino al limite di diffrazione. Di grande utilità, per una rapida
acquisizione di dati spettrali, risulta il Focal Plane Detector (FPA) detector.
Il trattamento dati per l’analisi multivariata e per procedure di analisi delle bande (deconvoluzione,
curve-fitting, ecc.) viene effettuato mediante pacchetti software tra cui: Spectrum 5.0 (Perkin
Elmer), Pirouette 4.0 (Infometrix Corp.), Cytospec, CytoSpec IR imaging (www.cytospec.com),
Opus 5.5 (Bruker Corp.) e Grams AI (Galactic Corp.)
Microspettroscopia FT-IR imaging su cellule e tessuti umani.
(collaborazione con il: Dipartimento Scienze della Vita e dell'Ambiente, Università Politecnica
delle Marche, Ancona; Dipartimento Scienze Biomediche e Sanita' Pubblica, Università Politecnica
delle Marche, Ancona; Dipartimento Medicina Sperimentale e Clinica, Università Politecnica delle
Marche, Ancona; Dipartmento of Scienze Biomorfologiche and Funzionali, Università Federico II
di Napoli; SISSI Beamline, Elettra Synchrotron Light Laboratory, Trieste).)
Abbiamo continuato lo studio FTIR di patologie della cavità orale nonché di altri compartimenti del
corpo umanO. Le caratteristiche vibrazionali di campioni derivanti da operazioni chirurgiche sono
state sfruttate per ottenere informazioni a livello molecolare e supramolecolare da affiancare ai dati
provenienti dai più comuni mezzi diagnostici. Infatti, tramite le variazioni biochimiche e
morfologiche che i tessuti subiscono durante la formazione di neoplasie, è stato possibile
distinguere nei vari campioni zone sane da zone tumorali. I risultati sono stati comparati con dati
istopatologici evidenziando una più che soddisfacente attendibilità.
Si sono caratterizzati alcuni spectral markers, come i modi vibrazionali dei fosfati e del glicogeno,
che permettono di valutare e verificare, nelle loro relazioni numeriche, la progressione ed il grado di
tumorigeneità delle patologie della bocca (Figura 1).
Figura 1. Andamento dei rapporti υsym/υasymPO2- e υC-O/υsymPO2-, nei tessuti sani
(connettivo, C e muscolare, M), nelle displasie leggere e severe (mCMd, sCMd) e nelle forme
tumorali tumori dei vari settori della cavità orale. Il valori maggiormente differenziati si ottengono
nel caso di linfonodi metastatici.
Procedimenti di analisi multivariata di trattamento dei dati spettrali, hanno permesso di di
distinguere queste diverse patologie (Figura 2).
Figura 2. Epiteli tumorali di campioni da: SCC (epit. non tumorale di controllo, SCC indiff. e epit.
displastico), ghiandole salivari (tum. muco-secernente e carcinoma adenoideo cistico) e cisti
odontogene (fibroma ameloblastico, ameloblastoma unicistico, ciste residua, ciste radicolare e
KCOT).
La figura 3a riporta la clusterizzazione di aree epiteliali: di controllo (non tumorale), di grado 1, di
grado 2, caratterizzato dalla presenza di perle cornee ed un epitelio indifferenziato di grado 3. La
netta suddivisione dei campioni in 4 clusters ben distinti viene confermata anche dall’analisi
bidimensionale (Figura 3b).
Grado 1
Grado 3
Controll
o
Grado 2
Figura 3a
Figura 3b
Sempre nel distretto della cavità orale, l’indagine spettroscopica ha permesso di verificare la
progressione e l’infiltrazione del tumore nei comparti connettivali.
Figura 4. Clusterizzazione di zone connettivali derivanti dagli SCC e dalle ghiandole salivari:
carcinoma adenoideo cestico (cluster blu), SCC indiff. (cluster verde), tumore muco-secernente
(cluster rosso), SCC displastico (cluster arancione) ed epitelio di controllo (cluster celeste).
Si è continuato lo studio vibrazionale di lesioni cutanee benigne (nevo dermico, nevo di Reed),
displastiche e maligne (melanomi invasivi) e contemporaneamente, con l’utilizzo di una risoluzione
spaziale al limite della diffrazione (6.35x6.25μm2), si iniziato lo studio di nevi ‘border line’ come
quelli Spitz o nevi a penetrazione anomala e che presentano notevoli difficoltà a livello di analisi
clinica.
Caratterizzazione tramite marker spettrali delle gonadi di Zebrafish durante la fase di
maturazione
(collaborazione con il Dipartimento Scienze della Vita e dell'Ambiente, Università Politecnica delle
Marche, Ancona;).
Nello studio del ruolo della melatonina nella crescita e nella maturazione di ovociti femmine di
zebrafish, la spettroscopia FTIR imaging ha ben evidenziato modifiche biochimiche nella
oonogenesi di femmine trattare con melatonina, in grado di influire sul pattern proteico, sulla
composizione della membrana e sulle caratteristiche di gruppi fosfato. Tramite le analisi Real TimePCR e l’Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) , si è dimostrato che la somministrazione
di questo ormone favorisce la sintesi della vitellogenina in zebrafish femmine, promuovendo quindi
il relativo aumento dell’indice gonadosomatico (GSI) e della produzione dell’embrione.
Applicazione della Microspettroscopia Infrarossa per la caratterizzazione di biomateriali e di
biomolecole.
(collaborazione con il gruppo del prof. Norberto Roveri della UNIBO)
Particolarmente utile si è rivelata l’applicazione dell’imaging infrarosso nello studio ed utilizzo di
materiali sintetici per operazioni di ricostruzione ossea e per evidenziare il fatto che tessuti
artificiali possono mimare il tessuto osseo da sostituire, per studiare processi di biomineralizzazione
con possibilità di individuare la formazione di idrossiapatiti su bio-vetri nonché per delucidare le
varie fasi di ricostruzione di tessuti ossei danneggiati. E’ stato messo a punto un nuovo metodo per
la sintesi di materiali nano strutturati a base di compositi collagene/idrossiapatite su leghe di titanio,
combinando l’elettrospinning con la mineralizzazione biomimetica. Gli scaffolds mineralizzati
esibiscono caratteristiche morfologiche, strutturali e chimiche molto simili a quelle di una matrice
extracellulare dell’osso naturale. Oltre che con la microscopia elettronica, la distribuzione
topografica della composizione chimica nella matrice mineralizzata, è stata studiata con la
microspettroscopia FTIR, evidenziando come, nel processo di elettrospinnig, i nano cristalli di
idrossiapatite ricoprono parzialmente le fibre di collagene (Figura 5, 6).
Figura 5. Spettri FT-IR del collagene (rosso) e del composito collagene-idrossiapatite (nero) nella
regione 1800-700 cm-1.
Figura 6. Mappe di correlazione ottenute caricando lo spettro del collagene nelle mappe chimiche
da elettrospun del collagene puro (A) e del collagene mineralizzato (B), e (C) mappa di correlazione
ottenuta caricando lo spettro del composito collagene-idrossiapatite sulla mappa chimica del
collagene mineralizzato.
Dall’analisi spettroscopica si è anche dedotto che la distribuzione di gruppi funzionali di materiali a
base di collagene, come i gruppi carbonilici, hanno un ruolo cruciale nel processo di
mineralizzazione in vitro. Ne deriva che, nanocompositi fibrosi potrebbero trovare applicazioni
come materiali di rivestimento di dispositivi medicali a base di titanio o come fillers per compositi
rinforzati da fibre migliorarando il contatto e l’interazione dell’impianto osseo con l’intorno
biologico.