fluorochrome conjugated single reagent

Monoclonal Mouse Anti-Human CD41, Platelet Glycoprotein llb, Clone 5B12
Codice N. F 7088 FITC-Conjugated
Codice N. R 7058 RPE-Conjugated
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
F7088 e R7058 sono finalizzati per l’uso nella citometria a flusso. CD41 è un marcatore selettivo delle piastrine
e dei precursori delle piastrine, gli anticorpi anti-CD41, pertanto possono essere utili per
l’immunofenotipizzazione delle leucemie megacarioblastiche e per l’identificazione della tromboastenia di
Glanzmann (1). L’interpretazione dei risultati deve essere effettuata da patologi qualificati, nel contesto
dell'anamnesi clinica del paziente e di altri test diagnostici.
Sinonimi per l’antigene
Glicoproteina llb (GPllb), integrina ll(1).
Introduzione
CD41 è la sottounità  del complesso CD41/CD61 (GPllb-llla), un eterodimero calcio-dipendente, associato
non covalentemente. CD41 è una molecola di 135 kDa, formata da due peptidi: una catena  129 dKa ed una
catena  23 kDa. La catena  e quella  sono collegate da un singolo legame disolfuro. La catena contiene
quattro siti di legame del calcio ed è completamente extracellulare, mentre la catena  possiede domini
extracellulari, di transmembrana e citoplasmatici (1).
Il complesso CD41/CD61 compare precocemente durante la maturazione dei megacariociti (2). Il complesso
CD41/CD61 attivato è un recettore del fattore di von Willebrand, del fibrinogeno solubile e della fibronectina (1)
e ricopre un ruolo fondamentale nell'attivazione e nell’aggregazione delle piastrine (1, 3).
L’espressione di CD41 si evidenzia in gradi variabili nelle leucemie megacarioblastiche/citiche (4), mentre è
assente o ridotta nelle piastrine di pazienti affetti da tromboastenia di Glanzmann (5).
Reagenti forniti
Gli anti-CD41 coniugati, C 7088 e R 7058 sono stati prodotti da anticorpi monoclonali di topo purificati. I
coniugati vengono forniti in forma liquida in tampone contenente 1% di albumina serica di bovino (BSA) e 15
mmol/L NaN3 , pH 7,2. Ogni fiala contiene 100 test (10 L di coniugato per max. 106 piastrine dl sangue
periferico normale).
Isotipo: IgG1, kappa. Concentrazione coniugata mg/L: vedi etichetta della fiala.
Controllo negativo
Anticorpo
codice no.
Fluorocromo
F 7088
FITC (isotiocianato di fluorescina isomero 1)
X 0927
R 7058
RPE (R-ficoeritrina)
X 0928
codice no.
Immunogeno
Piastrine umane normali.
Specificità
L’anti-CD41, 5B12 è stato trattato durante il Fifth Workshop and Conference on Human Leucocyte
Differentiation Antigens (Boston 1993) e studi effettuati da diversi laboratori ne hanno confermato la reattività
con CD41. Erroneamente il clone è stato catalogato come SB12 (6).
Precauzioni
1. Per operatori specializzati.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle
concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma la sodio azide potrebbe reagire con
le tubature in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Per lo smaltimento del prodotto è
consigliabile sciacquare abbondantemente per prevenire la formazione di azidi metalliche nelle tubature.
3. Come per ogni prodotto di derivazione biologica, utilizzare procedure di manipolazione adeguate.
Conservazione
Procedura di colorazione
Conservare al buio a 2-8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti
vengono conservati in condizioni diverse da quelle specificate, queste dovranno essere verificate dall’utente.
Non esistono segni evidenti che indichino l'instabilità del prodotto. Per questo motivo, i campioni del paziente
devono essere sottoposti simultaneamente sia a controlli positivi che negativi. Se si dovesse osservare una
colorazione non attribuibile a modifiche delle procedure di laboratorio e se si sospetta un problema relativo agli
anticorpi, contattare il servizio tecnico.
1.
Raccogliere sangue venoso in una provetta contenente EDTA come anticoagulante.
2.
Entro 5 minuti, centrifugare a 200 x g per 5 minuti, a temperatura ambiente.
3.
Raccogliere 100 L del plasma superiore ricco di piastrine (sufficiente per 20 test) e miscelarlo con 1 mL
di paraformaldeide 1% in 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. Incubare a 4 C per ½-1 ora.
4.
Centrifugare a 1200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare delicatamente il surnatante ed
eliminarlo, conservando approssimativamente 50 L di fluido.
5.
Aggiungere 2 mL 0,01 mol/L PBS, pH 7,4 e risospendere le piastrine, utilizzando un miscelatore a
vortice.
6.
Centrifugare a 1200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare delicatamente il surnatante ed
eliminarlo, conservando approssimativamente 50 L di fluido.
(104237-002)
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark
F 7088/ R 7058/IT/MBH/01.07.02 p 1/2
·
Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
7.
Aggiungere 1 mL 2% di siero di feto bovino in 0,01 mol/L PBS e risospendere le piastrine utilizzando un
miscelatore a vortice.
8.
Miscelare 50 L di sospensione piastrinica con 10 L di anti-CD41 coniugato con fluorocromo.
9.
Utilizzare un anticorpo monoclonale non reattivo dello stesso isotipo, coniugato con lo stesso fluorocromo,
come controllo negativo (vedi tabella).
10. Incubare al buio a 4 °C per 20 minuti.
11. Lavare due volte con PBS contenente 2% di BSA. Risospendere le piastrine in un fluido appropriato per la
citometria a flusso, p.e. 0,3 mL di paraformaldeide (fissativo) al 1% in 0,01 mol/L PBS, pH 7,4.
12. Analizzare con un citometro a flusso.
Per il controllo del reagente e della preparazione, si raccomanda di includere un idoneo campione di controllo
positivo e negativo in ogni prova. Occorre ricordare che i coniugati con fluorocromi sono sensibili alla luce e che
pertanto i campioni devono essere protetti dalla luce durante la procedura di colorazione, fino all'analisi.
Riferimenti bibliografici
1.
Sun QH, Newman PJ. CD guide. CD41. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM,
Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens.
Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New
York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 1139.
2.
Vinci G, Tabilio A, Deschamps JF, van Haeke D, Henri A, Guichard J, et al. Immunological study of in
vitro maturation of human megakaryocytes. Br J Haematol 1984;56:589-605.
3.
Nachman RL, Leung LLK. Complex formation of platelet membrane glycoproteins IIb and IIIa with
fibrinogen. J Clin Invest 1982;69:263-9.
4.
Breton-Gorius J, Tabilio A, Vainchenker W, Vinci G, van Haeke D, Henri A, et al. Diagnosis of
megakaryoblastic leukemias. Verh Dtsch Ges Path 1983;67:166-81.
5.
George JN, Caen JP, Nurden AT. Glanzmann's thrombasthenia: the spectrum of clinical disease
(review). Blood 1990;75:1383-95.
6.
Honda S, Felding-Habermann B, Loftus J, Annis D, Kunicki TJ. CD41/CD61 cluster workshop report:
localization of epitopes on integrins IIb 3(CD41/CD61) and v 3(CD51/CD61). In: Schlossman SF,
Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell
differentiation antigens. Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7;
Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. p. 1293-8.
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Dispositivo medico-diagnostico
in vitro
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