immunopatologia 1

Proteine del plasma
• Sintetizzate dal fegato come pre-proteine
– Eccetto immunoglobuline e ormoni
– Convertite in proteine attive dagli enzimi proteolitici
del plasma
• Tutte glicoproteine
– Eccetto albumina
• Ogni proteina ha un emivita (t1/2) caratteristica
– I livelli plasmatici di alcune proteine aumentano
negli stati infiammatori (acute phase protein)
1
Albumina
• Maggior proteina del plasma (50% del totale)e
maggior responsabile della pressione oncotica
(80%)
• trasportatore non selettivo di acidi grassi, Ca++,
ormoni tiroidei, bilirubina e alcuni farmaci
• Turnover: 14-15 g/giorno, t1/2=20 giorni, il livello
dipende dallo stato nutrizionale e dalla
funzionalità epatica
2
Cause di ipoalbuminemia:
Diminuzione della sintesi (malnutrizione,
malassorbimento, malattie epatiche)
Ipo- e analbuminemia: rari
Aumento del volume plasmatico (idratazione,
aumento della permeabilità capillare)
Aumento di escrezione o degradazione
(sindrome nefrotica, enteropatie, emorragie, stati
catabolici (sepsi, febbre, traumi, tumori)
Cause di Iperalbuminemia:
Infezioni croniche, TBC, disfunzioni corteccia
surrenale
Rheumatoid Arthritis, Systemic Lupus,
Scleroderma
Ipersensibilità
Disidratazione
Emolisi
Alcolismo
Rapporto albumina/globuline
(A/G)
• Il fegato può funzionare adeguatamente anche al 20% della
sua capacità
• Il rapporto A/G può essere un “early marker” di disfunzioni
epatiche
• A/G normale: 2:1
• Se <1.7,
– Sovraproduzione di globuline (mieloma multiplo,
autoimmunità)
– Sottoproduzione di albumina (cirrosi epatica)
– Perdita di albumina (sindromi nefrotiche)
• Se >3.5,
4
– Ipogammaglobulinemia (leucemie, deficit genetici)
α1-antitripsina o inibitore delle
tripsine del siero
• Inibitore delle proteasi (elastasi)
• L’eccesso di elastasi causa distruzione del
tessuto polmonare (enfisema)
• Acute phase protein
• Livelli bassi:
– Fumo (rompe un gruppo -S-S-)
– Deficienza congenita (malattia autosomica
recessiva, frequenza 1:3000)
•5 Livelli alti: Stati infiammatori acuti
Proteina C-reattiva: acute phase protein
• Sintetizzata in fegato, 5 subunità (PM 130 KDa)
– Media la rimozione di polisaccaridi, fosfolipidi,
polianioni e attiva il complemento
• In soggetti sani, <1 mg/L
• Marker di infezione batterica
• Livelli superiori a 5 mg/L in assenza di infezioni
batteriche: marker di infiammazione cronica
– Rischio cardiovascolare, infiammazione intestinale,
diabete tipo II e rottura delle membrane durante la
gravidanza
6
Altre proteine del plasma
• α1-glicoproteina: Prodotta da tessuti
tumorali
• α1-fetoproteina: Per diagnosi prenatale di
malformazioni e tumori alla prostata
• α 2-macroglobulina: Inibitore di proteasi
• Immunoglobuline
8
Elettroforesi
• Molecole con carica netta positiva →
catodo (-)
• Molecole con carica netta negativa →
anodo (+)
• La mobilità elettroforetica dipende da:
– Intensità del campo elettrico
– Coefficiente frizionale (dimensione e carica
della particella)
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Elettroforesi delle proteine del siero
• Siero, non plasma, per eliminare
l’interferenza del fibrinogeno
• Separazione delle proteine in base alla loro
carica
10
Diagnosi
differenziale
11
Factors Affecting the Sedimentation Rate
Elevating the ESR:
Inflammatory Diseases
Cytokine driven processes that elevate fibrinogen ie TB, Pneumonia, rheumatoid
arthritis
• Relative/Absolute Increase in Globulin Proteins
Loss of albumin ie nephrotic syndrome or increase in globulins ie multiple
myeloma
• Extensive Tissue Necrosis
Myocardial infarction, trauma, tumors
• Other Causes
Pregnancy (increase in fibrinogen, anemia), anemia, age, heparinized blood
•
Lowering the ESR:
• Increased Plasma Viscosity
Waldenstrom's macroglobulinemia
• Red Cell Number or Shape
Polycythemia vera, sickle cell disease
• Decreased Plasma Proteins
Hepatic necrosis, hypofibrinogenemia
• Others Causes
Trichinosis
• Range - The range of normal SRE is 0-15 mm/hr for men and 0-20
mm/hr for women. Many articles have detailed the elevation of the
ESR with age and some have suggested the formula of age divided by
2 for men and age plus 10 divided by 2 for women although this has
not been universally adopted.
• Utility - Although still widely used, the sedimentation rate has limited
use as a diagnostic test. It is useful for predicting prognosis in diseases
such as rheumatoid arthritis and Hodgkin's disease and it has utility as
a marker of treatment efficacy in many diseases such as rheumatoid
arthritis, the vasculitides, collagen vascular diseases, and septic
arthritis.
PRINCIPALI MALATTIE AUTOIMMUNI
SISTEMICHE
INTERMEDIE
ORGANO-SPECIFICHE
LES
S. GOODPASTURE
T. HASHIMOTO
AR
LUPUS DISCOIDE
SCLERODERMIA
D. MIOSITE
CONNETTIVITE
MISTA
ADDISON IDIOPATICO
UVEITE FACOGENICA
CIRROSI B. PRIM.
GASTRITE ATROFICA
OFTALMIA SIMPATICA
DIABETE GIOVANILE
SCLEROSI MULTIPLA
IFERTILITA' MASCH.
M. DI SJOGREN
MIASTENIA GRAVE
S. PLURIENDOCRINE
AUTOIMMUNI
COLITE ULCEROSA
ANEMIA PERNICIOSA
Lupus eritematoso sistematico
Appare
Appare nelle
nelle donne
donne tra
tra 13
13 ee 40
40 anni.
anni. Rapporto
Rapporto maschiomaschiofemmina
femmina 1:10
1:10
Caratterizzato
Caratterizzato da
da febbre,
febbre, debolezza,
debolezza, artriti,
artriti, disfunsioni
disfunsioni
renali
renali
II pazienti
pazienti producono
producono autoanticorpi
autoanticorpi verso
verso ilil DNA,
DNA, istoni,
istoni,
eritrociti,
eritrociti, piastrine,
piastrine, leucociti,
leucociti, ee fattori
fattori di
di coagulazione
coagulazione
del
del sangue
sangue
Gli
Gli immunocomplessi
immunocomplessi depositati
depositati lungo
lungo le
le pareti
pareti dei
dei vasi
vasi
sanguigni
sanguigni causano
causano una
una ipersensibilità
ipersensibilità di
di tipo
tipo III,
III,
originano
originano danno
danno endoteliale
endoteliale che
che da
da luogo
luogo alle
alle reazioni
reazioni
infiammatorie
infiammatorie che
che generano
generano vasculuiti
vasculuiti ee
glomerulonefriti
glomerulonefriti
Esami di Routine e Lupus
Incremento della VES e dei livelli di PCR
Emocromo:Anemia (Sintomo Costante)
Leucopenia (Linfocitopenia)
Trombocitopenia
Alterazioni della coagulazione (Lupus Anticoagulante)
Esame Urine:
Albuminuria (Microalbuminuria)
Ematuria
Esami specifici: Gli anticorpi anti nucleo
Allo stato attuale la dimostrazione della
positività della ricerca di autoanticorpi antinucleo (ANA) o la presenza di anticorpi
anti-dsDNA o anti-Sm (uno degli antigeni
nucleari estraibili, ENA) costituiscono 2
degli 11 criteri utilizzati da anni per la
diagnosi di lupus eritematoso sistemico
In generale il protocollo diagnostico
iniziale, in pazienti sintomatici prevede
la rilevazione degli anticorpi antinucleo in IFI; il pattern di fluorescenza
nucleare o citoplasmatico determina la
scelta successiva, rappresentata dalla
ricerca di autoanticorpi diretti verso
uno o più specifici autoantigeni
intracellulari
UV light
Autoimmunity
Determinazione degli ANA: Tecnica IFI
Standardizzata con linee cellulari epiteliali (HEp
- 2)
(esprimono antigeni umani presenti in tutte le fasi del ciclo cellulare)
Ai fini diagnostici I titoli di 1:40 e di 1:160 sono considerati
come livelli decisionali: Titolo soglia 1:40 (alta sensibilità/bassa
specificità)
<1:40 negativo. (Anticorpi antinucleo a basso titolo 1:40 - 1:80 possono essere
presenti in soggetti sani, nelle gravide, in donne sopra i 40 anni, negli anziani)
>1:40 e <1:160 basso positivo (in assenza di sintomi specifici, il protocollo
diagnostico deve prevedere un monitoraggio in tempi successivi)
>/=1:160 sono da considerare comunque suggestivi di patologia
autoimmune.
Pattern omogeneo
Fluorescenza omogeneamente
diffusa a tutto il nucleo con
colorazione dei cromosomi
delle cellule in mitosi. Gli Ab
sono diretti contro
desossiribonucleoproteine,
istoni, dsDNA.
Pattern periferico
Forte fluorescenza alla
periferia del nucleo debole al
centro. Dovuta alla presenza di
autoanticorpi diretti contro
ds DNA o contro
desossiribonucleoproteine
Pattern speckled
Caratterizzato da fluorescenza dei
nuclei finemente (fine speckled) o
grossolanamente (course
speckled) granulari, con
cromosomi delle cellule in mitosi
negativi.
Il pattern fine speckled è generato
dalla presenza di anticopi antiSSA/SSB,
Il pattern course speckled è
generato dalla presenza di
anticorpi anti-Sm/U1-RNP
Pattern Nucleolare
• Quadro fluoroscopico:
Fluorescenza limitata ai
nucleoli ,mitosi negative
• Associazione
anticorpale:
possibile Scl-70, Pm-Scl,
complessi ribonucleoproteici
• Patologie associate:
Sclerodermia, sindrome
overloap
polimiosite/dermatomiosite
Limitazioni di quest’approccio:
OCCORRE IDENTIFICARE GLI ANTIGENI VERSO CUI
GLI ANTICORPI SONO RIVOLTI
Non univocità della modalità di refertazione
Dipendenza dell’affidabilità del dato dall’esperienza del
microscopista
Difficoltà di reperimento di sieri standard di riferimento
Gli anticorpi anti-DNA
Test EIA
DNA a singola elica (denaturato, ssDNA; determinanti
antigenici: zone ricche di G
-
Ce A
- T)
DNA nativo a doppia elica (dsDNA, epitopi localizzati
lungo lo scheletro glico
- fosfato)
Metodica IFI (Crithidia luciliae),
DNA nativo a doppia elica
Gli anticorpi anti- ssDNA non hanno una buona associazione
con precisi quadri patologici. Gli anticorpi anti- dsDNA sono
altamente specifici per il LES (10° criterio diagnostico del LES)
IL test IFI viene utilizzato anche per la valutazione degli
anticorpi anti ds DNA questo test si fonda su una reazione a
carico del DNA mitocondriale a doppia elica contenuto nel
cinetoplasto di un emoflagellato non patogeno per l’uomo
(Crithidia luciliae)
Negativo
Positivo
Protocolli diagnostici in alcune malattie Autoimmuni
LUPUS
•ANA
Pattern omogeneo o
periferico ad alto titolo
•Anti dsDNA
Positivo
•ENA
anti- Sm(altri inutili)
•AnticorpiAntifosfolipidi
Incostantemente presenti
e lupus Anticoagulante
Protocolli diagnostici di base in alcune malattie Autoimmuni
Sindrome di Sjogren
•IgG
•ANA
Incremento policlonale
20% dei casi negativi
80% dei casi positivi
80% granulare
20% omogeneo
Raramente Nucleolare
•Anti dsDNA
(Inutili)
•ENA
80% Ssa/Ro
70% SSb/La
Protocolli diagnostici di base in alcune malattie Autoimmuni
Polimiosite/Dermatomiosite
VES
Molto Elevata
Emocromo
Lieve anemia, Eosinofilia
ANA
Pattern granulare
Anti dsDNA
(Inutili)
ENA
15% dei casi positivo Jo1
CPK, LDH
Generalmente aumentate
Fattore Reumatoide
30% dei casi positivo
Antiphospholipid antibodies:
•
Can be present in 30% 0f SLE patients.
•
Antibodies directed against phosphorylated
polysaccharide esters of fatty acids
•
Include: lupus anticoagulant, β2-glycoprotein-I,
anti-prothrombin Abs, and anticardiolipin Ab.
•
False positive VDRL can be seen in 50% of
patients
•
aPL production can also be associated with:
Medications
Infections
Neoplasms (lymphoma)
ANCA
Anti-Neutrophil Cytoplasmic
Antibodies
ANCA:
• Abs directed against several proteins in
cytoplasm of neutrophils in sera of patients
with different Vascular Autoimmune disease
and Systemic Autoimmune Disease .
• Measured by indirect immunofluorescence.
• ELISA is used to detect specific Abs to
proteinase-3 , and myeloperoxidase (MPO)
ANCA Patterns:
1. Cytoplasmic ANCA (C-ANCA):
anti-proteinase -3
2. Perinuclear ANCA (p-ANCA):
anti- myeloperoxidase (MPO), but also
elastase and other proteins in the neutrophil
granules
3. Atypical Patterns:
Ab to elastase, cathepsin G, lactoferrin, etc.
Gli ANCA: patologie associate
Sono considerati i principali markers sierologici specifici delle vasculiti e
delle malattie infiammatorie croniche,con un’incidenza dell’85-90% nelle
prime e 20-70% nelle seconde ;
Vasculite : infiammazione e
necrosi dei vasi con conseguente
modificazione del lume vasale ed
alterazioni ischemiche dei tessuti
irrorati;
quella maggiormente
rappresentata è il Morbo di Wegener.
Malattie infiammatorie croniche
intestinali (MICI):
con questo termine si indicano :
- Rettocolice ulcerosa:
infiammazione del colon;
- Morbo di Crohn : distruzione
continua della parete
dell’intestino,specialmente
a carico del tenue.
Classificazione
p-ANCA o ANCA perinucleari : reagiscono principalmente
con la mieloperossidasi (MPO) presente nei granuli αazzurrofili, dando una fluorescenza di tipo perinucleare ;
c-ANCA o ANCA citoplasmatici : diretti contro la
proteinasi3 (PR3), dando una fluorescenza finemente
granulare e diffusa per il citoplasma ;
x-ANCA o ANCA atipici :
- danno una fluorescenza sia citoplasmatica che nucleare
- si osservano nei soggetti affetti da MICI,ma hanno una
sensibilità sconosciuta e una specificità bassa.
Rheumatoid Arthritis
Laboratory Testing, Principals and
Guidelines
Rheumatoid Factor (RF)
Introduction:
• RF is an antibody directed against the FC
portion of IgG.
• RF was originally described by Waaler and
Rose in 1940
• The RF measured in laboratories is IgM
RF, but IgG & IgA RF have been
described.
Conditions Associated with
Positive RF:
I.
Healthy Individuals:
RF can be positive in up to 4% of young
and healthy individuals.
RF positivity is higher in elderly people
without rheumatic diseases (ranging from
3-25% in different studies).
RF titer in this setting is usually < 1:160
Conditions Associated with
Positive RF: …cont.
II. Rheumatic Disorders:
Rheumatoid Arthritis:
Sjogren’s syndrome:
SLE:
*
26-90%*
75-95%
15-35%
Polymyositis/Dermatomyositis:
5-10%
Variable in different studies, depending on
severity of disease in the study population
Non-Rheumatic Diseases
associated with Positive RF
Anti-Cyclic Citrullinated Peptide:
• Target amino acid is citrulline, in filaggrin
molecule derived from human skin.
• Citrulline is a post-translationally modified
arginine residue.
• ELISA assay for anti-CCP may be useful in
early stages of polyarthritis. [1]
Anti-CCP
IgM RF
RF & anti-CCP
Sensitivity
56%
73%
48%
[1] Bas et al. Rheumatoloy (Oxford) 2003; 62: 870
Specificity
90%
82%
96%
Profilaggrina: una proteina consistente di 10 –12
Epidermide
unità di filaggrina ripetute, separate da linker di peptidi
fosforilati
Defosforilazione proteolitica
Filaggrina: basica/neutra
proteina associata a filamenti intermedi
Citrullinazione per mezzo di
peptidyl arginine deiminase (PADI)
Corneificazione
Arginine
Citrulline
Filaggrina citrullinata
Only Anti-CCP has the desirable diagnostic
credentials of high sensitivity, specificity and
commercial availability
• Anti-CCP antibodies are a very specific diagnostic marker for
RA and are present in >30-80% of RA sera.
• Anti-CCP antibodies are present very early in disease.
• High titres of anti-CCP appear to be prognostic of erosive
disease
• Anti-CCP antibodies are present in a high percentage of
patients who are negative for RF
• Anti-CCP can assist in the diagnosis of RA from other
connective tissue diseases
Serum Electrophoresis
• Gel electrophoresis shows an increase in
the globulins especially gamma
(antibodies) and alpha-2-globulin
• There is often a decrease in albumin (7)
Complete Blood Count (CBC)
• WBC in the peripheral blood often
remained undisturbed
• RBC’s show a moderate normocytic
hypochromic anemia of chronic disease
• A decrease in serum iron is common,
Total Iron Binding Capacity (TIBC) and
normal iron stores (ferritin) are essentially
normal
Creatinine Kinase (CK)
• Serum CK is decreased below normal in
>60% of RA patients. This is not to be
confused with the CKMB (Myocardial)
portion or CKMM (skeletal muscle)
enzymes that are often measured during a
MI or chronic muscular diseases (7)
Synovial Biopsy
• Synovial fluid has high WBC and low
viscosity, glucose is greatly diminished in
the synovium
• RF usually present
• Characteristic rheumatoid nodules to aide
in diagnosis
• Positive biopsy of subcutaneous
rheumatoid nodule and synovia
American Rheumatism
Association Diagnosis Criteria
Positive biopsy within diagnostic
guidelines: criteria consists of:
– Poor mucin clotting of synovial fluid (4)
– Characteristic histological changes in
synovium: mesothelial, macrophage, LE
cells
Testing non-indicative of RA
• Other routine serological quantitative testing is
normal. This group includes Calcium, Uric Acid,
Alkaline Phosphorus, Phosphorus, and
Antistreptolysin O titers
ANA: If the ANA is positive, the laboratory automatically performs
Extractable Nuclear Antigens (ENA) and Double Stranded DNA
Antibody (dsDNA) tests.
If the ANA is negative, one may still request the Autoimmune Screen
Panel II (Advanced) depending on the working diagnosis.
Once the ANA has tested positive there is no diagnostic benefit in
repeating this test.
Please remember that an ANA may also be positive in up to 5% of
normal young females and decisions to proceed with further testing
should always take into account overall clinical and laboratory
features.
Rheumatoid Factor (RF): This test can be used alone or along
with other diagnostic tests to identify specific
autoimmune/rheumatologic or even infectious and malignant
diseases.
The test identifies the presence of a RF (an antibody {G,A,or M})
directed specifically against the CH2/3 domain of IgG.
The titre may be relevant in some but not all conditions for
disease monitoring (eg infections such as Tb), but a positive
test is significant.
Serum electrophor
Autoimmune Screen Panel II C3, C4, CH50: These tests
Coombs (direct): If an
autoimmune/rheumatologic disease is
suspected to be causing hemolytic
anemia this test can check whether
antibodies are indeed bound to red
blood cells. This would indicate an
autoimmune condition as the cause of
the RBC destruction.
SPEP (Serum protein electrophoresis):
This test is used to monitor albumin
and globulin protein levels in a patient’s
blood. If an autoimmune/rheumatologic
disease is affecting these levels, the
test results may be out of the reference
range. Lower albumin levels may reflect
chronic illness, elevated acute phase
reactants infection or inflammation,
elevated gammaglobulins inflammation
and if a spike present, possible
gammopathy.
measure the levels of
complement proteins in a
patient’s blood. The C4(classical
pathway) and C3 (alternate) are
static measures of the serum
levels of these proteins, whereas
the CH50 is a functional assay
that correlates with the
complement cascade activity. If
the measured values are not
within the reference range, this
may be indicative of an
autoimmune/rheumatologic
disease with immune complex
deposition.
aPTT: This test is used to
measure how well the patient’s
blood is clotting. It may be
prolonged in association with
autoimmune/rheumatologic
disease and coagulopathies.
Crystal Screen Panel
Serum Iron, TIBC: These tests are ordered together to test for iron
levels and saturation in the patient’s blood. Serum iron tests the
amount of iron in the patient’s serum while TIBC tests how much
iron the patient’s transferrin plasma proteins can bind. An elevated
serum iron and increased saturation will be seen in
Hemochromatosis, which can be a cause of CPPD arthopathy
(pseudogout).
Serum Uric Acid: This test is used to detect the level of uric acid in the
patient’s blood. High levels of uric acid can lead to monosodium urate
crystal build up in joints which causes gout.
Ca, Phos, Mg: These tests measure the amount of these minerals in the
patient’s blood. Several crystal arthropathies may be associated with
abnormal levels of these minerals.