1 ¿ Que concentracion de agarosa se debe usar en la preparacion

Domande più frequenti
sull’agarosio FAQ
1. Di quali fattori devo tener conto al momento di scegliere il tipo di agarosio?
Ci sono numerosi tipi di agarosio che si possono utilizzare. La scelta dell’agarosio determina la qualità del risultato finale.
Quando si sceglie un agarosio bisogna tener conto della dimensione dei frammenti che si vogliono separare, l’utilizzo che
si deve fare se un gel preparativo o analitico e l’applicazione successiva del materiale che si deve separare.
2. Che concentrazione di agarosio si deve usare per la preparazione di un gel?
La concentrazione di agarosio più comunemente utilizzata per separare acidi nucleici è tra lo 0.5% - 4% (anche lo 0.3% se si
utilizza l’agarosio D5).
In ogni caso la concentrazione più appropriata dipende dal tipo di agarosio e dalla misura dei frammenti che si vogliono
separare. Come regola generale bisogna tener conto che, una maggiore concentrazione consente di separare frammenti di
minore dimensione.
3. Si possono usare indifferentemente i tamponi TAE o TBE per la preparazione dei gel e
successivamente per l’elettroforesi?
I due tamponi sono simili e si possono utilizzare con qualsiasi tipo di agarosio, ma bisogna tener conto che possiedono
caratteristiche diverse che li rendono adatti alle diverse applicazioni.
Il tampone TAE ha una bassa forza ionica e una bassa capacità tamponante e questo lo rende adatto nella ricircolazione del
tampone per le lunghe corse elettroforetiche
Il tampone TBE invece, possiede un’alta forza ionica ed un’alta capacità tamponante che permette di lavorare senza
ricircolazione nelle lunghe corse. E’ raccomandato per la separazione di piccoli frammenti con piccole differenze di misure
tra di loro.
4. Quale tipo di tampone si deve utilizzare nell’elettroforesi analitica?
Entrambi i tamponi sono adatti, TAE (1X) e TBE (1X o 0.5X) e si possono utilizzare in modo diverso. Bisogna però tener
conto che il tampone TBE ha una minore mobilità e dà una migliore risoluzione di frammenti < 1kb, invece per la
separazione di frammenti >10kb, si ottengono migliori risultati con il tampone TAE.
5. È importante lavorare con la ricircolazione del tampone durante le lunghe corse
elettroforetiche?
Si consiglia di utilizzare il tampone TAE nel caso di gel preparativo e si vuole recuperare il DNA per essere utilizzato
successivamente in altre applicazioni.
Si sconsiglia l’utilizzo del tampone TBE in quanto la presenza del boro tra i componenti del tampone, interagisce con i
gruppi idrossili del polisaccaride, rendendo così difficile il recupero del DNA
6. È importante lavorare con la ricircolazione del tampone durante le lunghe corse
elettroforetiche?
Utilizzando il tampone TAE, che ha una bassa capacità tamponante, la ricircolazione evita la formazione di gradiente di pH
e l’esaurimento del tampone.
7. A che voltaggio si deve effettuare una corsa di gel di agarosio?
Per l’elettroforesi orizzontale il voltaggio raccomandato è di 4-10 volt/cm (distanza tra l’anodo e il catodo non la
longitudine del gel)
Quando il voltaggio è troppo basso la mobilità delle bande si riduce. A causa della diffusione le bande si espandono.
Quando invece il voltaggio è troppo alto, a causa del surriscaldamento diminuisce la risoluzione.
8. Delle volte le bande appaiono ondulate in alcune linee, quale può essere la causa?
La causa più frequente è la presenza di gel secco rimasto attaccato al pettine. Onde evitare questo problema si
raccomanda di pulire bene il pettine ed eliminare eventuali residui. E’ importante ritrarre delicatamente il pettine, si
raccomanda inoltre di tenere il gel alla temperatura di 4°C per 30 minuti o di immergerlo nel tampone prima di ritrarre il
pettine.
9. Che quantità di DNA si deve caricare in ciascun pozzetto?
Questa quantità è molto variabile. La quantità minima di DNA che può essere osservata mediante colorazione con
bromuro di etidio è di 10 ng. La quantità massima di DNA che può avere una banda che sia chiara e ben definita è
approssimativamente di 100 ng.
Queste quantità comunque possono variare a seconda del colorante che si utilizza. Per essere sicuri che la quantità sia
adeguata si possono caricare le singole linee con quantità differenti.
10. Come si deve preparare il gel per ottenere per ottenere una migliore risoluzione?
Lo spessore del gel è molto importante, noi raccomandiamo uno spessore di circa 3-4 mm. Anche lo spessore del pettine è
importante perché può influire sulla risoluzione. Con un pettine fine (1 mm) si ottengono bande ben definite, invece con
un pettine più grosso anche le bande saranno più spesse e si otterrà una risoluzione inferiore.
11. Quale metodo di dissoluzione viene raccomandato?
Qualunque metodo va bene. Il metodo più comodo e rapido è la dissoluzione nel forno a microonde.
Per le alte concentrazioni e, quando la dissoluzione è più difficile a causa della viscosità e della formazione di schiuma, è
preferibile utilizzare lo scioglimento a bagno maria.
Lo scioglimento in autoclave è invece raccomandato in caso di concentrazioni elevate e quando si vuole ottenere una
soluzione sterile.
12. Come si può evitare la formazione di schiuma durante la dissoluzione?
Si raccomanda, prima del riscaldamento, di idratare la polvere di agarosio nel tampone per 10-15 minuti. Questa
operazione riduce la formazione di schiuma e facilita la dissoluzione.