CARNITINA libera plasmatica in Fluorimetria

CARNITINA libera plasmatica in Fluorimetria - Cod. Z13010
INTRODUZIONE
La L-Carnitina (β-Hydroxy-γ-trimethylammonium butyrate) è una molecola importante che gioca un
ruolo fondamentale nel trasporto di acidi grassi organici a catena lunga attraverso la membrana
mitocondriale.
Il trattamento terapeutico con L-carnitina è indicato nelle forme di carenza primarie e secondarie.
La Acetil-L-Carnitina rappresenta la forma più semplice tra le carnitine eterificate.
La L-Carnitina permette il trasporto degli acidi grassi a catena lunga dal citosol cellulare ai
mitocondri, ove il processo continua attraverso la β-ossidazione degli acidi grassi, il ciclo di Krebs
e la fosforilazione ossidativa fino alla produzione di ATP (AdenosilTrifosfato).
I livelli di L-Carnitina libera e della somma dei suoi acil-derivati presenti nel nostro organismo
possono essere determinati attraverso il prelevamento di campioni di plasma, urine e tessuti.
Il presente metodo consente di analizzare i livelli plasmatici di L-Carnitina base (Free), tramite
l’ausilio di un derivatizzante specifico e separazione HPLC con lettura in Fluorimetria.
EUREKA srl – LAB DIVISION
VAT N° 01547310423
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60033 Chiaravalle (AN) ITALY
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Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La
dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta.
Release N° 008
Carnitina plasmatica in Fluorimetria
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Febbraio 2010
CARATTERISTICHE DEL METODO
Principio del metodo :
Il presente metodo consente di determinare la Carnitina libera dopo derivatizzazione e lettura in Fluorimetria.
Recupero del Metodo :
> 95%
Sensibilità del Metodo :
circa 0,1 nmol/ml
Valori di normalità nel plasma:
0-5 anni
6-15 anni
15-45 anni
Contenuto della Confezione :
Tutti i reagenti sono pronti all’uso e stabili 3 anni a
Temperatura ambiente, tranne lo Starter, le cui
modalità di conservazione sono riportate più in
basso.
28 – 38 nmol/ml
38 – 48 nmol/ml
48 – 56 nmol/ml
Reagente A – Soluzione Deproteinizzante, 1 x 50 ml
Reagente B – Soluzione Diluente, 1 x 60 ml
Reagente C – Soluzione di Condizionamento N°1, 1 x 100 ml
Reagente D – Soluzione di Condizionamento N°2, 1 x 100 ml
Reagente E – Soluzione di Condizionamento N°3, 1 x 115 ml
Reagente F – Soluzione di Lavaggio, 1 x 100 ml
Reagente G – Soluzione Eluente, 1 x 100 ml
Reagente H – Soluzione Derivatizzante, 1 x 10 ml
Reagente I – Soluzione Starter, 11 x 160 mg
(fornito a parte in un bauletto con ghiaccio secco)
CONSERVARE a –20 °C. Stabile 5 giorni a 2-8 °C.
Da ricostituire con 1 ml di Reagente E-Sol.di
Condizionamento N° 3. Stabile 2 giorni a –20 °C
una volta ricostituito.
Reagente L – Soluzione Tampone, 1 x 20 ml
Reagente N – Soluzione Test/Std chimico, 1 x 10 ml
Vedere Avvertenze
Stoccare a 2-8 °C
Reagente M – Fase Mobile, 2 x 500 ml
Colonne Clean-up, 100 pz
Dotazione strumentale minima richiesta :
Strumento HPLC isocratico con loop da 100 µl
Detector fluorimetrico λex = 248 nm, λem = 418 nm
Registratore di cromatogrammi
Dotazione opzionale :
Autocampionatore
Computer gestionale
Modalità di prelievo :
Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta con
Eparina come anticoagulante. Centrifugare a 4000
rpm per 5 minuti. Separare il plasma e stoccarlo a –
20 °C. Stabile 4 settimane.
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PROCEDURA PREANALITICA :
Preparazione della Soluzione Test 100 nmol/ml:
Pipettare in una provetta:
•
•
900 µl di Acqua grado HPLC
100 µl di Reagente N – Sol. Test
Questa è la Soluzione Test 100 nmol/ml
Dispensare in provette di tipo eppendorf :
•
•
100 µl di Soluzione Test 100 nmol/ml appena preparata
500 µl di Reagente A – Soluzione Deproteinizzante
Deproteinizzare direttamente sul vortex per 10 secondi
Dispensare in sequenza in provette di vetro con tappo a vite:
•
•
•
•
600 µl di Reagente B – Soluzione Diluente
200 µl di Calibratore surnatante
100 µl di Reagente H – Soluzione Derivatizzante
100 µl di Reagente I – Soluzione Starter (dopo ricostituzione)
•
Incubare a 40 °C per 30 minuti
Raffreddare
•
Diluire 1 a 10 con Acqua di grado HPLC
INIEZIONE:
•
Iniettare 100 µl della Soluzione Test preparata nel sistema cromatografico per identificare il tempo di
ritenzione della Carnitina che deve essere simile a quello riportato in Fig. 1. Se il Test ha dato esito
positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del
sistema analitico.
PROCEDURA ANALITICA :
FASE 1 : Preparazione dello Standard chimico e del Campione
Diluire il calibratore (o usarlo tal quale) in funzione della concentrazione desiderata per costruire la
curva di calibrazione o per ottenere dei controlli.
Dispensare in provette tipo eppendorf :
•
•
100 µl di Plasma o Calibratore o Controlli
500 µl di Reagente A – Soluzione Deproteinizzante
Deproteinizzare direttamente sul vortex per 10 secondi
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FASE 2: Derivatizzazione dei Campioni
Dispensare in sequenza in provette di vetro con tappo a vite:
Standard chimico
Campione
600 µl
200 µl
600 µl
Reagente B – Sol. Diluente
Reagente N – Sol. Test/Std chimico surnatante
Campione surnatante
Reagente H – Sol. Derivatizzante
Reagente I – Sol. Starter
•
100 µl
100 µl
200 µl
100 µl
100 µl
Incubare a 40 °C per 30 minuti
N.B.: il derivatizzato è stabile 3 giorni a 2-8 °C
Raffreddare
FASE 3 : Aggiungere ai campioni 200 µl di Reagente L – Soluzione Tampone
Al vortex per 10 secondi
FASE 4: Condizionamento delle Colonne di Clean-up
Pipettare in sequenza nelle Colonne di Clean-up:
•
•
•
1,0 ml di Reagente C – Condizionamento N°1 e gettare il liquido percolato.
1,0 ml di Reagente D – Condizionamento N°2 e gettare il liquido percolato.
1,0 ml di Reagente E – Condizionamento N°3 e gettare il liquido percolato.
Non portare a secco!
Non portare a secco!
Non portare a secco!
FASE 5 : Caricare nelle colonne di Clean-up i campioni derivatizzati e diluiti (1200 µl) preparati nella FASE 3
FASE 6: Pipettare nelle colonne di Clean-up 1 ml di Reagente F – Soluzione di Lavaggio
Gettare il liquido percolato e portare a secco con un leggero flusso d’aria!
FASE 7: Pipettare nelle colonne di Clean-up 1 ml di Reagente G – Soluzione Eluente e portare a secco.
Raccogliere l’eluato.
Al Vortex per 10 secondi
FASE 8: Diluire l’eluato 1 a 10 con Acqua di grado HPLC.
N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 °C
INIEZIONE:
•
Iniettare 100 µl della soluzione nel Cromatografo e attendere la stampa del cromatogramma.
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CARNITINA PLASMATICA- Avvertenze
REAGENTE N: SOLUZIONE TEST/STANDARD CHIMICO
Carnitina
1000 nmol/ml
PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO 363 – VARIAN
λEx
λEm
SENSIBILITA’
248 nm
418 nm
Medium
PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA
Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ,
tassativo l’uso del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005.
è
CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA
Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS C18 3 x 150 mm, 5 µm.
Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H2O : Acetonitrile ( 50 : 50 v/v )
e successivamente 30 ml di H2O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di
lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i
primi 30 ml. E’ possibile effettuare analisi a ricircolo di fase.
Se la T Amb del Laboratorio è > 20 °C si consiglia di conservare a 2-8 °C la Fase Mobile fra una
seduta analitica e l’altra.
PULIZIA DELLA COLONNA
Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H2O e scaricare. Flussare una soluzione di H2O :
Acetonitrile ( 50 : 50 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo
far passare 30 ml di H2O prima di condizionarla con la Fase Mobile.
PARAMETRI HPLC
LOOP
Flusso di lavoro consigliato
Pressione corrispondente
100 µl
1,2 ml/minuto
Circa 100 bar
PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE
SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE
ACCESSORI E CONSUMABILI
CODICE
DESCRIZIONE
CONFEZIONE
Z13020
Standard chimico per Carnitina
ZFM15960E
Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um)
ZA6005
Metasaver Precolumn Filter 0.5 um
1 x 10 PZ
S29057U
Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite
1 x 100 PZ
5
2 x 5 ml
1 PZ
Carnitina plasmatica in Fluorimetria
( Cromatogrammi di Riferimento )
Fig. 1 Soluzione test
R.T. 9.36 Carnitina
Fig. 2 Calibratore
R.T. 9.27 Carnitina
10 nm/ml
6
100 nmol/ml
Carnitina plasmatica in Fluorimetria
( Cromatogrammi di Riferimento )
Fig. 3 Controllo
R.T. 9.28 Carnitina
Fig. 4 Campione plasmatico
R.T. 9.26 Carnitina
81 nmol/ml
50 nmol/ml
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